Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
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この作品は、ジョンズホプキンス大学（SW）からの資金によってサポートされていました。私たちは、彼らの技術支援のための医学顕微鏡施設のジョンズホプキンス大学に感謝します。私たちは、エリックヨルゲンセンとクリスチャン・ローズンマンドと技術の発展のために自分の研究室のメンバーに感謝します。私たちは、最初のデバイスの設計のためのM. ウェイン・デイビス感謝します。私たちは、彼らの技術支援のためにポール・ワージンガー、クベータ・トモバ、およびDelgermaa Luvsanjavに感謝します。また、原稿の彼らの重要な読書のためにナタリー・R.ハミルトンとグラント・F・クジック感謝します。

<ol>
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この記事のオープンアクセス出版は、ライカMikrosysteme社が主催ました。

「フラッシュおよび凍結」のアプローチは、光遺伝学で、特定の細胞事象を誘導することにより刺激19の後に定義された時点で細胞を凍結することにより、膜のダイナミクスを可視化します。このデモでは、我々は、神経細胞を刺激するために、チャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを使用し、シナプス末端で融合し、シナプス小胞の回復を捕獲しました。近年では、多くの光遺伝学的ツールは、フラッシュおよび凍結と互換性があるすべては、23、22を開発されています。例えば、オルガネラ輸送はクリプトとCIB1 24の光誘起ヘテロを用いて誘導することができます。同様に、原形質膜の脂質組成は、原形質膜25ホスホイノシチドホスファターゼの光誘起転座によって変化させることができます。また、アゾベンゼンCHような小さな、光感受性化合物照明波長に応じアンジュコンホメーション。このコンホメーション変化は、リガンド依存性チャネルを活性化するか、または膜26,27における脂質組成を変更するために使用することができます。ケージド化合物はまた、細胞活性を誘導するために使用することができます。しかし、現在のセットアップに使用されるLEDはアンケージングのために十分なエネルギーを生成しないことができます。このように、システムのさらなる最適化はおそらく必要です。それにもかかわらず、これらの光活性化ツールの用途は柔軟-多くの細胞事象は、光のフラッシュによって誘導することができるしています。 「フラッシュと凍結は、」得られた膜のダイナミクスをキャプチャすることができます。 「フラッシュおよび凍結」方法には2つの主な制限があります。まず、それは別の細胞から特定のイベントの「スナップショット」をキャプチャします。言い換えれば、時間をかけて一つのセル内膜のダイナミクスを追跡することはできません。このように、あらゆる細胞の再構築のためにもT、一つは各試料から、各時点で多数の画像を取得し、分析しなければなりません。マウス海馬ニューロンにおけるシナプスの30％の18、28 -シナプス小胞の融合がわずか20に場所を取るので、ニューロンにおいて、画像のより大きな数が必要です。このような大規模なデータセットの分析は、時間の膨大な量を必要とします。将来的には、画像取得と解析が29、30のアプローチは、より効率的にするために自動化する必要があります。 第2の制限は、高圧凍結技術の性質によって課されます。細胞が凍結するとき、細胞水が凍結速度は100 K / sの21未満である場合に氷結晶を形成するために再配置します。これらの氷晶は、膜を貫通または膜の破裂をもたらす、局所浸透圧を変えるための溶質を濃縮することができます。氷の結晶を避けるために、HIGH圧力（約2,000気圧）試料に適用されます。過冷却効果により、100 K /秒の凍結速度は、この圧力21で氷晶の形成から水を防止するのに十分です。理論的には、試験片として厚さ500μmの氷結晶なしで凍結することができるが、氷の立方体の形態が形態を損なう、厚い組織に形成される傾向があるように200μm程度は、おそらく実用的限界です。 5ミクロンより厚い試料を処理するときに、BSAなどの適切な凍結保護剤の使用は、必要です。しかし、BSAは、溶液の浸透圧を変化させると、細胞の生理学的応答に影響を及ぼし得ます。したがって、広範囲の対照実験は、特定のシステムにおけるBSAの使用を検証するために必要とされます。試料は誤っ液体窒素浴から除去された場合に氷結晶はまた、高圧凍結後に形成することができます。このように、すべての回で、液体窒素中に標本を維持するとの予冷した鉗子を使用することが重要ですそれらを操作。 実験を計画する場合は、以下の3点を考慮する必要があります。 8.0ミリワット/ mm 2で-まず、光の最大強度（460 nmのライン）が5.5です。この強度は活性を誘導するのに十分であるかどうかをフラッシュし、凍結実験に先立って、蛍光顕微鏡でのライブセルイメージングを用いて検証する必要があります。第二に、実験は、生理的な温度で行われなければなりません。高圧フリーザーの段階は、マウス海馬ニューロン31との実験のために37℃まで加温します。最後に、時間ポイントは慎重にメンブレンダイナミクスをキャプチャするために選択されなければなりません。初期の研究は、エンドサイトーシスが刺激の100ミリ秒後に完了していることが示されました。したがって、三つの追加の時点（15、30、および50ミリ秒）は、膜ダイナミクス17、18に従うように調べました。これらの時点は膜輸送のイベントを可視化するために必要でしたシナプス伝達中の。しかしながら、時間点の数のための要件は、各細胞事象で異なります。そのため、いくつかの時点では大規模なデータセットの収集を開始する前にサンプリングする必要があります。

