Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס (SW). אנו מודים ספר ג&#39;ונס הופקינס של מתקן מיקרוסקופ לרפואה לתמיכה הטכנית שלהם. אנו מודים אריק יורגנסן ונוצרים Rosenmund וחברי המעבדות שלהם לפיתוח הטכניקה. אנו מודים M. ווין דייוויס עבור העיצוב של המכשיר הראשוני. אנו מודים פול Wurzinger, Cveta Tomova, ו Delgermaa Luvsanjav לקבלת הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם נטלי ר המילטון ו גרנט פ Kusick לקריאה ביקורתית שלהם של כתב היד.

<ol>
	<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500 (2015).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+microscopy+and+electron+microscopy.">Correlated light microscopy and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).</li><li>Redemann, S., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division.">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+reshaping+during+endocytosis+is+revealed+by+time-resolved+electron+tomography.">Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography.</a> Cell. 150 (3), 508-520 (2012).</li><li>Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+correlative+light-electron+microscopy+to+observe+molecular+dynamics+in+high+resolution.">Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution.</a> Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).</li><li>M&#252;ller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+of+Early+Caenorhabditis+elegans+Embryos+in+Mitosis.">Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis.</a> Cellular Electron Microscopy. 79, 101-119 (2007).</li><li>Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+virus-cell+interactions.">Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions.</a> FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).</li><li>Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage+of+freeze-dried+cryosections+of+cells:+Investigations+by+EFTEM+and+cryo-CLEM.">Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM.</a> Micron. 88, 77-83 (2016).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+after+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions.">Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> eLife. 2, e00723 (2013).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-and-Freeze:+Coordinating+Optogenetic+Stimulation+with+Rapid+Freezing+to+Visualize+Membrane+Dynamics+at+Synapses+with+Millisecond+Resolution.">Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution.</a> Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).</li><li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , (1987).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Weitzman, M., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+approaches+to+cell+migration+and+beyond.">Optogenetic approaches to cell migration and beyond.</a> Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).</li><li>Niu, J., Ben Johny, ., Dick, M., E, I., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+Optogenetic+Dimerizers+and+Quantitative+Prospects.">Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects.</a> Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).</li><li>van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+organelle+transport+and+positioning.">Optogenetic control of organelle transport and positioning.</a> Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).</li><li>Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+phosphoinositide+metabolism.">Optogenetic control of phosphoinositide metabolism.</a> Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).</li><li>Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+Lipid+Rafts+with+Photoswitchable+Ceramides.">Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides.</a> J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).</li><li>Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+probability+of+glutamate+release+at+a+hippocampal+synapse.">Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse.</a> Science. 262 (5134), 754-757 (1993).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li></ol>

פרסום גישה פתוחה של מאמר זה מומן על ידי לייקה Mikrosysteme GmbH.

