Name: brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Bu çalışma, Ekonomi ve Sürdürülebilirlik Enstitüsü (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ve PIE14 / 00034) tarafından desteklenen Institucio Catalana de Recerca Estudis Avançats (ICREA Academia-2010) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, X.M, VF-D ve FC, &quot;Nörofarmakoloji ve Ağrı&quot; akredite araştırma grubuna (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) aittir ve FC için Innovatie kapısı Wetenschap en Technologie (SBO-140028) . Bu çalışma aynı zamanda CAPES (Brezilya )&#39;dan FC&#39;ye &quot;Programa Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; tarafından da desteklendi

Tüm hayvanlara ait deneysel prosedürler, Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber 11 ve Avrupa Topluluğunun 86/609 / EEC sayılı kanunları uyarınca, Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi (CEEA) tarafından University of Barcelona tarafından onaylanmıştır. CCE, FELASA ve ARRIVE kuralları. Böylece, fareler gıda ve suya ad libitum erişimi olan standart kafeslerde barındırılır ve kontrollü standart koşullar altında tutulur (7:30 AM, 22 ° C sıcaklı...

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Sinaptik yayın, sinapsın fiziksel bütünlüğüne, Foster ve Sherrington&#39;ın 1897&#39;de erken öngördüğü bir kavrama dayanır. Bu nedenle, hem normal hem de patolojik koşullardaki sinaptik fonksiyonu aydınlatmak için temel sinir iletim bileşenlerini ( örn. Iyon kanalı, reseptör vb. ) Dağılımını anlamak önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), prototipik merkezi sinir sistemi (CNS) sinapslarının mevcut ultrastrüktürel görüşüne muazzam katkılarda bulunmuştur. Öyle ki, EM, oldukça düzgün bir mesafeden (~ 25 nm) 2 bir yarık ile ayrılan pre-ve postsinaptik yoğunluklar arasındaki farkları ince bir şekilde belirledi. İlginç olarak, postsinaptik aparat, plazma membranının altında, postsinaptik yoğunluk veya PSD 2 olarak adlandırılan nispeten sürekli, elektron-yoğun bir kalınlaşma sergilemektedir. Tersine, presinaptik cihazda,E süreksiz sitomatrix ağı, sinaptik veziküllerin plazma membran aktif bölgesine 3 hizalanması ve docklanması için gerekli plazma membranının hemen altında düzenlenmiştir. Bu nedenle, EM, yapısal olarak korunmuş SSS sinapsları içindeki protein dağılımını araştırmak için altın deneysel yaklaşımı oluşturmaktadır. Bununla birlikte, elektron mikrografları tarafından sağlanan bilgiler statiktir. Gerçekten de, biriken kanıtlar in vivo sinapsların son derece dinamik olduğunu ve böylece sürekli sinaptik bulaşmada dramatik yapısal değişikliklerin yaşandığını göstermektedir. Buna ek olarak, sinapsların morfolojisi ve bileşimi, farklı CNS bölgelerinde ve gelişim, olgunlaşma, yaşlanma ve nöropatolojik koşulların gelişimi üzerine değişebilir. Genel olarak, fizyolojik koşullarda farklı sinaptik bölmelere ait proteinlerin izole edilmesine odaklanan bir protokol, sinaptik işleyişin daha kapsamlı bir çalışması için değerli bir araçtır. <p cLass = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada, farklı sinaptik membran bölmelerinin, yani ekstra, ön ve postsinaptik zar alanlarının hazırlayıcı biyokimyasal zenginleşmesine izin veren, bu tür tamamlayıcı deneysel yaklaşımı açıklıyoruz. Bu membran fraksiyonasyon yöntemi, önce Philips ve ark . (2001) 4 , pre ve postsinaptik aparat içinde oluşan yapışkan etkileşimleri zayıflatan bir pH kaymasına dayalıdır. İlk olarak, pH 6.0&#39;da hafif deterjanlar kullanarak, pre ve postsinaptik aparatı tutan ve çözünürleştirilen ve böylelikle sinaptik kontaklardan ekstraksiyona tabi tutulabilen ekstrasinaptik membran alanından muhafaza edilen adherens kavşağını ayırt etmek mümkündür. Daha sonra, yumuşak deterjanlar varlığında pH&#39;ı 6.0&#39;dan 8.0&#39;a yükseltmek, presynaptik aktif bölgeyi postsinaptik yoğunluğa sıkıca bağlayan adherens bileşkesinin mukavemetini zayıflatır. Bu nedenle, presinaptik bölme öyleYağlanmış ve çoğunlukla korunan postsinaptik yoğunluktan ayrılabilir, çünkü kullanılan deterjan konsantrasyonu çözünürlüğünü arttırmaz 4 . İlginç bir şekilde, fraksiyonasyon etkinliği, sonunda% 90&#39;dan daha yüksek olarak, farklı alt sinaptik belirteçler tarafından teyit edilebilir: i ) presinaptik aktif bölgeden sinaptozomal bağlantılı protein 25 (SNAP-25); Ii ) synaptophysin, extrasinaptik fraksiyondan ( yani, aktif bölge dışındadır ve mikrozomlar dahil); Ve iii ) postsinaptik yoğunluğa göre postsinaptik yoğunluk proteini 95 (PSD-95). Özellikle, bu beyin zar fraksiyonasyon yöntemi başarıyla kullanılmıştır. Buna göre, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolpropionik asit (AMPA) reseptörleri 5 , adenosin A 1 reseptörü (A 1 R) 6 gibi farklı reseptörlerin alt sinaptik lokalizasyonunu kesin olarak saptamak mümkün olmuştur ,Adenosin A 2A reseptörü (A 2A R) 7 , adenosin trifosfat (ATP) P2 reseptörleri 8 , nikotinik asetilkolin reseptör altbirimleri 9 ve Parkinson hastalığına bağlı reseptör GPR37 10&#39;dur . Bununla birlikte, birtakım sınırlamalar, belirli bir nöronal proteinin sinaptik dağılımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini engelleyebilir. Dolayısıyla, bu prosedürde, tüm protokolü tam olarak tanımlamakla kalmamakla birlikte, oldukça fazla miktarda doku, düşük protein verimliliği ve verimliliğin doğrulanması için zorunlu gereksinim gibi dikkate alınması gereken bazı kritik noktaları vurguluyoruz Kesin ayrımı yapmadan önce her ayrım.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sucrose</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,211,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">CaCl2</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">2,112,211,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,313,961,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Protease inhibitor cocktail Set III</td>
			<td style="width:249px;">Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">535140</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Trizma Base</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,236,541,209</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">SDS</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">L3771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Glycerol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">G5516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,311,651,604</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Dithiothreitol</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">D0632</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Tween 20</td>
			<td style="width:249px;">Sigma, St. Louis, MO, USA</td>
			<td style="width:160px;">P2287</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Non fat dry milk</td>
			<td style="width:249px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">NaCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,216,591,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KCl</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,314,941,210</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:249px;">Merck</td>
			<td style="width:160px;">4873</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:249px;">Pancreac Qu&#237;mica SL, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;">1,316,781,211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Basic 20 pH</td>
			<td style="width:249px;">Crison, Alella, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:128px;">Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;">344059</td>
			<td style="width:167px;">Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td>
			<td style="width:249px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:160px;">UFC901008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Centrifuge 5430R</td>
			<td style="width:249px;">Eppendorf, Hamburgo, Germany</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:249px;">Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Sonifier 250</td>
			<td style="width:249px;">Branson, Danbury, Connecticut</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Amersham Imager 600</td>
			<td style="width:249px;">GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td>
			<td style="width:249px;">VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td style="width:160px;">612-1702</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Compact Balance EK-610</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:249px;">Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">GR 200 Precision Balance</td>
			<td style="width:249px;">A&#38;D, Tokyo, Japan</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-GPR37</td>
			<td style="width:249px;">Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies used at a final concentration of 0.250ug/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:128px;">Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td>
			<td style="width:249px;">Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary antibodies diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:128px;">HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:249px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary antibody diluted 1:30000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

