Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
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Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Universidade Johns Hopkins (SW). Agradecemos ao Johns Hopkins School of Medicine Microscope Facility pelo apoio técnico. Agradecemos Erik Jorgensen e Christian Rosenmund e membros de seus laboratórios para o desenvolvimento da técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para o design do dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova, e Delgermaa Luvsanjav por sua assistência técnica. Agradecemos também a Natalie R. Hamilton e Grant F. Kusick por sua leitura crítica do manuscrito.

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A abordagem de &quot;flash-e-congelamento&quot; visualiza a dinâmica da membrana através da indução de um evento celular particular com Optogenetics e por células em pontos de tempo definidos após estimulação congelação 19. Nesta demonstração, foi utilizado channelrodopsina, um canal de catiões sensível à luz, para estimular os neurónios e capturado a fusão e a recuperação das vesículas sinápticas nos terminais sinápticos. Nos últimos anos, muitas ferramentas optogenética foram desenvolvidos 22, 23, todos os quais são compatíveis com flash-e-congelamento. Por exemplo, o tráfico organelo pode ser induzida utilizando a heterodimerização induzida por luz do criptocromo e CIB1 24. Da mesma forma, a composição lipídica da membrana plasmática podem ser alteradas pela translocação induzida pela luz de fosfatases Phosphoinositide para a membrana plasmática 25. Além disso, pequenas, compostos sensíveis à luz, como ch azobenzenoange conformação dependendo dos comprimentos de onda de iluminao. Esta alteração conformacional pode ser usado para activar os canais dependentes de ligandos ou para alterar a composição de lípidos na membrana 26, 27. compostos enjaulados também pode ser utilizado para induzir a actividade celular. No entanto, o LED usado na configuração atual não pode produzir energia suficiente para uncaging; Assim, outras optimizações do sistema são provavelmente necessário. No entanto, as aplicações dessas ferramentas luz-activáveis ​​são eventos celulares flexíveis-muitos pode ser induzida por um flash de luz. &quot;Flash-e-congelamento&quot; pode capturar a dinâmica de membrana resultantes. Existem duas principais limitações para o método &quot;flash-e-congelamento&quot;. Primeiro, ele capta &quot;instantâneos&quot; de um evento em particular a partir de células diferentes. Em outras palavras, não é possível seguir a dinâmica da membrana de uma célula ao longo de um período de tempo. Assim, para a reconstrução de qualquer celular mesmot, deve-se adquirir e analisar um grande número de imagens de cada amostra e em cada ponto de tempo. Além disso, em neurónios, um número ainda maior de imagens é necessário, uma vez que a fusão de vesículas sinápticas leva apenas lugares em 20 - 30% das sinapses em neurónios do hipocampo do rato 18, 28. A análise de um grande conjunto de dados, tais requer enormes quantidades de tempo. No futuro, aquisição e análise de imagem precisa ser automatizado para fazer a abordagem mais eficiente 29, 30. A segunda limitação é imposta pela natureza da técnica de congelamento de alta pressão. Quando as células congelação, a água celular rearranja para formar cristais de gelo se a velocidade de congelação é abaixo de 100 K / s 21. Estes cristais de gelo podem penetrar as membranas ou concentrar solutos para alterar a pressão osmótica local, resultando na ruptura das membranas. Para evitar cristais de gelo, high Pressão (~ 2,000 atm) é aplicado às amostras. Devido ao efeito de super-arrefecimento, uma velocidade de congelação de 100 K / s é suficiente para evitar que a água se formem cristais de gelo a esta pressão 21. Em teoria, as amostras tão espessa quanto a 500? M podem ser congelados sem cristais de gelo, mas cerca de 200 um é provavelmente o limite prático, como formas cubóides de gelo tenderem a formar no tecido grosso, comprometer a morfologia. Quando o processamento de amostras mais espessa do que 5? M, a utilização de um crio-protector adequado, tal como BSA, é necessária. No entanto, BSA irá alterar a osmolaridade da solução e pode afectar a resposta fisiológica de células. Portanto, extensas experiências de controlo são necessários para validar a utilização de BSA em sistemas particulares. Os cristais de gelo também podem formar após congelamento de alta pressão, se os espécimes serem acidentalmente removidas do banho de azoto líquido. Assim, é crítico para manter os espécimes em azoto líquido em todos os momentos e para utilizar uma pinça pré-arrefecida atémanipulá-los. Ao planejar experimentos, os três seguintes pontos devem ser considerados. Em primeiro lugar, a intensidade máxima de luz (a linha de 460 nm) é 5,5-8,0 mW / mm 2. Se esta intensidade suficiente para induzir a actividade deve ser verificada com o processamento de imagem de células vivas em um microscópio de fluorescência antes das experiências de flash-e-congelante. Em segundo lugar, as experiências devem ser realizadas à temperatura fisiológica. A fase do congelador de alta pressão é aquecido até 37 ° C para as experiências com os neurónios do hipocampo do rato 31. Finalmente, os pontos de tempo devem ser cuidadosamente escolhidos para capturar a dinâmica de membrana. Estudos iniciais indicaram que a endocitose é completa após 100 ms de estimulação. Assim, três pontos de tempo adicionais (15, 30, e 50 ms) também foram examinados a seguir a dinâmica da membrana 17, 18. Estes pontos de tempo foram necessários para visualizar evento tráfico de membranas durante a transmissão sináptica. No entanto, a exigência para o número de pontos de tempo são diferentes em cada caso celular. Portanto, alguns pontos de tempo devem ser amostradas antes de iniciar coleção grande conjunto de dados.

