Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Авторы благодарят Ной Дитто и Адам Мили за техническую помощь на IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Публикация плата за это видео-статьи были оплачены Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Наше исследование сравнения головы к голове показывает, что каждая биосенсора платформа имеет свои сильные и слабые стороны. Несмотря на то, связывающие профили антител подобны путем визуального сравнения (Рисунки 3 - 6), и ранг порядок полученных констант кинетических скоростей весьма последовательно через инструментов (рисунок 7), полученные нами результаты показывают , что ППР на основе приборов с непрерывная струйная потока) лучше при разрешении высокой аффинности взаимодействий с низкой скоростью диссоциации. Восходящий дрейф во время фазы диссоциации наблюдается в наборах данных (например, МАт 2, мАт 5, и мАт 9; Рисунок 5) , порожденный BLI гидросистемы свободного инструментом. Этот вывод может быть связан в значительной степени испарения образца с течением времени в микропланшете, который является основным ограничением системы. С помощью этого присущего ограничения, экспериментальное время также ограничено до менее чем 12 ч; Поэтому эксперименты были запрограммированы с шorter раз (500 сек ассоциации и диссоциации 30 мин) по сравнению с теми из других платформ (10 мин ассоциации и диссоциации 45 мин). Тем не менее, сокращение экспериментального времени не появлялось , чтобы смягчить влияние испарения на качестве данных / консистенции, так как константы скорости , генерируемые Л на основе прибора , показывают меньшую линейность в результате флуктуаций в некоторых из отходящих ставок (фиг.8С ). В дополнении к испарению образца, различие в используемых реагентах, используемых захвата может также способствовало различиям в полученных результатах. В то время как белок A / G использовали во все три гидросистеме на основе SPR платформы, датчики AHC были использованы в не-гидросистеме BLI платформе. Так как белок A / G, вероятно, имеют более слабое сродство к мАт, чем делает ПВК, антитело на основе биосенсора поверхность, отходящие темпы мАт-антиген комплекса от белка A / G поверхностей может искусственно появляться быстрее, чем те, получено от поверхности AHC. Эта возможность поддерживается бу экспериментальные данные , показывающие , что значения вне скорости , генерируемые платформой BLI были последовательно ниже , чем полученные от других инструментов (рисунок 7, красная линия). Тем не менее, BLI платформа имеет различные преимущества по сравнению с другими платформами. Например, она обладает высокой гибкостью в отношении выбора датчика и конфигурацию анализа из-за различные предварительно покрытые датчиками для немедленного использования. В наших экспериментах, использование датчиков AHC устраняет необходимость шагов лиганда иммобилизации, сокращая время приготовления. Кроме того, платформа ЛА требует гораздо меньшее техническое обслуживания по сравнению с другими струйной SPR платформ, которые отличают сложную насосно-компрессорную и переключатель значения конфигурации. Эта функция является преимуществом для экспериментов с сырой образцы, которые могут вызвать проблемы засорения и загрязнения. Поскольку спрос на эффективное, быстрое и точное выявление терапевтических кандидатов возрастает, потребность в биosensor пропускная способность также растет. Среди четыре биосенсора платформ, пропускная способность от биосенсора, способного 96-лиганда печати массива является самым высоким, с последующим биосенсором, соединенным с пересекающим 36-лигандом формата и Л на основе биосенсора с 16-канальным синхронным считыванием, которая в конечном счете увеличить число взаимодействий, измеренных в одном цикле связывания до 96, 36 и 16, соответственно. Эти возможности пропускная способность значительно выше, чем у традиционной SPR платформы, которая ограничена наличием только четыре ячейки потока, соединенные один последовательный поток. Поскольку наши эксперименты включали относительно небольшой набор образцов из 10 моноклональных антител оценивали в нескольких поверхностных плотностей с большим временем диссоциации, инструментальные пропускные способности играет умеренную роль в определении эффективности экспериментов. Там не было никаких существенных различий в экспериментальных времен трех высокопроизводительных платформ, а также во всех случаях опыты были проведены в один день, С другой стороны, традиционные эксперименты SPR последовательного потока требуется 3 дня, чтобы закончить, несмотря на блуждания