Name: flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos de la Johns Hopkins University (SW). Agradecemos a la Escuela Johns Hopkins de instalación de medicina microscopio por su apoyo técnico. Agradecemos a Erik Jorgensen y Christian Rosenmund y los miembros de sus laboratorios para el desarrollo de la técnica. Agradecemos a M. Wayne Davis para el diseño del dispositivo inicial. Agradecemos a Paul Wurzinger, Cveta Tomova y Delgermaa Luvsanjav por su asistencia técnica. Agradecemos también a Natalie R. Hamilton y Grant F. Kusick para su lectura crítica del manuscrito.

<ol>
	<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADVANCED+IMAGING.+Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics.">ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), aab3500 (2015).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Sjollema, K. A., Schnell, U., Kuipers, J., Kalicharan, R., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+microscopy+and+electron+microscopy.">Correlated light microscopy and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 111, 157-173 (2012).</li><li>Redemann, S., M&#252;ller-Reichert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+for+the+analysis+of+cell+division.">Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division.</a> Journal Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+reshaping+during+endocytosis+is+revealed+by+time-resolved+electron+tomography.">Plasma membrane reshaping during endocytosis is revealed by time-resolved electron tomography.</a> Cell. 150 (3), 508-520 (2012).</li><li>Kobayashi, S., Iwamoto, M., Haraguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+correlative+light-electron+microscopy+to+observe+molecular+dynamics+in+high+resolution.">Live correlative light-electron microscopy to observe molecular dynamics in high resolution.</a> Microscopy (Oxford, England). 65 (4), 296-308 (2016).</li><li>Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+the+rate+of+fixative+diffusion.">Reassessment of the rate of fixative diffusion.</a> J Clin Pathol. 45 (12), 1120-1121 (1992).</li><li>M&#252;ller-Reichert, T., Srayko, M., Hyman, A., O'Toole, E. T., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+Light+and+Electron+Microscopy+of+Early+Caenorhabditis+elegans+Embryos+in+Mitosis.">Correlative Light and Electron Microscopy of Early Caenorhabditis elegans Embryos in Mitosis.</a> Cellular Electron Microscopy. 79, 101-119 (2007).</li><li>Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A. G., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+virus-cell+interactions.">Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions.</a> FEBS Lett. 590 (13), 1877-1895 (2016).</li><li>Casanova, G., Nolin, F., Wortham, L., Ploton, D., Banchet, V., Michel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage+of+freeze-dried+cryosections+of+cells:+Investigations+by+EFTEM+and+cryo-CLEM.">Shrinkage of freeze-dried cryosections of cells: Investigations by EFTEM and cryo-CLEM.</a> Micron. 88, 77-83 (2016).</li><li>Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+after+transmitter+release+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Structural changes after transmitter release at the frog neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 88 (3), 564-580 (1981).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+Caenorhabditis+elegans+neuromuscular+junctions.">Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions.</a> eLife. 2, e00723 (2013).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+endocytosis+at+mouse+hippocampal+synapses.">Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses.</a> Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).</li><li>Watanabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash-and-Freeze:+Coordinating+Optogenetic+Stimulation+with+Rapid+Freezing+to+Visualize+Membrane+Dynamics+at+Synapses+with+Millisecond+Resolution.">Flash-and-Freeze: Coordinating Optogenetic Stimulation with Rapid Freezing to Visualize Membrane Dynamics at Synapses with Millisecond Resolution.</a> Front Synaptic Neurosci. 8, 24 (2016).</li><li>Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , (1987).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Weitzman, M., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+approaches+to+cell+migration+and+beyond.">Optogenetic approaches to cell migration and beyond.</a> Curr Opin Cell Biol. 30, 112-120 (2014).</li><li>Niu, J., Ben Johny, ., Dick, M., E, I., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+Optogenetic+Dimerizers+and+Quantitative+Prospects.">Following Optogenetic Dimerizers and Quantitative Prospects.</a> Biophys J. 111 (6), 1132-1140 (2016).</li><li>van Bergeijk, P., Adrian, M., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+organelle+transport+and+positioning.">Optogenetic control of organelle transport and positioning.</a> Nature. 518 (7537), 111-114 (2015).</li><li>Idevall-Hagren, O., Dickson, E. J., Hille, B., Toomre, D. K., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+phosphoinositide+metabolism.">Optogenetic control of phosphoinositide metabolism.</a> Proc Natl Acad of Sci U.S.A. 109 (35), E2316-E2323 (2012).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 544-552 (2009).</li><li>Frank, J. A., Franquelim, H. G., Schwille, P., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Control+of+Lipid+Rafts+with+Photoswitchable+Ceramides.">Optical Control of Lipid Rafts with Photoswitchable Ceramides.</a> J Am Chem Soc. 138 (39), 12981-12986 (2016).</li><li>Rosenmund, C., Clements, J. D., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+probability+of+glutamate+release+at+a+hippocampal+synapse.">Nonuniform probability of glutamate release at a hippocampal synapse.</a> Science. 262 (5134), 754-757 (1993).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28 (12), 2959-2964 (2008).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+regenerates+synaptic+vesicles+from+endosomes.">Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes.</a> Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).</li></ol>