細胞内膜およびタンパク質動態を可視化することは、特定のプロセスの細胞生物学を理解することに向けた重要なステップです。ダイナミックな人身売買のイベントは、光や蛍光顕微鏡を用いて撮影することができます。細胞内構造は完全に色素または蛍光プローブにより「塗装」と空間的およびスペクトル1,2解決できないのでしかし、細胞内のコンテキストは、主にこのような画像に欠けています。電子顕微鏡は、絶妙な詳細に亜細胞アーキテクチャを描くことができながら、試料を撮像する前に固定しなければならないので、一方、それは、細胞ダイナミクスを捕捉することができません。したがって、典型的には、完全にのみ1つの撮像モダリティを使用して細胞のダイナミクスを理解するのに十分ではありません。 光と電子顕微鏡の限界を克服するために、相関顕微鏡技術が開発されています。相関光と電子顕微鏡（CLEM）は、光学顕微鏡と電子顕微鏡との根本的な細胞内構造を使用して細胞内動態を可視化します。 CLEMでは、そのような分裂およびエンドサイトーシス3、4、5、6のような様々なプロセス、に従事した細胞は、ライブ画像化され、その後、電子顕微鏡のために処理されます。 CLEMは、細胞内ダイナミクスの特定の側面をキャプチャしますが、このアプローチの有用性を制限する4つの要因があります。固定剤7の遅い拡散および反応による分-まず、時間分解能は、細胞は、典型的には、Sをとる、固定化することができる方法を迅速によって制限されます。第二に、細胞内のアーキテクチャは、8 事後観察されます。従って、動的形態学的変化は、このアプローチを使用してキャプチャすることができません。第三に、蛍光および電子顕微鏡写真は、正確に起因する組織SHに整列することはできません電子顕微鏡9、10のためのサンプル調製時の脱水によって引き起こさrinkage。第四に、細胞質分裂およびエンドサイトーシスなどのイベントは、すべてのセル5、11で同時に行われていない、ため、イベントに従事している特定の細胞は、細胞の大集団から識別されなければなりません。このプロセスは、多くの場合、面倒です。従って、新しい方法は、すべてのセル内の特定のイベントを誘発することと定義された時点での細胞の急速な固定化によって得られた細胞ダイナミクスを捕捉する必要があります。 最近、いくつかのツールは、光（光遺伝学）を使用して、特定の細胞動態を誘導するために開発されています。チャネルロドプシンは、 コナミドリムシ 12、13から単離された感光性、非選択的カチオンチャネルです。チャネルロドプシンはneuronaで発現された場合L膜は、光の短いフラッシュは、ニューロンへのナトリウムイオンの流入を誘導し、14、15の潜在的作用を誘発します。活動電位は、その後、シナプス小胞18はしたがって、チャネルロドプシンは、神経活動を誘導し、ミリ16、17内に融合シナプス末端へ伝播します。シナプス末端膜のダイナミクスを追跡するために、ニューロンはミリ秒精度での刺激後に定義された時点で固定化されなければなりません。 神経活動を誘導した後の膜のダイナミクスをキャプチャするために、我々は、高圧凍結17、18、19で光刺激を結合しました。高圧凍結を低減氷晶形成20を有する細胞のほぼ瞬間的固定化を可能にします。氷の結晶CAN膜を破裂させ、細胞内のアーキテクチャ21を混乱させる。刺激および凝固の間の時間間隔を変化させることにより、シナプス端末内膜輸送は、活動電位の誘導後に捕捉しました。 ここでは、そのカップル、高圧凍結と光刺激のミリ秒時間的な制御を商品化し、高圧の冷凍庫を使用して実験手順を示しています。光刺激及び凝固を制御する外部装置を必要とする他の機器とは異なり、光刺激は完全にこのシステムに統合され、MSの精度19を適用することができます。このプロセスは複数のステップを必要とします。 1）マウスの海馬ニューロンは、サファイアディスク上で培養し、チャネルロドプシン18のための発現ベクターを保有するレンチウイルスに感染しています。 2）ニューロンが刺激され、刺激後定義された時点で凍結されています。 3）ガラス化水で代替され有機溶媒とD、脂質及びタンパク質は、細胞内のアーキテクチャを維持するために固定剤によって架橋されています。 4）サンプルをエポキシ樹脂に浸透し、埋め込まれています。 5）超薄切片をウルトラミクロトームを使用して収集されます。 6）薄切片を透過型電子顕微鏡で撮像されます。 7）画像取得及び分析は、時間点又は遺伝子型に対して盲目的に行われます。細胞動態は、時間分解画像17、18の再構成によって決定することができます。サンプル調製は、（2ステップ - 上記5）の週が必要ですが、その後の画像解析は、年に数ヶ月を要します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

