Name: glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

JBB هو زميل مؤسسة الوظيفي في مركز الملك القلب البريطانية مؤسسة. MM هو زميل أقدم في مؤسسة القلب البريطانية (FS / 13/2/29892). وأيد هذه الدراسة من قبل مبادرة التميز (مراكز الكفاءة لتقنيات ممتازة - COMET) من الوكالة النمساوية تعزيز البحوث FFG: &quot;مركز أبحاث التميز في الأوعية الدموية الشيخوخة - تيرول، VASCage&quot; (رقم مشروع K 843536) وبحوث الطبية الحيوية NIHR مركز مقرها في مؤسسة الخدمات الصحية الصندوق الوطني غاي وسانت توماس &quot;وكينجز كوليدج لندن في شراكة مع مستشفى كينجز كوليدج.

<ol>
	<li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts:+at+the+heart+of+myocardial+remodeling.">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia/reperfusion+injury.">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation.">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li><li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li><li>Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Roles+of+Glycans.">Biological Roles of Glycans.</a> Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+-+opportunities+and+challenges:+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix.">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li><li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+the+application+of+organelle+proteomics+to+heart+failure.">Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure.</a> Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).</li><li>Mason, R. M., Mayes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+cartilage+protein-polysaccharides+with+inorganic+salt+solutions.">Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions.</a> Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).</li><li>Vogel, K. G., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteoglycans+from+tendon.">Isolation of proteoglycans from tendon.</a> Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).</li><li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+in+response+to+venous+hypertension:+proteomics+of+human+varicose+veins.">Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins.</a> Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms:+a+proteomics+approach.">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice:+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis.">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li><li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells.">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment.">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Pepinsky, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+precipitation+of+proteins+from+guanidine+hydrochloride-containing+solutions+with+ethanol.">Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol.</a> Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).</li><li>de Castro-Br&#225;s, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texas+3-step+decellularization+protocol:+looking+at+the+cardiac+extracellular+matrix.">Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix.</a> J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+matrix+proteins+from+tissues+and+digestion+into+peptides+for+mass+spectrometry+analysis.">Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis.</a> J Vis Exp. (101), e53057 (2015).</li><li>Decaris, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity.">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues.">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+extracellular+matrix:+an+ever-changing+and+diverse+entity.">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li></ol>

لا شيء.