Publicación de acceso abierto de este artículo fue patrocinado por Leica Mikrosysteme GmbH.

El enfoque de &quot;flash-y-congelación&quot; visualiza dinámica de la membrana mediante la inducción de un evento celular particular con la optogenética y mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación 19. En esta demostración, se utilizó canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, para estimular las neuronas y capturó la fusión y la recuperación de las vesículas sinápticas en los terminales sinápticas. En los últimos años, muchas herramientas optogenéticos se han desarrollado 22, 23, todos los cuales son compatibles con flash-y-congelación. Por ejemplo, el tráfico de orgánulo puede ser inducida mediante heterodimerización inducida por la luz de criptocromo y CIB1 24. Del mismo modo, la composición lipídica de la membrana plasmática puede ser alterado por la translocación inducida por la luz de las fosfatasas phosphoinositide a la membrana plasmática 25. Además, pequeñas, compuestos sensibles a la luz como ch azobencenoconformación ange dependiendo de las longitudes de onda de iluminación. Este cambio conformacional se puede utilizar para activar los canales activados por ligando o para cambiar la composición de lípidos en la membrana 26, 27. compuestos enjaulados también se pueden utilizar para inducir la actividad celular. Sin embargo, el LED se utiliza en la configuración actual no puede producir suficiente energía para uncaging; Por lo tanto, otras optimizaciones del sistema son probablemente necesario. Sin embargo, las aplicaciones de estas herramientas activable por luz son eventos celulares flexibles-muchos pueden ser inducidas por un destello de luz. &quot;Flash-y-congelación&quot; puede capturar la dinámica de membrana resultantes. Hay dos principales limitaciones para el método de &quot;destello y congelación&quot;. En primer lugar, se capta &quot;instantáneas&quot; de un evento en particular de diferentes células. En otras palabras, no es posible seguir la dinámica de la membrana en una celda durante un período de tiempo. Por lo tanto, para la reconstrucción de cualquier celular, inclusot, uno debe adquirir y analizar un gran número de imágenes de cada muestra y en cada punto de tiempo. Además, en las neuronas, un número aún mayor de las imágenes es necesario, ya que la fusión de las vesículas sinápticas solamente tiene lugar en 20 - 30% de las sinapsis en las neuronas del hipocampo del ratón 18, 28. El análisis de un gran conjunto de datos de este tipo requiere enormes cantidades de tiempo. En el futuro, la adquisición y análisis de imágenes necesitan ser automatizado para hacer el enfoque más eficiente 29, 30. La segunda limitación es impuesta por la naturaleza de la técnica de congelación de alta presión. Cuando las células se congelan, agua celular reorganiza para formar cristales de hielo si la velocidad de congelación es inferior a 100 K / s 21. Estos cristales de hielo pueden penetrar en las membranas o concentrarse solutos para alterar la presión osmótica local, dando como resultado la rotura de las membranas. Para evitar los cristales de hielo, high presión (~ 2,000 atm) se aplica a los especímenes. Debido al efecto de super-enfriamiento, una velocidad de congelación de 100 K / s es suficiente para evitar que el agua de formación de cristales de hielo a esta presión 21. En teoría, especímenes tan gruesa como de 500 micras se pueden congelar sin cristales de hielo, pero aproximadamente 200 micras es probable el límite práctico, como formas cúbicas de hielo tienden a formar en el tejido de espesor, comprometiendo la morfología. Cuando el procesamiento de muestras más gruesas que 5 m, el uso de un crio-protector adecuado, tal como BSA, es necesario. Sin embargo, BSA va a cambiar la osmolaridad de la solución y puede afectar la respuesta fisiológica de las células. Por lo tanto, se requieren extensos experimentos de control para validar el uso de BSA en sistemas particulares. Los cristales de hielo también se pueden formar después de la congelación de alta presión si los especímenes se retiran accidentalmente desde el baño de nitrógeno líquido. Por lo tanto, es crítico para mantener los especímenes en el nitrógeno líquido en todo momento y para el uso de fórceps preenfriado amanipularlos. Cuando la planificación de experimentos, los tres puntos siguientes deben ser considerados. En primer lugar, la intensidad máxima de la luz (la línea de 460 nm) es 5,5 a 8,0 mW / mm 2. Si esta intensidad es suficiente para inducir la actividad debe ser verificado con imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de los experimentos de inflamación y liofiliza. En segundo lugar, los experimentos deben realizarse a temperatura fisiológica. La etapa del congelador de alta presión se calienta hasta 37 ° C para los experimentos con las neuronas del hipocampo del ratón 31. Por último, los puntos de tiempo deben ser elegidos cuidadosamente para capturar la dinámica de la membrana. Los estudios iniciales indicaron que la endocitosis es completa después de 100 ms de estimulación. Por lo tanto, los tres puntos de tiempo adicionales (15, 30, y 50 ms) también fueron examinados para seguir la dinámica de la membrana 17, 18. Estos puntos de tiempo fueron necesarios para visualizar caso el tráfico de membranas durante la transmisión sináptica. Sin embargo, el requisito para el número de puntos de tiempo son diferentes en cada evento celular. Por lo tanto, algunos puntos de tiempo deben ser muestreados antes de iniciar la recogida de datos de gran tamaño.