Sinaptik protein kompozisyonunun ve fonksiyonunun değerlendirilmesi sinirbiliminde önemli bir zorluk oluşturmaktadır. Bununla birlikte, sinapslarda oluşan sinir iletimini değerlendirmek kolay değildir çünkü dinamik protein-protein etkileşimleri ve fosforilasyon olayları tarafından yüksek derecede düzenlenir. Buna göre, sinaptik bulaşmayı incelemek için herhangi bir yöntem kullanıldığında, bu geçici fizyolojik değişiklikleri korumak temel hedeftir. Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz. Başka bir deyişle, protokol, presinaptik, postsinaptik ve extrasinaptik bölmelerden protein zenginleştirmesini gerçekleştirmek için bir biyokimyasal metodoloji açıklamaktadır. Birincisi, sinaptozomlar veya sinaptik terminaller, kesintili bir sükroz gradyeni aracılığıyla tüm sinaptik bölmeleri içeren sinir hücrelerinden elde edilir. Not, bu başlangıç ​​sinaptik zar hazırlığının kalitesi critical. Ardından farklı subynaptik bölmelerin izolasyonu, diferansiyel pH koşullarında hafif deterjanlar kullanılarak hafif çözünürlükle elde edilir. Bu gradyan ve izopiklik santrifüjlerle ayrılmaya izin verir. Son olarak, farklı subjunaptik bölmelerdeki protein zenginleştirmesi ( yani, öncesi, sonrası ve ekstrasinaptik membran fraksiyonları), iyi karakterize edilmiş sinaptik protein işaretleyicileri ( örn., SNAP-25, PSD-95 ve sinaptofizin) kullanılarak imünoblot analizi ile doğrulanır Sırasıyla), böylece belirli bir nöronal proteininin sinaptik dağılımının doğrudan değerlendirilmesini sağlar.

Tanımlanan metodoloji genel olarak sinirsel proteinlerin alt sinaptik analizi için ve özellikle sinaptik reseptörlerin 5 , 6 , 7 , 8 , 9 izolasyonu ve biyokimyasal olarak karakterize edilmesi için büyük ölçüde kullanılmaktadır. İlginçtir, burada gösterilen temsili sonuç, yetim bir G proteinine bağlı reseptör...

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Burada, farklı sinaptik bölmelere ait proteinleri izole etmek için sağlam bir prosedürü temsil eden bir beyin zar fraksiyonasyon protokolünü sunuyoruz.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...