Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من جامعة جونز هوبكنز (SW). نشكر مدرسة جونز هوبكنز للمرفق الطب مجهر لدعمها التقني. نشكر إريك يورجنسن وكريستيان روزنموند وأعضاء مختبراتها لتطوير هذه التقنية. نشكر M. وين ديفيس لتصميم الجهاز الأولي. نشكر بول وورزينغر، كفيتا توموفا، وDelgermaa Luvsanjav للحصول على المساعدة الفنية. كما نشكر ناتالي R. هاميلتون وغرانت F كوسيك لقراءة نقدية لها من المخطوطة.

<ol>
	<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500 (2015).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+microscopy+and+electron+microscopy.">Correlated light microscopy and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).</li><li>Redemann, S., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division.">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+reshaping+during+endocytosis+is+revealed+by+time-resolved+electron+tomography.">Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography.</a> Cell. 150 (3), 508-520 (2012).</li><li>Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+correlative+light-electron+microscopy+to+observe+molecular+dynamics+in+high+resolution.">Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution.</a> Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).</li><li>M&#252;ller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+of+Early+Caenorhabditis+elegans+Embryos+in+Mitosis.">Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis.</a> Cellular Electron Microscopy. 79, 101-119 (2007).</li><li>Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+virus-cell+interactions.">Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions.</a> FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).</li><li>Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage+of+freeze-dried+cryosections+of+cells:+Investigations+by+EFTEM+and+cryo-CLEM.">Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM.</a> Micron. 88, 77-83 (2016).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+after+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions.">Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> eLife. 2, e00723 (2013).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-and-Freeze:+Coordinating+Optogenetic+Stimulation+with+Rapid+Freezing+to+Visualize+Membrane+Dynamics+at+Synapses+with+Millisecond+Resolution.">Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution.</a> Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).</li><li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , (1987).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Weitzman, M., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+approaches+to+cell+migration+and+beyond.">Optogenetic approaches to cell migration and beyond.</a> Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).</li><li>Niu, J., Ben Johny, ., Dick, M., E, I., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+Optogenetic+Dimerizers+and+Quantitative+Prospects.">Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects.</a> Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).</li><li>van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+organelle+transport+and+positioning.">Optogenetic control of organelle transport and positioning.</a> Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).</li><li>Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+phosphoinositide+metabolism.">Optogenetic control of phosphoinositide metabolism.</a> Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).</li><li>Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+Lipid+Rafts+with+Photoswitchable+Ceramides.">Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides.</a> J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).</li><li>Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+probability+of+glutamate+release+at+a+hippocampal+synapse.">Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse.</a> Science. 262 (5134), 754-757 (1993).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li></ol>

وقد رعت نشر الوصول المفتوح من هذه المادة لايكا Mikrosysteme GmbH ل.

