Name: brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00
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이 작업은 ICELA Academia-2010 (ICREA Academia-2010)의 Catalina de Recerca / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 및 PIE14 / 00034) ), FC에 대한 Wenenschap en Technologie (SBO-140028)의 이그 제 큐 티브 (AGENTCHAP VOR Innovatie) 기술 연구소 (SBM-140028) 또한 X, M, VF-D. 및 FC는 &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; . 이 작품은 CAPES (브라질)에서 FC까지 &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot;

모든 동물 실험 절차는 Laboratory Animals 11 의 관리 및 사용 안내서에 설명되어있는 유럽 공동체 (European Community ) 에 따라 동물 실험 및 동물 관리위원회 (CEEA)에서 승인 한 바 있습니다.이 지침은 86 / 609 / CCE, FELASA 및 ARRIVE 지침. 따라서 마우스는 음식과 물을 자유롭게 접할 수있는 표준 케이지에 보관하고 표준 표준 조건 (오전 7시 30 분, 온도 22 ° C, 습도 66 %?...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 뇌 영역 내의 특정 단백질의 부갑상선 분포 연구에 대한 강력한 생화학 도구를 구성합니다. 그러나 여기서 강조해야 할 기술에 내재 된 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 주요 제한 사항 중 하나는 모든 subsynaptic 분수의 immunoblot 분석을 수행하기 위해 합리적인 금액의 단백질을 정화하는 데 필요한 조직의 상대적으로 큰 금액입니다. 이 문제는 시냅스 ( 즉, 시?...

시냅스 전달은 시냅스의 물리적 무결성에 달려 있는데, 이것은 포스터 (Foster)와 셔링턴 (Sherrington)에 의해 1897 년에 상상 된 개념이다. 따라서 정상 신경계와 병리학 적 상태 모두에서 중요한 신경 전달 요소 ( 예 : 이온 채널, 수용체 등 )의 분포를 이해하는 것이 시냅스 기능을 해명하는 데 필수적입니다. 전자 현미경 (EM)은 프로토 타입 중추 신경계 (CNS) 시냅스의 현재의 미세 구조 개념에 엄청난 공헌을했습니다. 이러한 방식으로 EM은 사전 및 후기 시냅스 밀도의 차이를 정교하게 정의했으며, 이는 일정한 거리 (~ 25 nm)의 틈으로 구분됩니다. 흥미롭게도, postsynaptic 장치는 소위 postsynaptic 밀도, 또는 PSD 2 라는 자사의 원형 막 아래 상대적으로 지속적인, 전자 밀도 농축을 보여줍니다. 반대로, presynaptic 장치에서, noticeabl불연속 cytomatrix 네트워크는 원형 막 바로 아래에 배치되어 있으며, 이것은 시냅스 소포를 원형 막 멤브레인 활성 영역 3에 정렬 및 도킹하는 데 필수적입니다. 따라서 EM은 구조적으로 보존 된 CNS 시냅스 내에서 단백질 분포를 조사하기위한 황금 실험 접근법을 구성합니다. 그러나 전자 현미경 사진에서 제공하는 정보는 정적입니다. 사실, 축적 된 증거는 생체 내 시냅스가 극도로 역동적이어서 지속적인 시냅스 전달에서 극적인 구조 변화를 경험한다는 것을 보여줍니다. 또한, 시냅스의 형태와 구성은 다양한 CNS 지역에서 발달, 성숙, 노화 및 신경 병리학 적 상태의 발달에 따라 변할 수있다. 전반적으로 생리 조건에서 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 데 초점을 맞춘 프로토콜은 시냅스 기능에 대한보다 포괄적 인 연구를위한 유용한 도구입니다. 등에 의해 처음으로 기술 된이 막 분획 화 방법은, (2001) 4 는 사전 및 사후의 시냅스 장치 내에서 발생하는 접착 상호 작용을 약화시키는 pH 변화에 기초한다. 첫째, pH 6.0에서 약한 세제를 사용하여 사전 및 사후 시냅스 장치를 보유하고 가용화되어 시냅스 접촉에서 추출 할 수있는 비회원 막 영역에서 유지되는 접착 접합을 식별 할 수 있습니다. 결과적으로, 중성 세제의 존재하에 pH를 6.0에서 8.0으로 올리는 것은 접합체 접합부의 강도를 약화시켜 접합 전 활성 영역이 접합 후 밀도에 단단히 결합되도록합니다. 따라서, presynaptic 구획은 너무윤활유는 후자 농도에서 분리 될 수 있는데, 이는 사용 된 세제의 농도가 그 가용화를 촉진시키지 않기 때문에 대부분 보존된다. 흥미롭게도, 분할 효율은 결국 90 % 이상으로, 다른 subsynaptic 마커에 의해 확인할 수 있습니다 : i ) synaptosomal 관련 단백질 25 (SNAP - 25), presynaptic 활성 영역에서; ii ) synaptophysin, extrasynaptic 분수에서 ( 즉, 활성 영역 외부 및 microsomes 포함); 그리고 ⅲ ) postsynaptic density 단백질 95 (PSD-95). 특히,이 뇌막 분화 방법은 성공적으로 사용되었습니다. 따라서, 알파 - 아미노 -3- 하이드 록시 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 수용체 5 , 아데노신 A1 수용체 (A1R) 6 및 아데노신 A1 수용체와 같은 상이한 수용체의 부갑상선의 국소화를 정확하게 결정할 수 있었다. ,아데노신 A 2A 수용체 (A 2A R) 7 , 아데노신 트리 포스페이트 (ATP) P2 수용체 8 , 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 서브 유닛 9 및 파킨슨 병 관련 수용체 GPR37 10 . 그러나, 여러 가지 제한 사항은 특정 연결 단백질의 시냅스 분포의 적절한 평가를 방해 할 수 있습니다. 따라서이 과정에서 우리는 전체 프로토콜을 완전하게 기술 할뿐만 아니라, 필요한 많은 양의 조직, 낮은 단백질 수율 및 단백질의 효율을 검증하기위한 필수 요구 사항과 같은 고려해야 할 중요한 포인트를 강조합니다. 명확한 실험을하기 전에 각 분리.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

