Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансирование из Университета Джона Хопкинса (SW). Мы благодарим Джона Хопкинса школы медицины Микроскоп фонда для оказания технической поддержки. Мы благодарим Эрика Йоргенсен и Крисчен Рознмунд и членов их лабораторий для развития техники. Мы благодарим М. Уэйн Дэвиса для разработки исходного устройства. Мы благодарим Пол Уерзингер, Квета Томова и Delgermaa Luvsanjav за техническую помощь. Мы также благодарим Натали Р. Гамильтон и Грант F Кьюзик за критическое прочтение рукописи.

<ol>
	<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500 (2015).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+microscopy+and+electron+microscopy.">Correlated light microscopy and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).</li><li>Redemann, S., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division.">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+reshaping+during+endocytosis+is+revealed+by+time-resolved+electron+tomography.">Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography.</a> Cell. 150 (3), 508-520 (2012).</li><li>Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+correlative+light-electron+microscopy+to+observe+molecular+dynamics+in+high+resolution.">Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution.</a> Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).</li><li>M&#252;ller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+of+Early+Caenorhabditis+elegans+Embryos+in+Mitosis.">Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis.</a> Cellular Electron Microscopy. 79, 101-119 (2007).</li><li>Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+virus-cell+interactions.">Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions.</a> FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).</li><li>Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage+of+freeze-dried+cryosections+of+cells:+Investigations+by+EFTEM+and+cryo-CLEM.">Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM.</a> Micron. 88, 77-83 (2016).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+after+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions.">Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> eLife. 2, e00723 (2013).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-and-Freeze:+Coordinating+Optogenetic+Stimulation+with+Rapid+Freezing+to+Visualize+Membrane+Dynamics+at+Synapses+with+Millisecond+Resolution.">Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution.</a> Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).</li><li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , (1987).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Weitzman, M., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+approaches+to+cell+migration+and+beyond.">Optogenetic approaches to cell migration and beyond.</a> Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).</li><li>Niu, J., Ben Johny, ., Dick, M., E, I., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+Optogenetic+Dimerizers+and+Quantitative+Prospects.">Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects.</a> Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).</li><li>van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+organelle+transport+and+positioning.">Optogenetic control of organelle transport and positioning.</a> Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).</li><li>Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+phosphoinositide+metabolism.">Optogenetic control of phosphoinositide metabolism.</a> Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).</li><li>Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+Lipid+Rafts+with+Photoswitchable+Ceramides.">Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides.</a> J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).</li><li>Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+probability+of+glutamate+release+at+a+hippocampal+synapse.">Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse.</a> Science. 262 (5134), 754-757 (1993).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li></ol>

Открытая публикация Доступ этой статьи была организована Leica Mikrosysteme GmbH.