وقد تم تحسين هذا البروتوكول البروتينات على مدى السنوات القليلة الماضية في مختبرنا. هنا، كنا أنسجة القلب، ولكن قد تكون هناك حاجة فقط تعديلات طفيفة لتطبيقه على الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، يحتاج بروتوكول استخراج لاتخاذ الخلوية للنسيج في الاعتبار. الأنسجة القلبية هي الخلوية للغاية بالمقارنة مع الأنسجة الوعائية. عند استخدام الأنسجة الوعائية، يمكن للتركيز SDS يكون أقل (أي 0،08٪)، والوقت decellularization هو أقصر (أي 4 ح) 11، 12، 13. استخدام الإنزيمات deglycosylation هو أمر حاسم لتحليل LC-MS / MS التكوين ECM. ومع ذلك، يجب أن يتم تعديلها لأنواع الأنسجة المختلفة الأوقات الحضانة. على سبيل المثال، heparinase II المطلوبة مرات حضانة تمتد على 25 ° C عند استخدام عينات مثل الجلد، والتي هي غنية في البروتينات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال أجرين AGRIN، perlecan) (لا تظهر البيانات). يمكن إجراء تحليل سكري مباشر على وسائل الاعلام مشروط من الخلايا في الثقافة (15). قد لا تكون هناك حاجة خطوات تخصيب اليورانيوم لتحليل هذه subproteome المبسطة. على غرار مقتطفات GuHCl وعصائر كلوريد الصوديوم هي أيضا قابلة للتحليل glycoproteomics مع تعديلات طفيفة. بروتوكولات استخراج أخرى لتخصيب اليورانيوم من البروتينات ECM يمكن تكييفها لتوصيف glycopeptides ECM 19 و 20. بالغليكوزيل هو PTM الأكثر تعقيدا 5. ويتحقق تحديد غير مباشر من glycopeptides من قبل الكشف عن deamidated الأسباراجين مع دمج 18 O في NXT / S sequon. Deamidated الأسباراجين في مواقف أخرى قد تمثل ايجابيات كاذبة. وبالمثل، يجب النظر N-بالغليكوزيل في سياق تجميعات البروتين: والبروتينات داخل الخلايا التي تحتوي على NXT / S sequon لا يمكن الغليكوزيلاتي ولكن قد تؤدي إلى ايجابيات كاذبة. كما البحث في الانترنت الحاليةخوارزميات ح لا تسمح لفحص PTMs في تسلسل محددة مسبقا فقط (أي الأسباراجين في NXT / S)، مطلوب تصفية اليدوي للبيانات. تحديد وجود / غياب بالغليكوزيل في هذه المواقف يمكن مقارنة بين عينات من الأمراض ومكافحتها. ليس هناك ما يعادلها انزيم لPNGase F لO-deglycosylation (أي إدخال التحول الشامل على ثريونين أو سيرين). لذلك، يتم تقييد تحديد O-بالغليكوزيل لتحليل سكري المباشر. ويستخدم تحليل سكري المباشر للحصول على معلومات التركيبية من السكريات تعلق على البروتينات، ولكن لا توفر المعلومات الهيكلية للغليكان. وعلاوة على ذلك، وتكوين غليكان هو نتيجة لتركيب غليكان وتجهيز بعد إفراز. وقد سمح لنا طريقة استخراج 3 خطوات للبروتينات ECM ( &quot;الانجليزية خطوة سريعة&quot;) 6 تميز ECM في مجموعة متنوعة من أنسجة القلب والأوعية الدموية. تجزئة النسيجإلى عدة مقتطفات مطلوب للحصول على بروتيوم ECM مبسط كما نوقش في أي مكان آخر 6. أن البروتينات داخل الخلايا يساهم ذلك إلى مجموعة ديناميكية المفرط للتركيزات البروتين داخل مقتطفات من شأنها أن تعيق تحديد البروتينات ECM أقل وفرة. وعلاوة على ذلك، والبروتينات داخل الخلايا تحمل O-glycosylations 5 التي من شأنها تعقيد ECM تخصيب سكري وتحليل MS احق. مؤلفين آخرين تطبيق منهجيات استخراج مماثلة لوصف على سبيل المثال الرئة 21 و أنسجة الغضروف 10، إلا أنها لم يتابع تحليل بالغليكوزيل. التحليل السابق لبالغليكوزيل تركز على تحديد glycosites فقط، تتطلب إزالة غليكان من صميم البروتين، ولا يمكن تقييم O-بالغليكوزيل 22 و 23. صفائف كتين وإثراء الكيميائية المتاحة للتقييم من الطرق والجسور غليكانوفاق على عينات بيولوجية تعتمد على خصوصية ملزمة، ولكن لا يمكن لهذه التقنيات تعيين أنواع غليكان إلى بروتينات معينة 24 ولا يستطيعون تقييم المواقع بالغليكوزيل. في البداية، كنا هلام الكهربائي قبل LC-MS / MS من البروتينات ECM. على الرغم من أن فصل هلام مفيد في الحصول على أجزاء البروتين مبسطة قابلة للتحليل LC-MS / MS، أحدث الأدوات توفر سرعة المسح الضوئي بسرعة. وهكذا، فإن الخطوة الفصل الكهربي يمكن حذفها. وهذا يوفر ميزة إضافية كما يتم تحليل البروتينات ECM الكبيرة، والتي يتم الاحتفاظ بها على رأس هلام، وأكثر كفاءة. ومع ذلك، يتم فقدان المعلومات المتعلقة ميغاواط من البروتينات سليمة. الخطوة تبخر قبل PNGase F deglycosylation يضمن إزالة كاملة من العادي H 2 O للحد من السلبيات كاذبة. بقايا السكر (أي الجماهير غليكان متغير) تتداخل مع الفاصل LC وسطا تحديد الببتيد لاحق من قبل MS / MS. A صوأوصت-deglycosylation البروتوكول أيضا لتحليل البروتينات البروتينات ECM لا تركز على بالغليكوزيل. يمكن أن البروتينات تقدم رؤى غير مسبوقة في ECM. ما وراء الدعم الهيكلي، glycans تعلق على ECM ضرورية للتفاعل المضيف الممرض والاتصالات خلية خلية والاستجابة المناعية 25، أي المزروع الرفض بعد زرع الأعضاء. سوف Glycoproteomics يكون أداة أساسية في غليكوبيولوغي.