גישת &quot;פלאש-ו-ההקפאה&quot; מדמיין דינמיקת קרום ידי גרימת אירוע הסלולר בפרט עם optogenetics ועל ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדרת לאחר גירוי 19. בהפגנה זו, השתמשנו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, כדי לעורר נוירונים וכבשנו את ההיתוך והתאוששות של שלפוחית ​​סינפטית במסופי הסינפטי. בשנים האחרונות, כלי optogenetic רבים פותחו 22, 23, שכולן עולים בקנה אחד עם פלאש-ו-הקפאה. לדוגמה, סחר אברון יכול להיגרם באמצעות heterodimerization המושרה-לאור קריפטוכרום ו CIB1 24. בדומה לכך, הרכב השומנים של קרום התא ניתן לשנות על ידי טרנסלוקציה אור המושרה של phosphatases phosphoinositide קרום הפלזמה 25. יתר על כן, קטנות, רגישות לאור תרכובות כמו azobenzene chקונפורמציה Ange תלוי באורכי גל תאורה. ניתן להשתמש זה שינוי קונפורמציה להפעיל ערוצים מגודרים ליגנד או לשנות רכב שומנים בקרום 26, 27. תרכובות בכלוב יכול לשמש גם כדי לגרום פעילות הסלולר. עם זאת, ה- LED המשמשים את ההתקנה הנוכחית לא יכול לייצר מספיק אנרגיה עבור משחררות רפרוף; וכך, אופטימיזציות נוספות של המערכת נחוצות סביר. עם זאת, היישומים של כלי אור-activatable אלה הם אירועים הסלולר גמישים-רבים יכולים להיגרם על ידי בזק של אור. &quot;פלאש-ו-הקפאה&quot; יכול ללכוד את הדינמיקה הקרום המתקבל. ישנן שתי מגבלות עיקריות לשיטת &quot;פלאש-ו-ההקפאה&quot;. ראשית, היא לוכדת &quot;תמונות&quot; של אירוע מסוים מתאים שונים. במילים אחרות, לא ניתן לעקוב הדינמיקה הממברנה בתא אחד על פני תקופה של זמן. לפיכך, לבנייה מחדש של כל הסלולר אפילוt, אחד חייב לרכוש ולנתח מספר רב של תמונות מכל מדגם ו בכל נקודת זמן. יתר על כן, בנוירונים, למספר גדול אף יותר של תמונות יש צורך, שכן שילוב של שלפוחית סינפטית לוקח רק במקומות 20 - 30% של סינפסות ב נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 18, 28. הניתוח של נתונים כזה גדול דורש כמויות עצומות של זמן. בעתיד, רכישת תמונה וניתוח צריכים להיות אוטומטית על מנת להפוך את הגישה יעילה יותר 29, 30. המגבלה השנייה היא שהטיל הטבע של טכניקת ההקפאה בלחץ גבוה. כאשר תאים להקפיא, מים הסלולר מארגנים מחדש כדי ליצור גבישי קרח אם שיעור המקפיא הוא מתחת 100 K / s 21. גבישי קרח אלו יכולים לחדור ממברנות או להתרכז מומס לשנות לחץ האוסמוטי מקומי, וכתוצאה מכך פקיעת קרומים. כדי למנוע גבישי קרח, בפולחץ h (~ 2000 ATM) מוחל על דגימות. בשל אפקט הקירור-העל, שיעור מקפיא של 100 K / s מספיק כדי למנוע מהמים ויוצרים גבישי קרח על הלחץ הזה 21. בתיאוריה, דגימות עבה כמו 500 מיקרומטר אפשר להקפיא בלי גבישי קרח, אבל כ 200 מיקרומטר צפוי הגבול המעשי, כמו צורות cuboidal קרח נוטים להיווצר רקמה עבה, להתפשר מורפולוגיה. כאשר עיבוד הדגימות עבות יותר 5 מיקרומטר, השימוש קריו-מגן ראוי, כגון BSA, יש צורך. עם זאת, BSA ישנה את osmolarity של הפתרון ועשוי להשפיע על התגובה הפיזיולוגית של תאים. לכן, ניסויים שליטה נרחבת נדרשים כדי לאמת את השימוש BSA במערכות בפרט. גבישי קרח יכול להיווצר גם לאחר הקפאה בלחץ גבוה אם דגימות מוסרים בטעות מן האמבט חנקן נוזלי. לכן, חשוב לשמור על הדגימות של החנקן הנוזלי בכל העת להשתמש במלקחיים טרום מקורריםלתפעל אותם. כאשר מתכננים ניסויים, שלוש הנקודות הבאות צריכות להיחשב. ראשית, העוצמת המקסימלי של אור (460 קו ננומטר) היא 5.5 - 8.0 mW / מ&quot;מ 2. אם האינטנסיביות הזו מספיקה כדי לגרום פעילות יש לוודא עם דימות תאים חיים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני ניסויים-ו-להקפיא פלאש. שנית, יש לבצע ניסויים בטמפרטורה פיזיולוגית. השלב מהמקפיא בלחץ גבוה מחומם עד 37 ° C עבור ניסויים עם נוירונים בהיפוקמפוס עכבר 31. לבסוף, בנקודות הזמן חייבות להיות שנבחרו בקפידה על מנת ללכוד את הדינמיקה הממברנה. מחקרים ראשוניים מציינים כי אנדוציטוזה תושלם לאחר 100 ms של גירוי. לפיכך, שלוש נקודות זמן נוסף (15, 30, 50 &amp; ms) נבדקו גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה קרום 17, 18. נקודות הזמן הללו היו דרושות כדי לחזות באירוע סחר קרוםים במהלך שידור סינפטי. עם זאת, הדרישה עבור מספר נקודות זמן שונה בכל אירוע הסלולר. לכן, כמה נקודות זמן צריכות להיות שנדגמו לפני ביצוע איסוף במערך גדול.

