Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Författarna tackar Noah Ditto och Adam Miles för tekniskt stöd på IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Publiceringsersättningar för video-artikeln betalades av Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Vår head-to-head jämförelse studie visar att varje biosensor plattform har sina egna styrkor och svagheter. Även om bindningsprofilerna för antikropparna är liknande genom visuell jämförelse (figurerna 3 - 6), och rangordningen av de förvärvade kinetiska hastighetskonstanter är mycket konsekvent över de instrument (Figur 7), visar våra resultat att SPR-baserade instrument med kontinuerliga flödes fluidik) är bättre på att lösa hög affinitetsinteraktioner med långsamma dissociationshastigheter. Uppåt Avvikelsen under dissociationsfasen observeras i datauppsättningar (t.ex. mAb 2, mAb 5, och mAb 9, fig 5) som genereras av BLI fluidik-free instrumentet. Detta fynd kan hänföras till stor del på provavdunstning över tiden i mikroplattan, som är en primär begränsning av systemet. Med denna inneboende begränsning, är den experimentella tid också begränsad till mindre än 12 h; experimenten därför programmerad med shÖrter gånger (500 associering och 30 min dissociation) jämfört med de för de andra plattformar (10 min förening och 45 min dissociation). Men förkorta den experimentella tiden inte verkade för att mildra effekterna av avdunstning på datakvalitet / konsistens, eftersom hastighetskonstanterna som genereras av BLI baserat instrument visar mindre linjäritet som ett resultat av variationer i några av off-priser (Figur 8C ). Förutom provavdunstning, kan skillnader i infångnings reagens som används har också bidragit till skillnaderna i de erhållna resultaten. Medan protein A / G användes i alla tre fluidlogikbaserade SPR plattformar, var AHC sensorer som används i icke-fluidics BLI plattform. Eftersom protein A / G är sannolikt har en svagare affinitet för mAb än tänker AHC, en antikroppsbaserad biosensorytan, off-hastigheter av mAb-antigenkomplexet från protein A / G-ytor kan artificiellt visas snabbare än de erhållen från AHC ytan. Denna möjlighet stöds by de experimentella data som visar att de off-hastighetsvärdena genererade av BLI plattformen var genomgående lägre än de som erhölls från de andra instrumenten (Figur 7, röd linje). Ändå har BLI plattform olika fördelar jämfört med andra plattformar. Till exempel, är det mycket flexibelt med avseende på sensor val och analys konfiguration på grund av de olika förbelagda sensorer för omedelbar användning. I våra experiment, användningen av AHC sensorerna eliminerat behovet av ligand immobilisering steg, vilket minskar förberedelsetiden. Vidare kräver BLI plattformen mycket mindre underhåll jämfört med de andra fluidik SPR plattformar, som funktionen komplicerade slangar och värde omkopplingskonfigurationer. Den här funktionen är en fördel för försök med råa prover som kan orsaka igensättning och föroreningsfrågor. Eftersom efterfrågan på effektiva, snabba och korrekt identifiering av terapeutiska kandidater ökar behovet av biosensor genomströmning ökar också. Bland de fyra biosensor plattformar, genomströmningen från biosensorn i stånd att 96-ligand array utskrift är den högsta, följt av biosensorn kopplad till ett kors och tvärs 36-ligand-format och den BLI-baserad biosensor med 16-kanals simultan avläsning, vilket i slutändan öka antalet interaktioner uppmätta i en enda bindningscykel till 96, 36 och 16, respektive. Dessa genomloppskapacitet är betydligt högre än den för den traditionella SPR plattform, som är begränsad genom att ha endast fyra flödesceller förbundna med en enda seriell flöde. Eftersom våra experiment involverade en relativt litet prov uppsättning av 10 mAb bedömda vid multipla yt densiteter med långa dissociation tider, de instrumentella genomströmningar spelade en måttlig roll vid bestämning av effektiviteten av experimenten. Det fanns inga signifikanta skillnader i de experimentella tider de tre hög genomströmning plattformar och i samtliga fall experimenten avslutades på en dag. Å andra sidan, krävs den traditionella serieflödes SPR experiment 3 dagar att slutföra, trots walk-away automatisering av datainsamling efter installationen. I andra studier som involverar ett stort antal prover (dvs. i de hundratals eller tusentals), för av-hastighet ranking / kinetisk screening eller epitop binning ändamål, blir genomflödet en kritisk faktor. Även genomströmningen i IBIS MX96 är storleksordningar högre än för de andra biosensorer och är därför ett optimalt val för dessa ändamål, har några brister. I synnerhet, arrayen tryckning genom CFM visar stor yta inkonsekvenser (figur 1) och reducerades uppgifter reproducerbarhet (Figur 8D och 8E). För noggranna kinetiska mätningar, är mängden av liganden på biosensorytan en kritisk parameter som måste regleras