細胞は、絶えず彼らの膜構造およびタンパク質分布を変更するが、それぞれ、MSおよびナノメートルのオーダーの時間および空間分解能でこれらのイベントを視覚化することは極めて困難です。私たちは、光遺伝学と細胞事象を誘導し、刺激後定義された時点で細胞を凍結することにより得られた膜の動態を可視化する時間分解電子顕微鏡技術、「フラッシュや凍結を」を開発しました。この技術を実証するために、我々は、マウスの海馬ニューロンにおけるチャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを発現しました。光のフラッシュは、ニューロン活動を刺激し、シナプス小胞の融合を介してシナプス終末からの神経伝達物質の放出を誘発します。ニューロンの光遺伝学的刺激は、シナプス伝達中の形態学的変化に追従して高圧凍結に連結されています。商業用器具を用いて、我々は、シナプス小胞の融合とSYNAの回復を捕獲しましたPTIC小胞膜。形態学的変化を時間をかけて別の細胞に続いていたので、一連のイベントを可視化するために、大規模なデータセットは、生成され、盲目的に分析しました。それにもかかわらず、フラッシュや凍結はミリ秒の時間分解能を持つ電子顕微鏡写真でメンブレンダイナミクスの可視化を可能にします。

上記のプロトコルを使用して、我々は、チャネルロドプシンを発現するマウス海馬神経細胞に「フラッシュおよび凍結」の実験を行いました。これらのニューロンは、光発症後15ミリ秒または100ミリ秒のいずれかを凍結しました。我々は以前に18それぞれ、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、15ミリ秒と100ミリ秒の時点でシナプス末端で起こることを示しています。これらのイベントは、正常にフラッシュおよび凍結実験がうまく選択を行うことができることを示唆し、適切な時間（ 図2）で撮影した（ 材料の表を参照）高圧フリーザーを専門。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> 高圧冷凍庫図1.サンプル・ロードとプログラミング。高PのA）サンプルローディングテーブルressure冷凍庫。構造の詳細は、挿入図に示す中間プレートは、サンプルローディング用クレム・ホルダー内に配置されます。半円筒の一つは、試料載置台の底部に配置され、他方はトップカバーにクリップで取り付けられています。サンプルがロードされると、中間プレートは、底部半円筒に前方に押され、カバーが凍結を開始するために閉じられます。 B）試料のアセンブリ。ニューロンを含むサファイアディスクは、細胞側を上に向けて、中間プレートのウェル内に配置されます。 100μmの環が直接ウェル内部サファイアディスクの上方に配置されています。その後、生理食塩水に浸漬空サファイアディスクは溶液側と下方に配置されます。気泡は避けなければなりません。最後に、100μmのリングと400μmのリングがぴったりと上方に配置されています。余分な液体を濾紙で除去されます。 C）エポキシ樹脂に浸漬サファイアディスクと埋め込みカプセルの断面図。 SAPP雇うディスクは、細胞側を上に向けて、カプセルの底に配置され、浸潤および埋め込み用エポキシ樹脂で覆われています。単一、10ミリ秒の刺激のための高圧フリーザープログラミングD）。標本は、90ミリ秒の光パルスの後に凍結されています。 E）20 Hzで10の刺激のための高圧フリーザーのプログラミング。標本は5ミリ秒、最後の光パルスの後に凍結されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> マウスの海馬神経細胞におけるエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの2可視化図。海馬の神経細胞は一度刺激され、示された時間で凍結されています。電子顕微鏡写真は、シナプス小胞Aのエキソサイトーシス）及び超高速エンドサイトーシスを表示します<strong&gt; B）。 PSD、シナプス後密度。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

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Research

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Biology

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高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

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超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

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