«Флэш-и-замораживание» подход визуализирует динамику мембраны путем индукции конкретного клеточного события с оптогенетикой и путем замораживания клеток в определенные моменты времени после стимуляции 19. В этой демонстрации, мы использовали channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, чтобы стимулировать нейроны и захватили слияние и восстановление синаптических везикул в синаптических окончаниях. В последние годы многие оптогенетика инструменты были разработаны 22, 23, все из которых являются совместимыми с флэш-и замораживанию. Например, оборот органеллы может быть вызван с помощью светоиндуцированной гетеродимеризации криптохрома и CIB1 24. Кроме того , липидный состав плазматической мембраны может быть изменен светоиндуцированным транслокации фосфоинозитидного фосфатаза к плазматической мембране 25. Кроме того, небольшие, светочувствительные соединения, такие как азобензол чАнж конформации в зависимости от освещенности длин волн. Это конформационное изменение может быть использовано для активации лигандов каналов или для изменения липидного состава в мембране 26, 27. Caged соединение также может быть использовано для индукции клеточной активности. Тем не менее, индикатор, используемый в текущей установке не может производить достаточное количество энергии для uncaging; Таким образом, дальнейшие оптимизации системы, скорее всего, это необходимо. Тем не менее, применение этих светло-активируемых инструментов являются гибкими-многими клеточными события могут быть вызваны вспышкой света. «Flash-и замораживание» могут захватить получившуюся динамику мембраны. Есть два основных ограничения метода «флэш-и-сублимационной». Во-первых, она захватывает «снимки» конкретного события из разных клеток. Другими словами, это не представляется возможным наблюдать за динамикой мембраны в одной камере в течение определенного периода времени. Таким образом, для восстановления любой сотовой связи дажет, необходимо приобретать и анализировать большое количество изображений из каждого образца и в каждый момент времени. Кроме того, в нейронах, еще большее количество изображений , необходимо, так как слияние синаптических везикул только занимает места в 20 - 30% синапсов в нейронах гиппокампа мыши 18, 28. Анализ такого большого набора данных требует огромного количества времени. В дальнейшем, для сбора и анализа изображения должны быть автоматизированы , чтобы сделать подход более эффективным , 29, 30. Второе ограничение накладывается по характеру техники замораживания высокого давления. Когда клетки замерзают, клеточная вода перестраивает с образованием кристаллов льда , если скорость замораживания ниже 100 К / с 21. Эти кристаллы льда могут проникать мембраны или концентрат растворенных веществ, чтобы изменить местное осмотическое давление, что приводит к разрыву мембраны. Для того, чтобы избежать кристаллов льда, HIGч Давление (~ 2000 атм) применяется к образцам. Из - за супер-охлаждения эффект, морозильную скорость 100 К / с достаточно , чтобы вода не образуя кристаллы льда , при этом давлении 21. В теории, образцы толщиной 500 мкм, могут быть заморожены без кристаллов льда, но примерно 200 мкм, скорее всего, практический предел, поскольку кубовидные формы льда имеют тенденцию к образованию в толстой ткани, ставя под угрозу морфологию. При обработке образцов толщины более 5 мкм, использование надлежащего крио-протравитель, таких, как БС, необходимо. Однако БС изменит осмолярность раствора и может повлиять на физиологическую реакцию клеток. Таким образом, обширные контрольные эксперименты необходимы для проверки использования БСА в конкретных системах. Кристаллы льда могут также образовывать после замораживания высокого давления, если образцы случайно извлекают из ванны с жидким азотом. Таким образом, крайне важно, чтобы держать образцы в жидком азоте в любое время и использовать предварительно охлажденные щипцыманипулировать ими. При планировании экспериментов, следующие три точки должны быть рассмотрены. Во- первых, максимальная интенсивность света (460 нм линия) составляет 5,5 - 8,0 мВт / мм 2. Независимо от того, достаточно, чтобы вызвать активность этой интенсивности должны быть проверено с живыми клетками на флуоресцентный микроскопе до начала вспышки и ЗАМЕРЗАНИЕ экспериментов. Во-вторых, эксперименты должны быть выполнены при физиологической температуре. Этап морозильной камеры высокого давления нагревают до 37 ° C для экспериментов с мыши нейронов гиппокампа 31. И, наконец, моменты времени должны быть тщательно подобраны, чтобы уловить динамику мембраны. Первоначальные исследования показали, что эндоцитоз завершается через 100 мс стимуляции. Таким образом, три дополнительных временных точках (15, 30, и 50 мс) были также исследованы , чтобы проследить динамику мембраны 17, 18. Эти моменты времени были необходимы, чтобы визуализировать события мембранныхы во время синаптической передачи. Тем не менее, требование в отношении количества временных точек различны в каждом клеточном случае. Таким образом, несколько моментов времени должны быть выбраны до начала большого сбора набора данных.