för att säkerställa att de bindande svaren inte störs av sekundära faktorer, såsommassöverföring eller steriskt hinder. För Biacore T100 och Proteon XPR36 ades de optimala R L nivåer bestäms baserat på standarden beräkning av uppsättningen R max värden som beskrivs i artikeln forskning 17. Å andra sidan, för de Oktett RED384 och IBIS MX96 plattformar ades mAb infångningsnivåer uppnås empiriskt med användning av en serie av 2-faldigt serieutspädda antikroppar vid konstant gånger. Bristen på kunskap eller kontroll av infångningssteget resulterade i en hög densitet yta och höga bindningssvarssignaler (Figur 2) som kan ha äventyras riktigheten av de kinetiska hastighetskonstanter. Vidare separation av skrivaren från SPR detektorn presenterar också en utmaning när de utför multipla bindningscykelmätningar involverar regenereringar. Det enda sättet att utföra ett flertal behandlingscykler kinetik installationen var genom direkt aminkoppling av de mAb, i motsats till fånga genom mAb Fc av den immobiliserade protein A / Gyta i de andra tre biosensor plattformar. Som ett resultat erhölls ett ytterligare regenererings scouting experiment erfordras för att bestämma de optimala regenereringsbetingelser. Resultatet av denna inställning var kopplad till en ~ 90% lägre observerade ytaktivitet jämfört med Fc-infångningsmetod (fig 9), förutom en längre experimentell tid. Att exekvera Fc infångningsmetoden, var ett alternativ med enkel cykel kinetiska synsätt. Detta tillvägagångssätt involverar sekventiell injektion av analyt vid ökande koncentrationer utan regenerering mellan varje injektion (figur 2). Detta mycket bekvämt, men mindre tillämpas allmänt tillvägagångssätt inte bara förkortas den experimentella tid och reducerad reagensförbrukning, men också producerade kinetiska hastighetskonstanter mycket liknande de från de andra biosensorer (Figur 7). Därför att tillämpa detta enkelcykel kinetik tillvägagångssätt övervinner den inneboende konfiguration begränsning av instrumentet och presenterar enmöjlighet för att erhålla hög upplösning kinetiska hastighetskonstanter i en hög genomströmning sätt. Trots genomströmningen är en viktig begränsning i Biacore T100, våra resultat visar kollektivt att det genererade de mest konsekventa data med högsta kvalitet. Detta följdes av den Proteon XPR36, som har ~ 10-faldigt högre genomströmning. Deras förmåga att generera hög kvalitet data blir en fördel när karakterisera hög affinitet antikropp-antigeninteraktioner som kan vara tekniskt utmanande när instrumentens detektionsgränser uppnås. Medan de systematiska begränsningar i instrumentering av den Oktett RED384 hindra korrekt mätning av dissociation hastighetskonstanter (dvs. klarar att känsligheten för att lösa tillräcklig signal förfall för långsam off-rates), både Biacore T100 och Proteon XPR36 kan ge känsliga och tillförlitliga detektion för differentiering.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Etikettfria optiska biosensorer är kraftfulla verktyg i läkemedelsutveckling för karakterisering av biomolekylära interaktioner. I denna studie beskriver vi användningen av fyra rutinmässigt används biosensor plattformar i vårt laboratorium för att utvärdera bindningsaffinitet och kinetiken för tio höga affinitet monoklonala antikroppar (mAb) mot humant proprotein konvertas subtilisin Kexin typ 9 (PCSK9). Medan både Biacore T100 och Proteon XPR36 är härledda från den väletablerade Surface Plasmon Resonance (SPR) teknik, har den tidigare fyra flödesceller förbundna genom konfiguration serieflöde, medan den senare presenterar 36 reaktions fläckar i parallellt genom en improviserad 6 x 6 korsvis konfiguration mikrofluidisk kanal. IBIS MX96 arbetar också baserad på SPR-sensorteknologi, med en ytterligare avbildning funktion som ger detektering i rumslig orientering. Denna detekteringsteknik kopplat med kontinuerligt flöde Microspotter (CFM) expanderar genomströmningen betydligt genom enabling multiplex array tryckning och detektering av 96 reaktions sporter samtidigt. Däremot är den Oktett RED384 baserat på BioLayer Interferometry (BLI) optisk princip, med fiberoptiska prober egenskap biosensorn för att detektera interferensmönstret ändras vid bindning interaktioner vid spetsytan. Till skillnad från de SPR-baserade plattformar, förlitar BLI-systemet inte på kontinuerliga flödes fluidik; Istället sensor tips samla avläsningar medan de är nedsänkta i analytlösningar av en 384-brunnar under orbital agitation. Var och en av dessa biosensor plattformar har sina egna fördelar och nackdelar. För att tillhandahålla en direkt jämförelse av dessa instrument förmåga att tillhandahålla kvalitets kinetiska data, de beskrivna protokollen illustrerar experiment som använder samma analysformatet och samma högkvalitativa reagens för att karakterisera antikropps-antigen kinetik som passar den enkla 1: 1 molekylär interaktion modell .