التليف هو السمة المميزة لكثير من الأمراض. الليفية تتكاثر وتفرق نحو الظواهر التركيبية للغاية، والتي ترتبط مع إفراز استفحال وترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM) 1. الإفراط ECM ترسب يمكن أن تستمر، حتى بعد أن خفت حدة الإصابة الأولية، مما يؤدي إلى اضطراب وظيفي. استخدام البروتينات، حددنا سابقا أكثر من 150 ECM والبروتينات ECM المصاحب في أنسجة القلب 2 و 3. فهي ليست الوحيدة البروتينات الهيكلية، ولكن أيضا البروتينات matricellular والبروتياز التي تساهم في إعادة المستمر والتكيف الحيوي من القلب. والجدير بالذكر أن والغليكوزيلاتي العديد من البروتينات ECM 4. هذا التعديل بعد متعدية (PTM) ينطوي على إضافة مخلفات السكر لبعض المواقف من الأحماض الأمينية، وأنه يؤثر على البروتين للطي، والذوبان، ملزمة، وتدهور 5 </sتصل&gt;. هناك نوعان بالغليكوزيل الرئيسية التي تحدث في الثدييات. (1) يحدث N-بالغليكوزيل في النيتروجين carboxamido من بقايا الأسباراجين (الأسباراجين) ضمن تسلسل إجماع الأسباراجين-XAA-منتدى المجالس الرومانسية / سر، حيث XAA هو أي حمض أميني باستثناء البرولين. (2) في O-بالغليكوزيل، وبقايا السكر نعلق على سيرين وثريونين بقايا (سر، منتدى المجالس الرومانسية) أو، إلى حد أقل بكثير، لالهيدروكسي برولين وهيدروكسي ليزين. في حين يمكن أن يحدث O-بالغليكوزيل في مجموعة متنوعة من الجماعات البروتين، يتم تقييد N-بالغليكوزيل للبروتينات يفرز أو المجالات خارج الخلية من بروتينات الغشاء 5. وهذا يجعل N-بالغليكوزيل هدفا جذابا عند دراسة ECM. يحدد البروتينات معيارا جديدا لتحليل التغيرات البروتين في المرض. حتى الآن، وقد ركزت الدراسات معظم البروتينات على البروتينات داخل الخلايا 6. ويرجع ذلك أساسا إلى الأسباب التالية هذا. أولا، البروتينات داخل الخلايا وفيرة تعيق للهوية منذfication مكونات ECM الشحيحة. هذا أمر بالغ الأهمية ولا سيما في أنسجة القلب، والتي تشكل الميتوكوندريا وخيط عضلي البروتينات لنسبة كبيرة من البروتين 7. ثانيا، البروتينات ECM متكامل هي عبر مرتبطة بشكل كبير ويصعب إذابة. وأخيرا، فإن وجود وفرة PTMs (أي بالغليكوزيل) يغير الكتلة الجزيئية، وتهمة، وخصائص الكهربي من الببتيدات، مما يؤثر على فصل وتحديد من السائل اللوني جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS). خلال السنوات الأخيرة، قمنا بتطوير وتحسين استخراج متتابعة وطريقة تخصيب للبروتينات ECM التي تتوافق مع تحليل لاحقة مطياف الكتلة (MS). وتقوم الاستراتيجية على حضانات متسلسلة. يتم تنفيذ الخطوة الأولى مع كلوريد الصوديوم، وجود مخزن مؤقت الأيونية التي تسهل استخراج البروتينات المرتبطة ECM وECM ملزمة فضفاضة، وكذلك البروتينات ECM توليفها حديثا. هو أناالصورة المنظفات مجانا، غير تغيير طبيعة، غير مدمرة لأغشية الخلايا، وقابلة لمزيد من فحوصات البيوكيميائية 8. ثم، ويتحقق decellularization مع كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS). في هذه الخطوة، تركيز منخفض SDS يضمن زعزعة استقرار الغشاء والإفراج عن البروتينات داخل الخلايا ويمنع تعطيل مكونات ECM غير المدمجة أكثر قابلية للذوبان. وأخيرا، يتم استخراج البروتينات ECM مع العازلة جوانيداين هيدروكلوريد (GuHCl). GuHCl فعال في استخراج البروتينات والبروتيوغليكان بشكل كبير عبر ربط من الأنسجة مثل الأوتار 9 والغضاريف 10، سفن 11 و 12 و 13 و قلب 2 و 3. طبقنا هذا تجزئة الكيمياء الحيوية، في تركيبة مع LC-MS / MS، لاستكشاف إعادة عرض ECM في أمراض القلب والشرايين 2 <sup&gt; و 3 و 11 و 12 و 13 و 14. وتشمل التطورات الحديثة في أساليب MS تجزئة جديدة، مثل مجموعات من الطاقة أعلى تصادم التفكك (HCD) ونقل الإلكترون التفكك (المفتشون)، والتي تسمح للتحليل المباشر للglycopeptides سليمة 3، 15. نحن هنا وصف منهجية لإعداد ECM لتحليل MS التي تسمح لتحليل تكوين البروتين، وتحديد مواقع بالغليكوزيل، وتوصيف أشكال غليكان. بالمقارنة مع التحليلات السابقة من ECM بالغليكوزيل 16، هذه المنهجية تسمح للتقييم المباشر للتغيرات التركيبية في لمحات بالغليكوزيل بطريقة محددة الموقع باستخدام MS. لقد طبقت هذه المنهجية لأنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإنه يمكن اللهذلك أن تطبق، مع تعديلات طفيفة، لدراسة ECM في عينات الأنسجة الأخرى، ويمكن تقديم رؤى غير مسبوقة في علم الأحياء ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A. Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS-grade&#160;(ACN, C2H3N)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail of proteinase inhibitors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2H2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (C2H6O)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437433T</td>
			<td>2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (C3H8O3)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>158920025</td>
			<td>Suppl 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O LC-MS Cromasolv</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td>Throughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H218O</td>