A visualização dinâmica de membrana e de proteína dentro de uma célula é um passo chave para a compreensão da biologia celular de processos particulares. eventos de tráfico dinâmica pode ser capturado usando microscopia de luz ou fluorescência. No entanto, o contexto subcelular é largamente ausente em tais imagens porque as estruturas subcelulares não pode ser completamente &quot;pintado&quot; por corantes ou sondas fluorescentes e resolvidos espacialmente e espectralmente 1, 2. Por outro lado, enquanto a microscopia eletrônica pode delinear arquitetura subcelular com extraordinário pormenor, não pode capturar a dinâmica celular, porque as amostras devem ser fixados antes da imagem. Assim, normalmente não é suficiente para compreender completamente a dinâmica celular usando apenas uma modalidade de imagem. Para superar as limitações de microscopia óptica e eletrônica, técnicas de microscopia correlativas foram desenvolvidos. Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica(CLEM) visualiza dinâmica intracelulares usando microscopia de luz e estruturas subcelulares subjacentes com microscopia electrónica. Em CLEM, as células envolvidas em diversos processos, tais como a citocinese e endocitose 3, 4, 5, 6, são vivo-representada por imagem e depois processadas para microscopia electrónica. Embora CLEM captura certos aspectos da dinâmica intracelulares, existem quatro fatores que limitam a utilidade desta abordagem. Em primeiro lugar, a resolução temporal é limitada pela rapidez com que as células podem ser imobilizadas, o que normalmente demora s - min devido à difusão lenta e reacção de fixadores 7. Após a segunda, a arquitetura subcelular é observado facto 8; Assim, as alterações morfológicas dinâmicos não pode ser capturado usando esta abordagem. Em terceiro lugar, as micrografias de fluorescência e de electrões pode não ser precisamente alinhados devido ao tecido shrinkage causada por desidratação durante a preparação de amostras para microscopia electrónica de 9, 10. Em quarto lugar, eventos como citocinese e endocitose não acontecem ao mesmo tempo em todas as células 5, 11, e, portanto, uma célula em particular que está envolvida no evento devem ser identificados a partir de uma grande população de células. Este processo é muitas vezes trabalhosa. Assim, um novo método é necessário para induzir a eventos particulares em cada célula e para capturar a dinâmica celulares resultantes pelo rápido imobilização de células em momentos definidos. Recentemente, várias ferramentas foram desenvolvidas para induzir particulares dinâmica celular usando a luz (optogenética). Channelrodopsina é um canal de catiões sensível à luz, não-selectivo isolado a partir de Chlamydomonas reinhardtii, 12, 13. Quando channelrodopsina é expressa em neuronal membranas, uma breve flash de luz induz um influxo de iões de sódio em neurónios e dispara uma acção de potencial 14, 15. O potencial de acção propaga-se então nos terminais sinápticos, onde vesículas sinápticas fundem dentro de milissegundos 16, 17, 18 Por isso, channelrodopsina induz actividade neuronal. Para acompanhar a dinâmica da membrana nos terminais sinápticos, neurónios deve ser imobilizada em pontos de tempo definidos após a estimulação com precisão ms. Para capturar a dinâmica da membrana após a indução de actividade neuronal, que juntamente com a estimulação pela luz de alta pressão de congelação 17, 18, 19. Congelamento de alta pressão permite a imobilização quase instantânea de células com gelo reduzida formação de cristais 20. Cristais de gelo can romper membranas e perturbar a arquitectura subcelular 21. Ao variar os intervalos de tempo entre a estimulação e de congelação, o tráfico de membrana dentro de terminais sinápticos foi capturada após a indução de um potencial de acção. Aqui, demonstramos procedimentos experimentais utilizando um congelador de alta pressão comercializado que acopla um controlo temporal ms de estimulação luminosa com congelamento de alta pressão. Ao contrário de outros instrumentos que requerem um dispositivo externo para controlar o estímulo de luz e de congelação, a estimulação pela luz está completamente integrado no sistema e este pode ser aplicado com precisão ms 19. Este processo envolve várias etapas. 1) neurónios do hipocampo do rato são cultivados em discos de safira e infectadas com lentivírus transportando um vector de expressão para channelrodopsina 18. 2) Os neurónios são estimulados e congelou-se a pontos de tempo definidos após a estimulação. 3) A água é vitrificados substitutod com um solvente orgânico, enquanto que os lípidos e proteínas são reticuladas por fixadores para preservar a arquitectura intracelular. 4) As amostras estão infiltrados e embebidos em resina epoxi. 5) cortes ultrafinos são recolhidos usando um ultramicrotomo. 6) As lâminas são fotografadas num microscópio electrónico de transmissão. 7) aquisição e análise de imagem são realizados às cegas em relação a pontos de tempo ou genótipos. Dinâmica celular pode ser determinado através da reconstrução de imagens resolvidas no tempo 17, 18. A preparação da amostra (passos 2-5 acima) requer uma semana, mas a análise de imagem posterior requer meses a um ano.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