Визуальные мембраны и белки динамики в клетке является ключевым шагом на пути к пониманию клеточной биологии отдельных процессов. события Dynamic торговли людьми могут быть получены с помощью света или флуоресцентной микроскопии. Однако субклеточная контекст практически отсутствует в таких изображениях , поскольку субклеточные структуры не могут быть полностью «нарисованной» с помощью красителей или флуоресцентных зондов и решены пространственно и спектрально 1, 2. С другой стороны, в то время как электронная микроскопия может очертить внутриклеточную архитектуру в мельчайших деталях, он не может захватить клеточную динамику, потому что образцы должны быть исправлены до получения изображения. Таким образом, как правило, не достаточно, чтобы полностью понять клеточной динамики, используя только один модальности изображений. Для того, чтобы преодолеть ограничения, световой и электронной микроскопии, были разработаны корреляционные методы микроскопии. Корреляционная световой и электронной микроскопии(CLEM) визуализирует динамику внутриклеточной с помощью световой микроскопии и лежащих в основе субклеточных структуры с электронной микроскопией. В CLEM, клетка , занятая в различных процессах, такие как цитокинез и эндоцитоз 3, 4, 5, 6, находятся под напряжением, отображаемый , а затем обработаны для электронной микроскопии. Хотя CLEM отражает некоторые аспекты внутриклеточной динамики, есть четыре фактора, которые ограничивают полезность этого подхода. Во- первых, временное разрешение ограничено , как быстро клетки могут быть иммобилизованы, который обычно занимает с - мин из - за медленной диффузии и реакции фиксаторов 7. Во- вторых, наблюдается субклеточная архитектура постфактум 8; Таким образом, динамические морфологические изменения не могут быть получены с помощью этого подхода. В-третьих, флуоресценции и электронные микрофотографии не могут быть точно выровнены за счет ш тканиrinkage вызвано обезвоживанием во время подготовки образца для электронной микроскопии 9, 10. В- четвертых, такие события , как цитокинеза и эндоцитоза не происходят в то же время в каждой ячейке 5, 11, и , таким образом, конкретная ячейка , которая занимается в том случае должны быть определены из большого числа клеток. Этот процесс часто трудоемкий. Таким образом, новый метод необходимо вызывать определенные события в каждой клетке и захватить в результате клеточной динамики от быстрой иммобилизации клеток в определенных временных точках. В последнее время несколько инструментов, которые были разработаны, чтобы вызвать определенные клеточные динамики с использованием света (оптогенетика). Channelrhodopsin является светочувствительным, неселективный катионом канал изолирован от Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Когда channelrhodopsin выражается в neuronaл мембраны, кратко вспышка света вызывает приток ионов натрия в нейроны и вызывает действие потенциала 14, 15. Потенциал действия затем распространяется в синаптические окончания, где синаптические пузырьки сливаются в течение миллисекунд 16, 17, 18 Таким образом, channelrhodopsin индуцирует активность нейронов. Для того, чтобы следовать за динамикой мембраны при синаптических окончаниях, нейроны должны быть иммобилизованы в определенные моменты времени после стимуляции мса точности. Для того, чтобы захватить динамику мембран после индукции нейронной активности, мы в сочетании световой стимуляции с замораживанием 17, 18, 19 высоким давлением. Замораживание высокого давления позволяет почти мгновенную иммобилизации клеток с образованием кристаллов уменьшенного льдом 20. Кристаллы льда чп разрыва мембраны и нарушают внутриклеточную архитектуру 21. Изменяя интервалы времени между стимуляцией и замораживанием, оборот мембраны в пределах синаптических окончаний было захвачен после индукции потенциала действия. Здесь авторы демонстрируют экспериментальные процедуры с использованием фризера на коммерческую основу под высоким давлением, что пары в мс временной контроль световой стимуляции с замораживанием высокого давления. В отличие от других инструментов , которые требуют внешнего устройства для управления светом стимуляции и замораживание, световая стимуляция полностью интегрирована в этой системе , и может быть применен с точностью 19 мс. Этот процесс включает в себя несколько этапов. 1) гиппокамп мыши нейроны культивируют на сапфировых дисках и инфицировали лентивирусы , несущий вектор экспрессии для channelrhodopsin 18. 2) Нейроны стимулируются и замораживали при определенных временных точках после стимуляции. 3) остеклованный вода заменительд с органическим растворителем, в то время как липиды и белки являются сшитыми с помощью фиксаторов, чтобы сохранить внутриклеточную архитектуру. 4) Образцы инфильтрация и заливали в эпоксидной смоле. 5) Ультратонкие срезы собирают с использованием ультрамикротома. 6) Тонкие секции отображается на просвечивающем электронном микроскопе. 7) сбор и анализ изображений выполняются вслепую относительно моментов времени или генотипов. Клеточная динамика может быть определена путем реконструкции времяразрешенных изображений 17, 18. Пробоподготовка (шаги 2 - 5 выше) требуется неделя, но последующий анализ изображений требует месяцев до года.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