			<td>Taiyo Nippon Sanso</td>
			<td>FO3-0027</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HA, H3NO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51226</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (C2H3NaO2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7545</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>1.4.1, 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>466143</td>
			<td>1.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11268</td>
			<td>4.7, 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T62200</td>
			<td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea (CH4N2S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>1.4.1, Suppl 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (CH4N2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U1250</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0012)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;1,4-Galactosidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0004)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-N-Acetylglucosaminidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0013)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0011)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6512</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratanase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6920</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase-F (N-Glycosidase F)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0001)</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. Reagent kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 kDa MWCO spin filters&#160;</td>
			<td>Amicon, Millipore</td>
			<td>10256744</td>
			<td>5.9, Suppl 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-5657</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>NP0322PK2</td>
			<td>Suppl 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>72103</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem mass tag 0 (TMT0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>900067</td>
			<td>6.2, 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. Equipment and software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300&#181;m, 5&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75&#181;m, 3&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byonic Search Engine</td>
			<td>Protein Metrics</td>
			<td>Version 2.9.30</td>
			<td>Suppl 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray Ion Source&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES081</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&#160; 50cm x 75&#181;m, 2&#956;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot Search Engine</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Version 2.3.01</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Version 2.1.1.21</td>
			<td>Suppl 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoview Nanospray Source</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>550</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Savant SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD131DDA</td>
			<td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaffold Software</td>
			<td>Proteome Software&#160;</td>
			<td>Version 4.3.2</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry

التليف هو السمة المميزة لكثير من الأمراض القلبية الوعائية ويرتبط إفراز استفحال وترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM). استخدام البروتينات، حددنا سابقا أكثر من 150 ECM والبروتينات ECM المصاحب في أنسجة القلب والأوعية الدموية. والجدير بالذكر أن والغليكوزيلاتي العديد من البروتينات ECM. هذا التعديل بعد متعدية يؤثر البروتين للطي، والذوبان، ملزمة، وتدهور. لقد قمنا بتطوير الاستخلاص المتسلسل وطريقة تخصيب للبروتينات ECM التي تتوافق مع الطيف الكتلي السائل اللوني جنبا إلى جنب لاحقة تحليل (LC-MS / MS) من glycopeptides سليمة. وتقوم الاستراتيجية على حضانات متتابعة مع كلوريد الصوديوم، SDS لdecellularization الأنسجة، وهيدروكلوريد جوانيداين لإذابة البروتينات ECM. وتشمل التطورات الحديثة في LC-MS / MS طرق تجزئة، مثل مجموعات من الطاقة أعلى تصادم التفكك (HCD) ونقل الإلكترون التفكك (المفتشون)، والتي تسمح للالتحليل التركيبي المباشر للglycopeptides من البروتينات ECM. في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لإعداد ECM من عينات الأنسجة. طريقة يسمح ليس فقط لتحديد ملامح البروتين ولكن أيضا تقييم وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل عن طريق تحليل MS.