نهج &quot;فلاش وتجميد&quot; يتصور ديناميات غشاء عن طريق حفز حدث الخلوي معين مع علم البصريات الوراثي وتجميد الخلايا في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز 19. في هذه المظاهرة، كنا channelrhodopsin، قناة الموجبة الحساسة للضوء، لتحفيز الخلايا العصبية واستولت على الانصهار والانتعاش من الحويصلات المشبكية في محطات متشابك. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت العديد من الأدوات علم البصريات الوراثي 22، 23، وكلها متوافقة مع فلاش والتجميد. على سبيل المثال، والاتجار عضية يمكن أن يتسبب استخدام heterodimerization الناجم عن ضوء cryptochrome وCIB1 24. وبالمثل، وتكوين الدهون في غشاء البلازما يمكن تغييرها من قبل النبات الناجم خفيفة من فوسفاتاز فسفوإينوزيتيد إلى غشاء البلازما 25. وعلاوة على ذلك، ومركبات صغيرة حساسة للضوء مثل الفصل آزوبنزينالتشكل أنج اعتمادا على موجات الإضاءة. هذا التغيير متعلق بتكوين يمكن استخدامها لتنشيط قنوات بوابات يجند أو لتغيير تركيبة الدهون في غشاء 26 و 27. ويمكن أيضا أن المركبات قفص أن تستخدم للحث على النشاط الخلوي. ومع ذلك، فإن LED المستخدمة في الإعداد الحالي قد لا تنتج ما يكفي من الطاقة لuncaging. وبالتالي، تحسينات أخرى للنظام ضرورية على الأرجح. ومع ذلك، فإن تطبيق هذه الأدوات خفيفة activatable هي الأحداث الخلوية مرنة كثير يمكن أن يتسبب التي كتبها ومضة من الضوء. &quot;فلاش وتجميد&quot; يمكن التقاط ديناميات غشاء الناتجة عن ذلك. هناك نوعان من القيود الرئيسية على طريقة &quot;الفلاش والتجميد&quot;. أولا، أنه يلتقط &quot;لقطات&quot; من حدث معين من خلايا مختلفة. وبعبارة أخرى، فإنه ليس من الممكن لمتابعة الديناميات الغشاء في خلية واحدة على مدى فترة من الزمن. وهكذا، لإعادة بناء أي الخلوية حتىر، لا بد من اكتساب وتحليل عدد كبير من الصور من كل عينة وفي كل نقطة زمنية. وعلاوة على ذلك، في الخلايا العصبية، وهو عدد أكبر من الصور ضروري، لأن اندماج الحويصلات متشابك يستغرق سوى الأماكن في 20-30٪ من نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية الماوس الحصين 18، 28. تحليل مثل هذه بيانات كبيرة تتطلب كميات هائلة من الوقت. في المستقبل، واقتناء الصور وتحليلها تحتاج إلى آلية لجعل نهج أكثر كفاءة 29 و 30. وفرض القيد الثاني وفقا لطبيعة تقنية تجميد الضغط العالي. عندما تجميد الخلايا، تعيد ترتيب المياه الخلوي لتشكيل بلورات الثلج إذا كان معدل تجميد أقل من 100 K / ق 21. ويمكن لهذه بلورات الثلج اختراق أغشية أو تركز الأملاح لتغيير الضغط الاسموزي المحلي، مما أدى إلى تمزق الأغشية. لتجنب بلورات الثلج، المهزومةيتم تطبيق الضغط ح (~ 2000 أجهزة الصراف الآلي) للعينات. ويرجع ذلك إلى تأثير التبريد فائقة، وهو معدل تجميد 100 K / ثانية كافية لمنع المياه من تشكيل بلورات الجليد في هذا الضغط 21. من الناحية النظرية، عينات سميكة مثل 500 ميكرون يمكن تجميد دون بلورات الثلج، ولكن ما يقرب من 200 ميكرون من المرجح الحد العملي، كما تميل أشكال مكعبة من الجليد لتشكيل في الأنسجة السميكة، المساس التشكل. عندما عينات معالجة أكثر سمكا من 5 ميكرون، واستخدام السليم البرد حاصن، مثل BSA، أمر ضروري. ومع ذلك، فإن BSA تغيير الأسمولية من الحل وقد تؤثر على الاستجابة الفسيولوجية للخلايا. لذلك، يطلب من التجارب مراقبة واسعة النطاق للتحقق من صحة استخدام BSA في أنظمة معينة. يمكن أن بلورات الثلج أيضا أن تشكل بعد الضغط العالي تجميد إذا تم إزالة العينات عن طريق الخطأ من حمام النيتروجين السائل. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على العينات في النيتروجين السائل في جميع الأوقات، واستخدام الملقط قبل المبردة لالتلاعب بها. عند التخطيط التجارب، ينبغي النظر في النقاط الثلاث التالية. أولا، لشدة القصوى من ضوء (خط 460 نانومتر) هو 5،5-8،0 ميغاواط / مم 2. إذا كان هذا كثافة كافية للحث على النشاط يجب التحقق مع التصوير الخلية الحية على المجهر مضان قبل التجارب فلاش والتجميد. ثانيا، يجب إجراء التجارب في درجة حرارة الفسيولوجية. وارتفعت درجة حرارة مرحلة الثلاجة الضغط العالي تصل إلى 37 درجة مئوية لمدة التجارب مع الخلايا العصبية الماوس الحصين 31. وأخيرا، فإن نقطة زمنية يجب اختيارها بعناية لالتقاط ديناميات غشاء. أشارت الدراسات الأولية إلى أن الإلتقام اكتمال بعد 100 مللي ثانية من التحفيز. وهكذا، تم فحص ثلاث نقاط زمنية إضافية (15، 30، و 50 مللي ثانية) أيضا لمتابعة ديناميات غشاء 17 و 18. وكانت هذه النقاط الزمنية اللازمة لتصور الحدث الاتجار الغشاءالصورة أثناء انتقال متشابك. ومع ذلك، فإن الحاجة إلى عدد من النقاط الزمنية تختلف في كل حدث الخلوية. ولذلك، ينبغي أخذ عينات بضع نقاط من الوقت قبل الشروع في جمع بيانات كبيرة.