Figur 1 visar antikropps array bilden från CFM och de prickiga mAb nivåerna av de två immobiliseringsmetoder, och figur 2 visar de motsvarande bindnings sensorgrammen genererade i MX96 från flercykel kinetiska och den enkelcykel kinetiska mätningar på dessa mAb arrayer . Realtids bindning och kinetiskt inpassade kurvorna från flera antikroppsbelagda ytorna som genereras i de fyra biosensor plattformar visas i figurerna 3 - 6. Figur 7 visar jämförelsen av de slutliga kinetiska satser och jämviktsbindningskonstanter som erhållits från den globala analysen av dessa bindningskurvor. Den enskilda föreningen (k a), dissociation (k d), och jämvikt (K D) bindningskonstant presenteras i tabell 1. För att visa variationen av datamängder som genereras inom samma instrument, <stRong&gt; Figur 8 visar kurvor för k a, k d, och K D vid olika mAb Ytan densiteter, och Figur 9 jämför de beräknade bindningsaktiviteterna av mAb ytorna över biosensor plattformar ytterligare. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figur 1. Multiplex Ligand Arrayer av amin-kopplad (A) och Fc-infångade (B) Antikropp Ytor från CFM Printing i IBIS MX96. Bilder av de tryckta arrayer är visade i de vänstra paneler, där de grå områden som avgränsas av röda kvadrater anger närvaron av antikroppen. De mörkare interspots belägna mellan de aktiva fläckar antikropps används för referens subtraktion. Varje kolumn innehåller en antikropp tryckas vid titreringen koncentrationer som identifieras under och till vänster om bilden. Mängderna av de tryckta antikroppar kvantifierade genom beräkning av difference i bulk förskjutningar mellan de aktiva och referens platser visas i högra panelerna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figur 2. Jämförelse av Realtids Bindning Sensorgram från Multi-cykel (A) och Single-cykel (B) Kinetiska Experiment i IBIS MX96. De sekventiella injektioner av humant PCSK9 vid ökande koncentrationer över de 10 x 8 arrayer antikropps noterats ovan varje motsvarande sensorgram-segment. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figur 3. Bindning Sensorgram av de infångade Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i Biacore T100. Interaktioner utvärderas över hög- (övre fälten), medel (mitten paneler) och låg- (bottenpanelema) densitetsytor. De överlagrade släta svarta linjerna representerar den kinetiska passning av de bindande svarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer (färgade linjer) till en 1: 1 interaktion modell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figur 4. Bindning Sensorgram av de infångade Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i Proteon XPR36. Interaktioner utvärderas över hög- (toppaneler), mediUM (mitten paneler) och låg- (bottenpanelema) densitetsytor. De överlagrade släta svarta linjerna representerar den kinetiska passning av de bindande svarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer (färgade linjer) till en 1: 1 interaktion modell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figur 5. Bindning Sensorgram av de infångade Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i Oktett RED384. Interaktioner utvärderas över hög- (övre fälten), medel (mitten paneler) och låg- (bottenpanelema) densitetsytor. De överlagrade röda linjerna representerar den kinetiska passning av de bindande svarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer (färgade linjer) till en 1:<html> En modell för samverkan. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figur 6. Bindning Sensorgram av amin-kopplade (A) och Fc-infångade (B) Antikroppar Samverkande med Human PCSK9 och 1: 1-kinetiska modellen Fit överlägg i IBIS MX96. Bindningsprofilerna är organiserade som 10 x 8 paneler som följer arrayen plattan kartan i figur 1. De svarta linjerna representerar de inspelade bindningssvarssignaler vid olika humana PCSK9 koncentrationer, och de överlagrade röda linjerna representerar de inpassade kurvorna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> gur 7&quot; src = &quot;/ filer / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7. Jämförelse i föreningen Ka (A), Dissociation k d (B), och Equilibrium K D (C) bindningskonstanter som genereras av de fyra Biosensor plattformarna. De kinetiska parametrarna härleds från global analys av bindningskurvorna i figurerna 3 - 6. Instrumenten representeras enligt följande: Biacore T100 (blå), Proteon XPR36 (grön), Oktett RED384 (röd), IBIS MX96, amin-kopplad (lila), och IBIS MX96, Fc-infångade (orange). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figur 8. Jämförelse av överensstämmelsen mellan kinetiska konstanter Under flera Antikropps Surface Tätheten i Biac<html> malm T100 (A), Proteon XPR36 (B), Oktett RED384 (C), IBIS MX96, amin-kopplad (D), och IBIS MX96, Fc-infångade (E). De kinetiska parametrarna k a (topp delpaneler), k d (mellan delpaneler), och K D (botten delpaneler) härrör från gruppanalys vid individuella antikropps yttäthet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figur 9. Bindande Aktiviteter av antikroppen Ytor och deras standardavvikelser (felstaplar) i de fyra Biosensors plattformarna. Värdena beräknas med användning av ekvationer som beskrivs i de vetenskapliga artiklar 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Kinetiska priser och Jämviktsbindningskonstanter av 10 mAb Erhölls av Global Montering av bindningskurvor från Fyra Biosensor Instruments till en: en Interaction Model.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Vi beskriver här protokoll för mätning av antikropp-antigenbindningsaffinitet och kinetik med användning av fyra vanligen använda biosensor plattformar.

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysera dynamiska proteinkomplex monterat på och släppt från Biolayer interferometri Biosensor med hjälp av masspektrometri och elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...