ويرد سير العمل التخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. بروتوكول استخراج ECM يمكن رصد كفاءة الاستخراج عن طريق تشغيل أجزاء مأخوذة تشكل كل مستخلص على المواد الهلامية الأكريلاميد مكرر تريس وباستخدام تلطيخ الفضة التصور. ويبين الشكل 2A التكامل بين كلوريد الصوديوم، SDS وGuHCl مقتطفات بعد الاستخلاص المتسلسل. هذا QC تسمح لتحديد المشاكل المحتملة مع نوعية العينة مثل تدهور البروتين الزائد. بعد الاستخراج، وبروتينات سكرية ECM وفيرة في مقتطفات GuHCl (الشكل 2B). Deglycosylation لتقييم كفاءة deglycosylation، يجب تشغيل عنصر تحكم غير deglycosylated في السلطة الفلسطينيةrallel. مرات Deglycosylation يجب أن تكون مناسبة لتحقيق الإزالة الكاملة ومتجانسة من مخلفات السكر، كما يتضح في الشكل 3A. ويبين الشكل 3B مثال نموذجي من العينات deglycosylated بكفاءة عن طريق اضافة الانزيمات لإزالة GAG وdeglycosylation الانزيمات التي تستهدف أصغر N- وO-مرتبطة يغوساكاريدس. Glycoproteomics بروتوكول لتقييم إشغال sequons NXT / S يحسن بروتين تغطية تسلسل للبروتينات سكرية ECM بعد MS (الشكل 3C) ويسمح الفرز المبدئي لوجود بروتينات سكرية. وهذا يساعد على تقليل الوقت البحث عن glycopeptides، وقواعد البيانات يمكن أن تكون مخصصة لاحتواء البروتينات السكرية التي سبق تحديدها. يستخدم HCD-ETD تجزئة لتحديد وتوصيف التركيبي من يغوساكاريدس تعلق على ECM ز<html> lycoproteins. يعرض الشكل 4A مجموعة تمثيلية تم الحصول عليها الببتيد المسمى مع 18 O بعد deglycosylation (تحليل سكري غير مباشر). الشكل 4B مثال الممثلين الطيف تم الحصول عليها بعد تحليل glycopeptides سليمة من مقتطفات ECM (تحليل سكري المباشر). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> الشكل 1: طريقة نظرة عامة. (A) بعد تخصيب متسلسل للبروتينات ECM، يتم تنفيذ التحليلات LC-MS / MS على مقتطفات deglycosylated. (B) بدلا من ذلك، يتم إثراء غير مقتطفات ECM deglycosylated كذلك إلى glycopeptides. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2: استخراج ECM البروتينات. (A) 3 مقتطفات مختلفة من الإجراء الاستخلاص المتسلسل ( &quot;الانجليزية خطوة سريعة&quot;) متكاملان في محتوى البروتين. في حين يتم إثراء مقتطفات SDS في البروتينات داخل الخلايا وعصائر GuHCl تحتوي معظم البروتينات ECM. هو تصور تجزئة الناجحة التي قام بها مختلف نمط الفضة تلطيخ. البروتينات (B) ECM مثل-ليسين الغنية صغير البروتيوغليكان decorin، biglycan وmimecan يتم اكتشاف معظمها في مقتطفات GuHCl، مع وجود القليل في مقتطفات SDS وكلوريد الصوديوم. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> الشكل 3. تحليل Glycosylation. مطلوبة (A) مرات الحضانة المناسبة لdeglycosylation كاملة. يظهر المثال تأثير فترة حضانة خلال إزالة السلاسل جلايكان من decorin بروتين سكري. زينت بروتينات سكرية (B) ECM مع سلاسل كبيرة ومتكررة غلكسمينوغلكن وN- قصيرة ومتنوعة ويغوساكاريدس المرتبطة O. حارة 1 على كل من immunoblots يمثل مقتطفات القلب غير المعالجة. 