одноразовая автоматизации сбора данных после установки в. В других исследованиях, включающие большое количество образцов (например , в сотнях или тысячах), для ранжирования от скорости / Кинетическая скрининга или эпитоп биннинговых целей, пропускная способность становится критическим фактором. Хотя пропускная способность в IBIS MX96 на несколько порядков выше, чем у других биосенсоров и поэтому является оптимальным выбором для этих целей, он имеет несколько недостатков. В частности, печать массива с помощью CFM показывает большие поверхностные несоответствия (рисунок 1) и снижение воспроизводимости данных (рис 8D и 8E). Для получения точных кинетических измерений, количество лиганда на поверхности биосенсора является критическим параметром, который необходимо контролировать, чтобы гарантировать, что связывание ответы не нарушается вторичными факторами, такие какмассоперенос или пространственное затруднение. Для Biacore T100 и Proteon XPR36, уровни оптимальной R L были определены на основе стандартного расчета значений макс множество R , как описано в статье 17 исследований. С другой стороны, для платформ Октета RED384 и ИБИС MX96, уровни захвата монАТа были достигнуты эмпирический с использованием ряда 2-кратно серийно разведенными антител при постоянном время. Отсутствие знаний или контроля стадии захвата привело к поверхности с высокой плотностью и высокими сигналами связывания отклика (рисунок 2) , что , возможно, скомпрометированных точностью констант кинетических скоростей. Кроме того, разделение принтера от детектора SPR также представляет собой проблему при проведении нескольких измерений связывания цикла с участием перерождения. Единственный способ выполнить настройку кинетики мульти-цикла путем прямое аминное сочетание из мАта, в отличие от захвата через монАТ Fc с иммобилизованным белком A / Gповерхность в трех других платформах биосенсора. В результате дополнительный эксперимент регенерации разведки требовалось, чтобы определить оптимальные условия регенерации. Исход этой установки был связан с ~ 90% меньше наблюдаемой поверхностной активностью по сравнению с методом захвата Fc (рисунок 9), в дополнении к уже времени эксперимента. Для того, чтобы выполнить метод захвата Fc, был принят кинетический подход Альтернативы однотактного. Этот подход включает в себя последовательное введение анализируемого вещества при увеличении концентраций без регенерации между каждой инъекции (рисунок 2). Это очень удобно, но менее часто применяется подход не только сократил время эксперимента и снижение расхода реагента, но и получает константы кинетической скорости весьма сходные с теми из других биосенсоров (рисунок 7). Поэтому, применяя эту кинетику однотактного подход преодолевает присущее конфигурации ограничение прибора и представляет собойвозможность для получения констант с высокой разрешающей способностью кинетических скоростей в высокой пропускной образом. Несмотря на пропускной способности является основным ограничением в Biacore T100, наши результаты в совокупности показывают, что она породила наиболее последовательные данные с высоким качеством. Это сопровождалось Proteon XPR36, который имеет ~ 10 раз выше пропускной способности. Их способность генерировать высококачественные данные становится преимуществом при характеристике высоким сродством антитело-антиген взаимодействий, которые могут быть технически сложной задачей при достижении пределов обнаружения инструментов. В то время как систематические ограничения в измерительных приборах октет RED384 препятствуют точному измерению констант диссоциации скорости (т.е. далеко от чувствительности разрешить достаточное затухание сигнала для медленного офф-ставка), как Biacore T100 и Proteon XPR36 может обеспечить чувствительным и надежным обнаружения для дифференцировки.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Этикетка свободной оптические биосенсоры являются мощными инструментами в разработке лекарств для характеристики молекулярно-биологических взаимодействий. В этом исследовании мы описали использование четырех обычно используемых платформ биосенсора в нашей лаборатории, чтобы оценить сродство связывания и кинетику десять с высоким сродством моноклональных антител (мАт) против человеческого пропротеина конвертазы субтилизина Kexin типа 9 (PCSK9). В то время как Biacore T100 и Proteon XPR36 получены из хорошо установлено поверхностного плазмонного резонанса технологии (ППР), бывший имеет четыре ячейки потока, соединенные конфигурации последовательного потока, тогда как последние подарки 36 реакционные пятна