Visualización dinámica de la membrana y proteínas dentro de una célula es un paso clave hacia la comprensión de la biología celular de procesos particulares. eventos de tráfico dinámico se pueden capturar usando la luz o microscopía de fluorescencia. Sin embargo, el contexto subcelular está en gran parte ausente en este tipo de imágenes porque las estructuras subcelulares no puede ser completamente &quot;pintadas&quot; por colorantes o sondas fluorescentes y resueltas espacialmente y espectralmente 1, 2. Por otro lado, si bien la microscopía electrónica puede delinear la arquitectura subcelular con exquisito detalle, no puede capturar la dinámica celular, ya que las muestras deben fijarse antes de la imagen. Así, es típicamente no es suficiente para entender completamente la dinámica celular usando solamente una modalidad de imagen. Para superar las limitaciones de la luz y microscopía electrónica, se han desarrollado técnicas de microscopía correlativos. Correlativa de luz y microscopía electrónica(CLEM) visualiza dinámica intracelular utilizando microscopía de luz y estructuras subcelulares subyacentes con microscopía electrónica. En CLEM, las células que participan en varios procesos, tales como la citocinesis y la endocitosis 3, 4, 5, 6, son-live imagen y luego procesados para microscopía electrónica. Aunque CLEM captura ciertos aspectos de la dinámica intracelulares, hay cuatro factores que limitan la utilidad de este enfoque. En primer lugar, la resolución temporal está limitada por la rapidez con la que las células pueden inmovilizarse, que típicamente toma s - min debido a la lenta difusión y la reacción de fijadores 7. En segundo lugar, se observa la arquitectura subcelular post facto 8; Por lo tanto, los cambios morfológicos dinámicas no pueden ser capturados utilizando este enfoque. En tercer lugar, las micrografías de fluorescencia y de electrones no se pueden alinear con precisión debido a sh tejidorinkage causada por la deshidratación durante la preparación de la muestra para microscopía electrónica 9, 10. En cuarto lugar, eventos como la citocinesis y la endocitosis no tienen lugar al mismo tiempo en todas las células 5, 11, y por lo tanto, una célula particular que se dedica en caso deben ser identificados a partir de una gran población de células. Este proceso es a menudo laborioso. Por lo tanto, un nuevo método es necesaria para inducir eventos particulares en cada célula y para capturar la dinámica celular resultantes por la rápida inmovilización de células en puntos de tiempo definidos. Recientemente, varios se han desarrollado herramientas para inducir particulares dinámica celular utilizando la luz (optogenética). Canalrodopsina es un canal de catión sensible a la luz, no selectivo aislado de Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Cuando se expresa en canalrodopsina neuronal membranas, un breve destello de luz induce una afluencia de iones de sodio en neuronas y desencadena una acción potencial 14, 15. El potencial de acción se propaga entonces en los terminales sinápticos, donde las vesículas sinápticas se fusionan en cuestión de milisegundos 16, 17, 18 Por lo tanto, canalrodopsina induce la actividad neuronal. Para seguir dinámica de la membrana en las terminales sinápticas, las neuronas deben ser inmovilizados en puntos de tiempo definidos después de la estimulación con precisión ms. Para capturar dinámica de la membrana después de la inducción de la actividad neuronal, que acoplamos la estimulación de luz con alta presión de congelación 17, 18, 19. Congelación de alta presión permite la inmovilización casi instantánea de las células con la formación de cristales de hielo reducida 20. Los cristales de hielo can romper las membranas y perturbar la arquitectura subcelular 21. Variando los intervalos de tiempo entre la estimulación y la congelación, el tráfico de membrana dentro de los terminales sinápticos fue capturado después de la inducción de un potencial de acción. Aquí, demostramos procedimientos experimentales usando un congelador de alta presión comercializado que las parejas un control temporal ms de estimulación de la luz con la congelación de alta presión. A diferencia de otros instrumentos que requieren un dispositivo externo para controlar la estimulación de luz y la congelación, la estimulación de luz está totalmente integrado en este sistema y se puede aplicar con precisión ms 19. Este proceso implica varios pasos. 