تصور الغشاء والبروتين ديناميكية داخل الخلية هو خطوة رئيسية نحو فهم بيولوجيا الخلايا لعمليات معينة. يمكن التقاط الأحداث الاتجار الديناميكي باستخدام ضوء أو مضان المجهر. ومع ذلك، فإن السياق التحت خلوية مفقود إلى حد كبير في مثل هذه الصور لأن الهياكل التحت خلوية لا يمكن تماما &quot;رسمت&quot; من الأصباغ أو تحقيقات الفلورسنت وحل مكانيا وطيفيا 1 و 2. من ناحية أخرى، في حين المجهر الإلكتروني يمكن أن ترسم العمارة التحت خلوية في التفاصيل الرائعة، فإنه لا يمكن التقاط ديناميات الخلوية، وذلك لأن العينات يجب أن تكون ثابتة قبل التصوير. وبالتالي، فمن عادة لا يكفي لفهم تماما ديناميات الخلوية باستخدام واحد فقط تصوير الطريقة. للتغلب على القيود المفروضة على الضوء والمجهر الإلكتروني، فقد تم تطوير تقنيات المجهر المترابطة. متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني(CLEM) يتصور ديناميكية داخل الخلايا باستخدام المجهر الضوئي والبنى التحت خلوية الأساسية مع المجهر الإلكتروني. في CLEM، وخلايا تعمل في مختلف العمليات، مثل الانقسام السيتوبلازمي والإلتقام 3، 4، 5، 6، ويعيش تصوير ومن ثم معالجتها لالمجهر الإلكتروني. وعلى الرغم من CLEM يلتقط بعض جوانب الديناميات داخل الخلايا، وهناك أربعة عوامل تحد من جدوى هذا النهج. أولا، هو القرار الزماني محدودة بسبب سرعة يمكن يجمد الخلايا، والتي تأخذ عادة ق - دقيقة بسبب انتشار بطيء ورد فعل مثبتات 7. آخر الثانية، لوحظ العمارة التحت خلوية الفعلي 8؛ وبالتالي، فإن التغيرات المورفولوجية الحيوية لا يمكن الحصول عليها باستخدام هذا النهج. ثالثا، الميكروسكوب مضان والإلكترون لا يمكن محاذاة على وجه التحديد بسبب ش الأنسجةrinkage الناجمة عن الجفاف خلال إعداد العينات للفحص المجهري الإلكترون 9 و 10. رابعا، أحداث مثل الانقسام السيتوبلازمي والإلتقام لا تجري في نفس الوقت في كل خلية 5، 11، وبالتالي، لا بد من التعرف على خلية معينة التي تعمل في هذا الحدث من عدد كبير من الخلايا. هذه العملية غالبا ما تكون شاقة. وبالتالي، من الضروري طريقة جديدة للحث على أحداث معينة في كل خلية وللقبض على ديناميات الخلوية الناجم عن ذلك تجميد السريع للخلايا في نقطة زمنية محددة. مؤخرا، تم تطوير العديد من الأدوات للحث على وجه الخصوص ديناميات الخلوية باستخدام الضوء (علم البصريات الوراثي). Channelrhodopsin هو، قناة الموجبة غير انتقائية حساسة للضوء معزولة عن كلاميدوموناس reinhardtii 12 و 13. عندما يتم التعبير عن channelrhodopsin في neuronaالأغشية لتر، ومضة قصيرة من الضوء يدفع تدفق أيونات الصوديوم إلى الخلايا العصبية ويؤدي هذا العمل المحتملين 14 و 15. ثم ينتشر إمكانات العمل في محطات متشابك، حيث تلتحم الحويصلات المشبكية خلال أجزاء من الثانية 16، 17، 18 لذلك، channelrhodopsin يدفع نشاط الخلايا العصبية. لمتابعة الديناميات الغشاء في محطات متشابك، يجب أن يجمد الخلايا العصبية عند نقاط زمنية محددة بعد التحفيز مع مللي الدقة. لالتقاط ديناميات غشاء بعد حمل نشاط الخلايا العصبية، ونحن إلى جانب التحفيز خفيفة مع ارتفاع ضغط تجميد 17 و 18 و 19. الضغط العالي تجميد يسمح لتجميد شبه لحظية من الخلايا مع انخفاض الجليد تشكيل الكريستال 20. بلورات الثلج كاليفورنيان تمزق الأغشية وتعطيل العمارة التحت خلوية 21. من خلال تغيير فترات زمنية بين التحفيز والتجميد، تم القبض على الاتجار غشاء داخل محطات متشابك بعد تحريض من إمكانات العمل. هنا، علينا أن نظهر الإجراءات التجريبية باستخدام تجاريا الفريزر الضغط العالي أن الأزواج تحكم مللي الزمنية من التحفيز خفيفة مع ارتفاع ضغط التجمد. وخلافا لغيرها من الصكوك التي تتطلب جهاز خارجي للسيطرة على التحفيز خفيفة والتجميد، تم دمج التحفيز الضوء بالكامل في هذا النظام، ويمكن تطبيقها مع مللي الدقة 19. وتنطوي هذه العملية متعددة الخطوات. 1) الخلايا العصبية ماوس الحصين يتم تربيتها على الأقراص الياقوت والمصابة مع الفيروسة البطيئة تحمل ناقلات التعبير عن channelrhodopsin 18. 2) يتم تحفيز الخلايا العصبية وجمدت عند نقاط زمنية محددة بعد التحفيز. 3) الماء المزجج هو البديلد مع المذيبات العضوية، في حين أن الدهون والبروتينات عبر ربط بواسطة مثبتات للحفاظ على بنية الخلايا. 4) مخترقة العينات وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. 5) يتم جمعها أقسام سامسونج باستخدام مشراح مستدق. 6) يتم تصوير مقاطع رقيقة على المجهر الإلكتروني النافذ. 7) يتم تنفيذها الحصول على الصور وتحليلها بصورة عمياء فيما يتعلق بالنقاط الوقت أو المورثات. يمكن تحديد ديناميات الخلوية من خلال إعادة بناء الصور وقت حل 17 و 18. إعداد نموذج (الخطوات 2-5 أعلاه) يتطلب الأسبوع، ولكن تحليل الصور اللاحقة يتطلب أشهر إلى سنة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