חזותי קרום וחלבון דינמיקה בתוך תא הוא צעד מפתח להבנת הביולוגיה של התא של תהליכים מסוימים. אירועי סחר דינמי ניתן ללכוד באמצעות מיקרוסקופ אור או פלואורסצנטי. עם זאת, בהקשר התת-תאי חסר בעיקר בתמונות מסוג זה משום מבני subcellular לא ניתן לחלוטין &quot;צבוע&quot; על ידי צבעים או בדיקות ניאון ו נפתרו מרחבית 1 ספקטרלית, 2. מצד השני, בעוד במיקרוסקופ אלקטרונים יכול להתוות ארכיטקטורה התת-תאי בפירוט יוצא דופן, זה לא יכול ללכוד דינמיקת סלולר, כי דגימות חייבות להיות קבועה לפני ההדמיה. לכן, זה בדרך כלל לא מספיק כדי להבין את הדינמיקה הסלולר לחלוטין באמצעות שיטת הדמיה יחידה. כדי להתגבר על המגבלות של אור במיקרוסקופ אלקטרונים, שיטות מיקרוסקופיה המצטרף פותחו. אור הקורלטיבי במיקרוסקופ אלקטרונים(קלם) מדמיין דינמיקה תאית באמצעות מיקרוסקופ אור ומבנים התת-תאי בסיסיים עם מיקרוסקופ אלקטרונים. בשנת קלם, תאים עוסקים בתהליכים שונים, כגון cytokinesis ו אנדוציטוזה 3, 4, 5, 6, הם חיות-צלם ולאחר מכן מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים. למרות קלם לוכד היבטים מסוימים של דינמיקה תאית, ישנם ארבעה גורמים המגבילים את התועלת של גישה זו. ראשית, ההחלטה הזמנית מוגבלת על ידי כמה יכול להיות משותקת התאים במהירות, אשר בדרך כלל לוקח שניות - דקות עקב דיפוזיה התגובה האיטית של fixatives 7. שנית, את ארכיטקטורת subcellular שנצפתה בדיעבד 8; לפיכך, השינויים מורפולוגיים הדינמיים לא ניתן ללכוד באמצעות גישה זו. שלישית, micrographs פלואורסצנטי אלקטרונים לא ניתן להתאים אותה בדיוק בגלל sh רקמותrinkage שנגרם על ידי התייבשות במהלך הכנת המדגם עבור במיקרוסקופ אלקטרונים 9, 10. הרביעית, אירועים כמו cytokinesis ו אנדוציטוזה אינם מתרחשים בעת ובעונה אחת בכל תא 5, 11, ובכך, תא מסוים עוסק האירוע חייב להיות מזוהה מאוכלוסייה גדולה של תאים. תהליך זה הוא לעתים קרובות מייגע. לפיכך, שיטה חדשה יש צורך לגרום לאירועים בפרט בכל תא כדי ללכוד את דינמיקת הסלולר וכתוצאה ידי הקיבוע המהיר של תאים בנקודות זמן מוגדרים. לאחרונה, מספר כלים פותחו כדי לגרום דינמיקה סלולר מסוימת באמצעות אור (optogenetics). Channelrhodopsin הוא ערוץ קטיון רגיש לאור, הלא סלקטיבי מבודד Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. כאשר channelrhodopsin מתבטאת neuronaממברנות l, הבהוב קל של אור מעורר זרם של יוני נתרן לתוך הנוירונים מפעיל פעולה 14 פוטנציאל, 15. פוטנציאל הפעולה ואז מתפשט לתוך מסופי הסינפטי, שבו שלפוחית סינפטית פתיל בתוך אלפיות 16, 17, 18 לכן, channelrhodopsin גורם פעילות עצבית. כדי לעקוב אחרי דינמיקת קרום במסופים הסינפטי, נוירונים חייב להיות משותק בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי עם דיוק ms. כדי ללכוד דינמיקת קרום לאחר גרימת פעילות עצבית, אנו מצמידים גירוי אור עם בלחץ גבוה מקפיא 17, 18, 19. הקפאה בלחץ גבוה מאפשר קיבוע כמעט מיידי של תאים עם היווצרות קרח קריסטל מופחת 20. גבישי קרח can להתפקע ממברנות ולשבש את הארכיטקטורה subcellular 21. על ידי שינוי מרווחי הזמן בין הגירוי והקפאה, סחר קרום בתוך מסופי הסינפטי נתפס בעקבות אינדוקציה של פוטנציאל פעולה. הנה, אנחנו מדגימים פרוצדורות באמצעות הקפאה בלחץ גבוה ממוסחרת כי זוגות שליטת ms זמנית של גירוי אור עם מקפיא בלחץ גבוה. בשונה מכשירים אחרים שדורשים בהתקן חיצוני כדי לשלוט גירוי אור והקפאה, גירוי אור משולב במלואו במערכת זו והוא יכול להיות מיושם עם דיוק ms 19. תהליך זה כרוך שלבים מרובים. 1) נוירונים בהיפוקמפוס עכבר מתורבתים על דיסקים ספיר נגוע lentivirus נושאת וקטור ביטוי עבור channelrhodopsin 18. 2) נוירונים הם מגורה קפוא בנקודות זמן מוגדרות לאחר גירוי. 3) המים המזוגגים הוא תחליףד עם ממס אורגני, ואילו שומנים וחלבונים הם צולבים ידי fixatives לשמר את הארכיטקטורה התאית. 4) הדגימות הם הסתננו ומוטבעי שרף אפוקסי. 5) סעיפים Ultrathin נאספים באמצעות ultramicrotome. 6) סעיפים Thin הם צילמו על מיקרוסקופ אלקטרונים חודרת. 7) תמונת רכישה וניתוח מבוצעים באופן עיוור לגבי נקודות זמן או גנוטיפים. דינמיקה סלולר ניתן לקבוע באמצעות שחזור של תמונות הזמן נפתר 17, 18. הכנת דוגמאות (שלבים 2 - 5 לעיל) מחייב שבוע, אך בניתוח התמונה העוקב דורש חודשים עד שנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