1) las neuronas del hipocampo de ratón se cultivan en discos de zafiro e infectadas con lentivirus que lleva un vector de expresión para canalrodopsina 18. 2) Las neuronas son estimuladas y se congelaron a puntos de tiempo definidos después de la estimulación. 3) El agua vitrificada es sustitutod con un disolvente orgánico, mientras que los lípidos y las proteínas son reticulados por fijadores para preservar la arquitectura intracelular. 4) Las muestras se infiltraron y embebidos en resina epoxi. 5) secciones ultrafinas se recogen usando un ultramicrotomo. 6) Las secciones finas se forman imágenes en un microscopio electrónico de transmisión. 7) de adquisición y análisis de imágenes se llevan a cabo a ciegas con respecto a los puntos de tiempo o genotipos. La dinámica celular se pueden determinar a través de la reconstrucción de imágenes con resolución temporal 17, 18. Preparación de la muestra (pasos 2 - 5 más arriba) requiere una semana, pero el análisis de la imagen subsiguiente requiere meses a un año.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Freeze Substitution and Low Temperature Embedding System&#160; for Light and Electron Microscopy -AFS II</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezer - EM-ICE</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td>EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome UC7</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Blue M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT19132</td>
			<td>Toxic, open only under certified chemical hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>RT10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>391340-250GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49159-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>746436-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>2444-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid epoxy resin Eponate 12</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisphenol A epoxy resin Araldite 502</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecenyl succinic anhydride (DDSA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl dimethyl amine (BDMA)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special embedding (BEEM) capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>70021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>1GC12H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl acetate (Pioloform F)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>21447-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cyanoacrylate (Super glue)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>170497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Themo scientific</td>
			<td>25300-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>10569-044</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoro-deoxyuridine (FUDR)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S175223</td>
			<td>Should be acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire disc</td>
			<td>Technotrade</td>
			<td>616-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Emdmillipore</td>
			<td>1000631011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>Should be warmed at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanyl-L-glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seraum free supplement&#160; (B-27)&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24020117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Active Unit should be calculated for each batch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>03-731-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicculine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>01-091-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman I filter paper</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips CM20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flash-and-freeze: a novel technique to capture membrane dynamics with electron microscopy