خلايا باستمرار تغيير بنية الغشاء وتوزيع البروتين، ولكن من الصعب للغاية تصور هذه الأحداث في القرار الزماني والمكاني بناء على أمر من مللي ونانومتر، على التوالي. لقد قمنا بتطوير تقنية وقت حل المجهر الإلكتروني، &quot;فلاش وتجميد،&quot; أن يدفع الأحداث الخلوية مع علم البصريات الوراثي ويتصور ديناميات غشاء الناجم عن تجميد الخلايا في نقاط زمنية محددة بعد التحفيز. وللتدليل على هذه التقنية، عبرنا عن channelrhodopsin، قناة الموجبة حساسة للضوء، في الخلايا العصبية الماوس الحصين. ومضة من الضوء يحفز نشاط الخلايا العصبية ويؤدي الافراج عن العصبي من المحطات متشابك من خلال اندماج الحويصلات متشابك. ويقترن التحفيز علم البصريات الوراثي للخلايا العصبية مع الضغط العالي تجميد لمتابعة التغيرات المورفولوجية أثناء انتقال متشابك. باستخدام أداة التجاري، ألقينا القبض على اندماج الحويصلات متشابك وانتعاش synaptic غشاء الحويصلة. لتصور تسلسل الأحداث، تم إنشاء مجموعات كبيرة من البيانات وتحليلها بصورة عمياء، منذ أن يتبع تغيرات شكلية في خلايا مختلفة على مر الزمن. ومع ذلك، ومضة وتجميد يسمح التصور من ديناميات غشاء في الميكروسكوب الإلكتروني مع مللي القرار الزماني.

باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، أجرينا &quot;فلاش وتجميد&quot; التجارب في الماوس الخلايا العصبية الحصين معربا عن channelrhodopsin. تم تجميد هذه الخلايا العصبية إما 15 مللي ثانية أو 100 مللي ثانية بعد ظهور الضوء. لقد أظهرنا سابقا أن إيماس الإلتقام والحويصلات المشبكية تحدث في محطات متشابك في 15 مللي و 100 مللي نقاط الوقت، على التوالي 18. تم القبض على هذه الأحداث بنجاح في الأوقات المناسبة (الشكل 2)، مما يشير إلى أن التجارب فلاش والتجميد لا يمكن أن يؤديها بنجاح على متخصص الثلاجة الضغط العالي اختارت (انظر جدول المواد). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> الشكل 1. تحميل عينة والبرمجة في الضغط العالي الفريزر. أ) الجدول عينة تحميل عالية فالفريزر ressure. لوحة المتوسطة، كما هو موضح في أقحم لمزيد من التفاصيل الهيكلي، يتم وضعها في حامل CLEM لعينة التحميل. يتم وضع واحدة من نصف اسطوانات في الجزء السفلي من الجدول تحميل عينة، ويرد الآخر مع مقطع لالغطاء العلوي. مرة واحدة يتم تحميل العينة، يتم الضغط على لوحة الأوسط قدما إلى أسفل نصف أسطوانات وإغلاق غطاء لبدء التجميد. B) تجميع العينات. يتم وضع القرص الياقوت تحتوي على الخلايا العصبية في بئر من لوحة المتوسطة، مع الجانب الخلية مواجهة. يتم وضع خاتم 100 ميكرون مباشرة فوق القرص الياقوت داخل البئر. ثم، يتم وضع قرص الياقوت فارغة مغموسة في محلول فسيولوجي مع الجانب حل لأسفل. يجب تجنب فقاعات الهواء. وأخيرا، يتم وضع خاتم 100 ميكرون وحلقة 400 ميكرون بشكل مريح أعلاه. تتم إزالة أي سائل اضافية مع ورق الترشيح. C) والمقطع العرضي للكبسولة تضمين مع القرص الياقوت غارقة في راتنجات الايبوكسي. في سابيتم وضع استئجار القرص في الجزء السفلي من الكبسولة، مع الجانب الخلية تواجه صعدت وغطت مع راتنجات الايبوكسي لتسلل والتضمين. D) برمجة الثلاجة الضغط العالي لواحد، والتحفيز 10 مللي ثانية. يتم تجميد العينات 90 مللي ثانية بعد نبض الضوء. E) برمجة الثلاجة الضغط العالي لمدة 10 المحفزات في 20 هرتز. يتم تجميد العينات 5 مللي ثانية بعد نبضة ضوء الماضي. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> الشكل 2. تصور إيماس الإلتقام وفي ماوس الحصين الخلايا العصبية. يتم تحفيز الخلايا العصبية قرن آمون مرة واحدة وجمدت في الأوقات المحددة. تظهر الميكروسكوب الإلكتروني على إيماس من متشابك الحويصلة A) والإلتقام فائق السرعة <sترونج&gt; B). PSD، كثافة بعد متشابك. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

قمنا بتطوير تقنية جديدة في المجهر الإلكتروني، &quot;فلاش والتجميد&quot; التي تمكن من تصور ديناميات الغشاء مع مللي القرار الزماني. هذا الأسلوب يجمع بين التحفيز علم البصريات الوراثي للخلايا العصبية مع ارتفاع ضغط التجمد. هنا، علينا أن نظهر للإجراءات ووصف البروتوكولات في التفاصيل.

فلاش وتجميد: تقنية جديدة لالتقاط غشاء حيوية مع المجهر الإلكتروني

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

متلازم متحد البؤر و3D المجهر الإلكتروني لخلية حسية معينة

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

تروية دقيقة التقنية المعنية بالتحقيق في تنظيم Microvessel النفاذية في الفئران مساريق

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

المجهر الإلكتروني من الأنسجة متآكلة إلى تصور مصفوفة خارج الخلية

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...