параллельно через импровизированного 6 х 6 крест-накрест микрожидкостных конфигурации канала. ИБИС MX96 также работает на основе SPR сенсорной технологии, с дополнительной функцией формирования изображения, которая обеспечивает обнаружение в пространственной ориентации. Этот метод обнаружения в сочетании с непрерывным потоком Microspotter (CFM) расширяет пропускную способность значительно по электронной почтеnabling мультиплексной печать массива и обнаружение 96 реакционных видов спорта одновременно. В противоположности этому, Октет RED384 основан на бислой интерферометрия (Л) оптический принцип, с волоконно-оптических датчиками, действующими в качестве биосенсора для обнаружения интерференционной картины изменений при связывании взаимодействий на поверхности наконечника. В отличии от SPR, основанных на платформы, система BLI не зависит от непрерывных потоков струйных; вместо этого, кончики датчиков собирают показания в то время как они погружены в растворы аналита микропланшет-384 скважины в процессе орбитального перемешивания. Каждая из этих биосенсоров платформ имеет свои преимущества и недостатки. Для того, чтобы обеспечить непосредственное сравнение способности данных инструментов для обеспечения качества кинетических данных, описанные протоколы иллюстрируют эксперименты, которые используют один и тот же формат анализ и те же высококачественные реагенты характеризовать антитело-антиген кинетики, которые соответствуют простой модели 1: 1 взаимодействия молекул ,

На рисунке 1 показано изображение массива антитела из CFM и пятнистых уровней моноклональных антител , с помощью двух методов иммобилизации, а на рисунок 2 показаны соответствующие обязательные сенсограммы , генерируемые в MX96 от мульти-цикла кинетических и кинетических измерения Однотактных на этих моноклональные антителах , массивы , Связывание и кинетический подогнанные кривые из нескольких поверхностей покрытых антител , генерируемых в четыре биосенсоре платформ в режиме реальное время показано на рисунках 3 - 6. На фиг.7 показано сравнение конечных кинетических скоростей и равновесных констант связывания , полученных из глобального анализа этих кривых связывания. Отдельные ассоциации (к а), диссоциации (K d), и равновесие (KD) константы связывания представлены в таблице 1. Для того, чтобы продемонстрировать изменчивость наборов данных, генерируемых в рамках одного инструмента, <stRong&gt; На рисунке 8 представлены графики K A, K D и K D при различных плотностях мАта поверхности, и фиг.9 дополнительно сравнивает вычисленную связывающую деятельность поверхностей моноклональных антител , биосенсор платформ. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Рисунок 1. Мультиплекс Лиганд Массивы аминной связи (А) и Fc-захвачены (B) антитела поверхностей от CFM печати в IBIS MX96. Изображения печатных массивов показаны в левой панели, где серые зоны , окруженные красными квадратами указывают на наличие антител. Более темные interspots, расположенные между активными пятнами антител используются для эталонного вычитания. Каждый столбец содержит антитело, напечатанное в концентрациях, указанных ниже титрования и слева от изображения. Количества печатных антител количественно путем расчета диfference в объемных сдвигах между активными и опорными точками приведены в правых панелях. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Рисунок 2. Сравнение реального времени Binding сенсограмм из нескольких циклов (А) и один цикл (B) Кинетические эксперименты в IBIS MX96. Последовательные инъекции человеческого PCSK9 при увеличении концентраций через решетку 10 х 8 антител отмечены выше каждый соответствующий сегмент сенсограммы. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Рисунок 3. Связывание сенсограмм захваченных антител человека Взаимодействие с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в Biacore T100. Взаимодействие оценивается более высоко- (верхние панели), средне- (средние панели), а также с низкими (нижними панелями) поверхности плотности. Налагаемое гладкие черные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) к 1: 1 модели взаимодействия. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Рисунок 4. Связывание сенсограмм захваченных антител человека Взаимодействие с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в Proteon XPR36. Взаимодействие оценивается более высокие (верхние панели), MediUM - (средние панели), а также с низкими (нижние панели) поверхность плотности. Налагаемое гладкие черные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) к 1: 1 модели взаимодействия. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Рисунок 5. Связывание сенсограмм захваченных антител человека Взаимодействие с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в октете RED384. Взаимодействие оценивается более высоко- (верхние панели), средне- (средние панели), а также с низкими (нижними панелями) поверхности плотности. Налагаемое красные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) до 1:<html> 1 модель взаимодействия. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Рисунок 6. Связывание сенсограмм из аминных в сочетании (А) и Fc-захваченных (B) антител человека Взаимодействия с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в IBIS MX96. Связывающие профили организованы в виде 10 х 8 панелей , которые следуют карте массива пластины на рисунке 1. Черные линии представляют собой записанные обязательные ответные сигналы при различных концентрациях PCSK9 человека, и наложенные красные линии представляют собой встроенные кривые. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> фигура 7&quot; SRC = &quot;/ файлы / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Рисунок 7. Сравнение Ассоциации K A (A), диссоциация к D (B), и равновесный К Д (С) константами связывания , порожденных платформами Четыре биосенсора. Кинетические параметры получены из глобального анализа связывания кривых на рисунках 3 - 6. Приборы представлены следующим образом: Biacore T100 (синий), Proteon XPR36 (зеленый), октет RED384 (красный), ИБИС MX96, амин связи (фиолетовый), и ИБИС MX96, Fc-захвачены (оранжевый). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Рисунок 8. Сравнение Консистенции кинетических Констант За множество антител поверхностных плотностей в BIAC<html> руда Т100 (А), Proteon XPR36 (В), октет RED384 (С), ИБИС MX96, амин связью (D) и ИБИС MX96, Fc-захвачена (Е). Кинетические параметры K A (верхний субпанели), K (D среднего суб-панели), а К D (нижние субпанели) получают из группового анализа на индивидуальной поверхностной плотности антитела. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="На рисунке 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Рисунок 9. Связывание Деятельности антител поверхностей и их стандартные отклонения (погрешности) в платформах Четыре БИОСЕНСОРА. Значения вычисляются с использованием уравнений , описанных в научных статьях 17.large.jpg»целевых =„_blank“&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> к а </td><td> к д </td><td> K D </td></tr><tr><td> (М -1 с -1) </td><td> (с -1) </td><td> (нМ) </td></tr><tr><td> мАт 1 </td><td> 11,7 (7,8) × 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) х 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> мАт 2 </td><td> 1,53 (0,28) × 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) х 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> мАт 3 </td><td> 11,4 (8,3) × 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) × 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> мАт 4 </td><td> 3,61 (1,6) × 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) х 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> мАт 5 </td><td> 0,59 (0,21) × 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) х 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> мАт 6 </td><td> 1,19 (0,78) × 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) х 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> мАт 7 </td><td> 1,29 (0,53) × 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) х 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> мАт 8 </td><td> 4,02 (2,23) × 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) х 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> мАт 9 </td><td> 4.20 (2.13) × 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) × 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> МКА 10 </td><td> 1.20 (0.49) X 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) х 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Таблица 1: Кинетические Цены и Равновесие константы связывание 10 моноклональных ПОЛУЧЕННОГО Глобальной фитинге кривых связывания с четыре БИОСЕНСОРОМ инструментов в 1: Модель взаимодействия 1.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Мы опишем здесь протоколы для измерения антиген-антитело аффинность связывания и кинетики с использованием четырех обычно используемых платформ биосенсора.

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Картирование участок связывания аптамер на АТФ Использование Microscale Термофорез

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...