Células mudam constantemente a sua arquitectura membrana e distribuição de proteína, mas que é extremamente difícil de visualizar estes eventos com uma resolução temporal e espacial da ordem dos ms e nm, respectivamente. Nós desenvolvemos uma técnica resolvida no tempo microscopia electrónica, de &quot;flash-e-congelamento&quot;, que induz eventos celulares com Optogenetics e visualiza a dinâmica da membrana, resultando por congelação células em pontos de tempo definidos após a estimulação. Para demonstrar esta técnica, que expressa channelrodopsina, um canal de catiões sensível à luz, em neurónios do hipocampo de rato. Um relâmpago de luz estimula a actividade neuronal e induz a libertação de neurotransmissores a partir de terminais sinápticos através da fusão de vesículas sinápticas. A estimulação de neurónios optogenetic é acoplado com o congelamento de alta pressão para seguir alterações morfológicas durante a transmissão sináptica. Usando um instrumento comercial, nós capturamos a fusão das vesículas sinápticas e a recuperação da synamembrana da vesícula PTIC. Para visualizar a sequência de eventos, grandes conjuntos de dados foram gerados e analisados ​​cegamente, uma vez que as alterações morfológicas foram seguidos em células diferentes ao longo do tempo. No entanto, de flash-e-congelamento permite a visualização da dinâmica da membrana em micrografias electrónicas com resolução temporal ms.

Usando o protocolo acima descrito, foi realizada &quot;flash&quot; e por congelação experiências em neurónios do hipocampo de rato que expressam channelrodopsina. Estes neurónios foram congelados quer 15 ms ou de 100 ms após o aparecimento de luz. Foi anteriormente mostrado que a exocitose e endocitose de vesículas sinápticas ocorrem nos terminais sinápticos aos 15 ms e 100 ms de tempo pontos, respectivamente 18. Estes eventos foram capturados com sucesso nos momentos apropriados (Figura 2), sugerindo que as experiências de flash-e-congelamento pode ser realizado com sucesso no congelador de alta pressão especializado escolhido (ver a Tabela de Materiais). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Figura 1. Amostra Carregando e Programação na de alta pressão Freezer. A) Amostra mesa de carga de um p de altacongelador ressure. A placa intermédia, representada na inserção para o detalhe estrutural, está colocada num suporte de CLEM para o carregamento da amostra. Um dos meios-cilindros é colocado na parte inferior da mesa de carga da amostra, e o outro está ligado com um grampo para a tampa superior. Uma vez que a amostra é carregada, a placa intermédia é empurrado para a frente para o meio-cilindro inferior e a tampa é fechada para iniciar o congelamento. B) O conjunto de amostras. O disco de safira contendo neurónios é colocada no poço do prato do meio, com o lado voltado para cima célula. Um anel 100 um é colocado directamente por cima do disco de safira dentro do poço. Em seguida, um disco de safira vazio mergulhada em solução salina fisiológica é colocado com o lado da solução a abaixo. As bolhas de ar deve ser evitada. Finalmente, um anel 100 e um anel 400 um são confortavelmente colocado acima. Qualquer líquido extra é removido com papel de filtro. C) uma secção transversal de uma cápsula de encaixar com o disco de safira submerso em resina epoxi. o sappcontratar disco é colocada na parte inferior da cápsula, com o lado voltado para cima célula e coberto com resina epoxi, para a infiltração e a incorporação. D) A programação do congelador de alta pressão para uma única, 10 ms estímulo. As amostras são congeladas 90 ms após o pulso de luz. E) A programação do congelador de alta pressão, durante 10 a 20 Hz estímulos. As amostras são congeladas 5 ms após o último pulso de luz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> Figura 2. Visualização de exocitose e endocitose no rato neurônios do hipocampo. neurónios do hipocampo são estimulados uma vez e congeladas nos tempos indicados. Eletromicrografias mostrar a exocitose de uma vesícula sináptica A) e endocitose ultra-rápida <strong&gt; B). PSD, densidade pós-sináptica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Nós desenvolvemos uma nova técnica de microscopia electrónica, de &quot;flash-e-congelamento&quot;, que permite a visualização da dinâmica da membrana com ms resolução temporal. Esta técnica combina a estimulação optogenetic de neurónios com congelamento de alta pressão. Aqui, demonstramos os procedimentos e descrever os protocolos em detalhe.

Flash-e-Freeze: uma nova técnica para capturar Membrane Dynamics com Electron Microscopy

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