시냅스 단백질의 구성과 기능을 평가하는 것은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 그러나 동적 인 단백질 - 단백질 상호 작용과 인산화 반응에 의해 조절되기 때문에 시냅스에서 발생하는 신경 전달을 평가하는 것은 쉽지 않습니다. 따라서, 어떤 방법이 시냅스 전달을 연구하는데 사용될 때, 주요 목표는 이러한 일시적인 생리 학적 변형을 보존하는 것이다. 여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다. 즉, 프로토콜은 presynaptic, postsynaptic, 그리고 extrasynaptic 구획에서 단백질 농축을 수행하는 생화학 방법론을 설명합니다. 첫째, synaptosomes, 또는 시냅스 터미널, 불연속 자당 그라디언트를 통해 모든 시냅스 구획을 포함하는 뉴런에서 얻은 것입니다. 참고로,이 초기 시냅스 막 준비의 품질은 c의복. 결과적으로, 다른 subsynaptic 구획의 분리는 차별적 인 pH 조건에서 순한 세제를 사용하여 가벼운 solubilization과 달성됩니다. 이것은 그래디언트 및 등 원심 원심 분리에 의한 분리를 허용합니다. 마지막으로, 다른 subsynaptic 구획 ( 즉, 사전, 사후 및 extrasynaptic 막 분수)에서 단백질 농축은 잘 특성화 된 시냅스 단백질 마커 ( 즉, SNAP - 25, PSD - 95, 그리고 synaptophysin을 사용하여 immunoblot 분석의 수단으로 유효성 검사, 각각의 신경 세포 단백질의 시냅스 분포를 직접 평가할 수있다.

설명 된 방법론은 일반적으로 신경 단백질의 subsynaptic 분석과 일반적으로 시냅스 수용체 5 , 6 , 7 , 8 , 9 의 분리 및 생화학 적 특성 결정에 사용되었습니다. 흥미롭게도, 여기에 표시된 대표 결과는 고아 G 단백질 - 결합 수용체 즉, 파킨슨 병 관련 수?...

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

단백질 지 방화 Immunoblotting 또는 단백질의 분석에 대 한 애기에서 엽록체 하위 구획의 준비

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...