Las células cambian constantemente su arquitectura membrana y distribución de las proteínas, pero es extremadamente difícil de visualizar estos eventos a una resolución temporal y espacial del orden de ms y nm, respectivamente. Hemos desarrollado una técnica resuelta en el tiempo microscopía electrónica, &quot;flash-y-congelación&quot;, que induce eventos celulares con optogenética y visualiza la dinámica membrana resultante mediante la congelación de las células en los puntos de tiempo definidos después de la estimulación. Para demostrar esta técnica, expresamos canalrodopsina, un canal catiónico sensible a la luz, en las neuronas del hipocampo del ratón. Un destello de luz estimula la actividad neuronal e induce la liberación de neurotransmisores desde las terminales sinápticas a través de la fusión de las vesículas sinápticas. La estimulación de las neuronas optogenético se acopla con la congelación de alta presión para seguir los cambios morfológicos durante la transmisión sináptica. El uso de un instrumento comercial, capturamos la fusión de las vesículas sinápticas y la recuperación de la synamembrana de la vesícula PTIC. Para visualizar la secuencia de eventos, grandes conjuntos de datos se generaron y analizaron a ciegas, ya que los cambios morfológicos fueron seguidos en diferentes células en el tiempo. Sin embargo, flash-y-congelación permite la visualización de dinámica de la membrana en las micrografías electrónicas con resolución temporal ms.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se realizó &quot;flash-y-Freeze&quot; experimentos en las neuronas del hipocampo de ratón que expresan canalrodopsina. Estas neuronas se congelaron sea de 15 ms o 100 ms después del inicio de la iluminación. Hemos demostrado anteriormente que la exocitosis y la endocitosis de las vesículas sinápticas se producen en las terminales sinápticas en los 15 ms y 100 ms de tiempo de puntos, respectivamente 18. Estos eventos fueron capturados con éxito en los momentos apropiados (Figura 2), lo que sugiere que los experimentos de flash-y-Freeze pueden llevar a cabo con éxito en el congelador de alta presión especializado elegido (véase la Tabla de Materiales). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Figura 1. carga de la muestra y la programación en la alta presión del congelador. A) mesa de carga de muestra de un alto-pcongelador resión. La placa intermedia, que se muestra en el recuadro para el detalle estructural, se coloca en un CLEM holder para la carga de la muestra. Uno de los semicilindros se coloca en la parte inferior de la tabla de carga de muestra, y el otro está unido con un clip a la cubierta superior. Una vez que se carga la muestra, la placa media se empuja hacia delante a la media-cilindro inferior y la tapa está cerrada para iniciar la congelación. B) conjunto de muestras. El disco de zafiro que contiene neuronas se coloca en el pocillo de la placa media, con el lado de células hacia arriba. Un anillo 100 m se coloca directamente encima del disco de zafiro el interior del pozo. A continuación, un disco de zafiro vacío sumergido en solución salina fisiológica se coloca con la cara hacia abajo solución. Las burbujas de aire deben ser evitados. Finalmente, un anillo de 100 micras y un anillo de 400 micras se colocan ajustadamente anteriormente. Cualquier exceso de líquido se elimina con papel de filtro. C) Una sección transversal de una cápsula de la incrustación con el disco de zafiro sumergido en resina epoxi. el Sappdisco contratar se coloca en la parte inferior de la cápsula, con el lado de la célula hacia arriba y cubierto con resina epoxi para la infiltración y la incrustación. D) Programación del congelador de alta presión para una sola, 10 ms estímulo. Las muestras se congelan 90 ms después de que el pulso de luz. E) Programación del congelador de alta presión durante 10 estímulos a 20 Hz. Las muestras se congelan 5 ms después del último pulso de luz. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> La Figura 2. La visualización de la exocitosis y la endocitosis en el ratón las neuronas del hipocampo. Las neuronas del hipocampo se estimularon una vez y se congelaron a los tiempos indicados. Las micrografías electrónicas muestran la exocitosis de vesículas sinápticas A) y endocitosis ultrarrápida <strong&gt; B). PSD, Densidad post-sináptica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy at JoVE.com

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, &quot;Flash-y-congelación&quot;, que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Investigación

Biología

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Correlativa confocal y microscopía electrónica de 3D de una célula sensorial específica

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...