שנת תאי אדריכלות הקרום והפצת חלבון שלהם כל זמן, אבל זה מאוד קשה לדמיין את האירועים האלה ברזולוציה של זמן ומרחב על סדר ms ו ננומטר, בהתאמה. פיתחנו טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים זמן לפתור, &quot;פלאש-ו-הקפאה,&quot; כי גורם אירועים הסלולר עם optogenetics ו &#39;ממחיש את הדינמיקה הקרום המתקבל על ידי הקפאת תאים בנקודות זמן מוגדר לאחר גירוי. כדי להדגים את הטכניקה הזו, הבענו channelrhodopsin, ערוץ קטיון רגיש לאור, ב נוירונים בהיפוקמפוס העכבר. בזק של אור מגרת פעילות עצבית וגורם לשחרור הנוירוטרנסמיטר ממסופי הסינפטי באמצעות השילוב של שלפוחית ​​סינפטית. גירוי optogenetic של נוירונים מצמיד עם מקפיא בלחץ גבוה כדי לעקוב אחרי שינויים מורפולוגיים במהלך שידור סינפטי. באמצעות מכשיר מסחרי, אנו כבשנו את השילוב של שלפוחית ​​סינפטית וההתאוששות של synaקרום שלפוחית ​​ptic. כדי להמחיש את השתלשלות האירועים, מערכי נתונים גדולים נוצרו וניתח באופן עיוור, שכן שינויים מורפולוגיים לוו בתאים שונים לאורך זמן. אף על פי כן, פלאש-ו-הקפאה מאפשרת ההדמיה של דינמיקת הממברנה ב micrographs אלקטרונים עם רזולוצית ms זמנית.