Клетки постоянно меняют свою архитектуру мембран и распределение белка, но это чрезвычайно трудно визуализировать эти события при временным и пространственным разрешением порядка мс и нм, соответственно. Мы разработали с временным разрешением метода электронной микроскопии, «флэш-и-Фриз», который вызывает клеточные события с оптогенетикой и визуализирует полученную динамику мембран путем замораживания клеток при определенных временных точках после стимуляции. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы выразили channelrhodopsin, светочувствительный катионный канал, в нейронах гиппокампа мыши. Вспышка света стимулирует нейронную активность и индуцирует высвобождение нейромедиаторов из синаптических окончаний путем слияния синаптических везикул. Оптогенетика стимуляции нейронов в сочетании с замораживанием под высоким давлением, чтобы следовать морфологическим изменениям во время синаптической передачи. Используя коммерческий инструмент, мы захватили слияние синаптических везикул и восстановление synaptic пузырек мембраны. Для того, чтобы визуализировать последовательность событий, большие наборы данных были получены и проанализированы вслепую, так как морфологические изменения наблюдались в различных клетках с течением времени. Тем не менее, флэш-и-сублимационный позволяет визуализировать динамику мембран в электронных микрофотографиях с мс временным разрешением.

Используя методику, описанную выше, мы провели «флэш-и-заморозить» эксперименты в мышиных нейронов гиппокампа, экспрессирующих channelrhodopsin. Эти нейроны были заморожены либо 15 мс или 100 мс после начала светового. Ранее мы показали , что экзоцитоза и эндоцитоза синаптических везикул возникают в синаптических терминалов в 15 мс и 100 мс временных точек, соответственно 18. Эти события были успешно захвачены в соответствующие моменты времени (рисунок 2), предполагая , что флэш-и-Фриз эксперименты могут быть успешно выполнены на выбранную специализированную морозильной камере высокого давления (см Таблицы материалов). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Рисунок 1. Пример Загрузка и программирование в высоком давлении Freezer. А) Образец загрузка таблица высокого рия морозильник. Средняя пластина, показанная на вставке для структурных деталей, помещают в Клем Холдер для загрузки образца. Один из полуцилиндров помещаются в нижней части таблицы загрузки образца, а другой прикреплен с зажимом к верхней крышке. После того, как образец загружен, средняя пластина выдвигаются вперед к нижней половине цилиндра, а крышка закрыта, чтобы инициировать замораживание. В) Образец сборки. Сапфировый диск, содержащий нейроны помещают в лунку средней пластины, с клеткой-стороной вверх. кольцо А 100 мкм помещают непосредственно над сапфировым диском внутри скважины. Затем пустой диск сапфира, смоченный в физиологическом растворе помещает с раствором стороной вниз. Пузырьки воздуха следует избегать. И, наконец, кольцо 100 мкм и кольцо 400 мкм плотно размещены выше. Любая дополнительная жидкость удаляется с помощью фильтровальной бумаги. C) поперечное сечение вложения капсулы с сапфировым диском , погруженным в эпоксидной смоле. СаппПрокат диск помещается в нижней части капсулы, с клеткой-стороной вверх и покрыты эпоксидной смолой для инфильтрации и вложения. D) Программирование морозильной камеры высокого давления для одного, 10 мса стимула. Образцы замораживают 90 мс после того, как световой импульс. Е) Программирование морозильной камеры высокого давления в течение 10 стимулов при 20 Гц. Образцы замораживают 5 мс после последнего импульса света. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> Рисунок 2. Визуализация экзоцитоза и эндоцитоза в нейронах гиппокампа мыши. Гиппокамп нейроны стимулируются раз и замораживают в указанные моменты времени. Электронные микрофотографии показывают экзоцитоза синаптических везикул А) и сверхбыстрого эндоцитоз <sТронг&gt; В). СДП, пост-синаптической плотности. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Мы разработали новый метод в электронной микроскопии, «флэш-и-сублимационной», что позволяет визуализировать динамику мембран с мс временным разрешением. Эта техника сочетает в себе оптогенетику стимуляции нейронов с замораживанием под высоким давлением. Здесь мы продемонстрируем процедуру и описания протоколов в деталях.

Флэш-и-Фриз: Роман Техника для захвата мембраны динамика с электронной микроскопии

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Корреляционный конфокальной и 3D Электронная микроскопия конкретного чувственного Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Сканирующая электронная микроскопия из размоченной ткани для визуализации внеклеточный матрикс

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Миниатюрных Пробоподготовка для просвечивающей электронной микроскопии

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Метод CryoAPEX для анализа электронной микроскопии мембранного белка в ультраструктурно-заповедных клетках

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...