שימוש בפרוטוקול לעיל, ביצענו &quot;פלאש-ו-הקפאה&quot; ניסויים נוירונים בהיפוקמפוס העכבר להביע channelrhodopsin. נוירונים אלה הוקפאו או 15 מילישניות או 100 מילישניות לאחר תחילת האור. הראינו בעבר כי exocytosis ו אנדוציטוזה של שלפוחית סינפטית להתרחש מסופי הסינפטי על 15 מילישניות ונקודות זמן 100 ms, בהתאמה 18. אירועים אלה נתפסו בהצלחה במועדים המתאימים (איור 2), דבר המצביע על כך ניסויים פלאש-ו-הקפאה יכול להתבצע בהצלחה על במקפיא בלחץ גבוה מיוחדים שנבחרו (ראו טבלה של חומרים). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> איור 1. לדוגמא טוען ותכנות במקפיא בלחץ גבוה. א) שולחן טעינת מדגם של א-p גבוההמקפיא ressure. צלחת באמצע, המוצגים השיבוץ לפרטים מבניים, ממוקמת בעל קלם לטעינה מדגם. אחד הגלילים והחצי מושם בחלק התחתון של טבלת טעינת מדגם, והשני מחובר עם קליפ על המכסה העליון. לאחר המדגם הוא טעון, הצלחת באמצע נדחפה קדימה אל חץ הגליל התחתון ו שהמכסה סגורה ליזום את ההקפאה. B) הרכבת דגימה. דיסק הספיר המכיל נוירונים ממוקם היטב של הצלחת באמצע, עם צד התא פונה כלפי מעלה. טבעת 100 מיקרומטר מושמת ישירות מעל דיסק ספיר בתוך הבאר. ואז, דיסק ספיר ריק טבול תמיסת מלח פיזיולוגית ממוקם עם צד הפתרון למטה. בועות אוויר יש להימנע. לבסוף, טבעת 100 מיקרומטר וטבעת 400 מיקרומטר בנוחות ממוקמות מעל. כל נוזל נוסף מוסר עם נייר סינון. ג) הצלבה של קפסולה הטבעה עם דיסק ספיר שקוע שרף אפוקסי. סאפדיסק לשכור מושם בתחתית הקפסולה, עם צד התא כלפי מעלה ומכוסה שרף אפוקסי עבור חדירה והטבעה. D) תכנות במקפיא בלחץ גבוה עבור גירוי יחיד, 10 מילישניות. הדגימות קפואות 90 מילישניות לאחר דופק האור. E) תכנות במקפיא בלחץ גבוה עבור 10 גירויים ב 20 הרץ. הדגימות קפואות 5 מילישניות לאחר דופק האור האחרון. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> איור 2. ויזואליזציה של Exocytosis ו אנדוציטוזה ב עכבר נוירונים בהיפוקמפוס. נוירונים בהיפוקמפוס הם מגורה אחת קפוא במועדים המצוינים. Micrographs אלקטרונים להראות exocytosis של שלפוחית סינפטית) ו אנדוציטוזה מהיר <sטרונג&gt; B). PSD, צפיפות פוסט-סינפטי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

פתחנו שיטה חדשנית במיקרוסקופ אלקטרונים, &quot;פלאש-ו-הקפאה,&quot; המאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה הממברנה עם רזולוצית ms זמנית. טכניקה זו משלבת את גירוי optogenetic של נוירונים עם מקפיא בלחץ גבוה. הנה, אנחנו מדגימים את הנהלים לתאר את הפרוטוקולים בפירוט.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

מתאם Confocal ו3D מיקרוסקופית אלקטרונים של תא חושי ספציפי

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא ולמחקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...