2 لين يحتوي على مقتطفات تعامل مع الإنزيمات التي تهضم الجليكوسامينوجليكان. العينات في حارة 3 تحتوي بالإضافة إلى ذلك، الانزيمات لإزالة oligossacharides N- وO-مرتبط. لا الغليكوزيلاتي Galectin-1، وبالتالي لا يوجد أي تغيير في حجم البروتين. مقتبس من لينش M، وآخرون. 4 (C) في LC-MS / MS تحليل عينات تعامل مع PNGase-F في وجود H 2 O 18 تحقيق أفضل تغطية تسلسل (٪، على الجانب الأيمن) بالمقارنة مع عينات غير deglycosylated. دتمثل المساحات الخضراء تابوت تغطية تسلسل LC-MS / MS. و، الخطوط المنقطة الحمراء تمثل glycosites، مع الأرقام تشير إلى موقف الأحماض الأمينية. ويرد الكشف عن بالغليكوزيل من decorin في موقف الأسباراجين 211 (N، أبرز بالخط العريض) بالتفصيل على سبيل المثال في الشكل 4. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> الشكل 4. تحليل سكري التي كتبها MS. (A) باستخدام نهج البروتينات طلقات نارية على ECM مقتطفات المخصب، glycopeptides يمكن تحديدها من خلال وجود asparagines deamidated داخل sequons NXT / S وصفت مع 18 O. يظهر المثال طائفة HCD MS / MS لالببتيد من decorin التي تحتوي على الغليكوزيلاتي سابقا الأسباراجين 211. البيانات التي تم الحصول عليها يمكن استخدامهالإنشاء قاعدة بيانات مخصصة من بروتينات سكرية ECM. يستخدم تجزئة (B) HCD-ETD لتحليل سكري المخصب استخراج ECM. الطيف ETD MS / MS يسمح توصيف التركيب غليكان. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> حلول A. المالية </td><td></td></tr><tr><td> DTT (Dithiotreitol، C 4 H 10 O 2 S 2) </td><td> 100 ملي DTT في ده 2 O. 1 </td></tr><tr><td> EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل، C 10 H 16 N 2 O 8) </td><td> 250 ملي EDTA في ده 2 O، ودرجة الحموضة 8.0. </td></tr><tr><td> GuHCl (جوانيداين هيدروكلوريد، CH 6 CLN 3) </td><td> 8 M GuHCl فيده 2 O. </td></tr><tr><td> IAA (Iodoacetamide، C 2 H 4 INO) </td><td> 500 ملي IAA في ده 2 O. 1،2 </td></tr><tr><td> نا خلات (أسيتات الصوديوم، C 2 H 3 الحسابية 2) </td><td> 1 خلات M نا في [ده 2 O، ودرجة الحموضة 5.8. </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، كلوريد الصوديوم) </td><td> 1 M كلوريد الصوديوم في [ده 2 O. </td></tr><tr><td> نا فوسفات ثنائي القاعدة (الصوديوم والفوسفات، ونا 2 H 2 PO 4) </td><td> 1 M نا ثنائي القاعدة فوسفات في ي H 2 O، ودرجة الحموضة 6.8. </td></tr><tr><td> SDS (الصوديوم دوديسيل كبريتات، NAC 12 H 25 SO 4) </td><td> 1٪ SDS (35 ملم) في [ده 2 O. 3 </td></tr><tr><td> TFA (Trifluoroacetic حامض، C 2 HF 3 O 2) </td><td> 10٪ TFA (1.2 M) في [ده 2 O. </td></tr><tr><td> TEAB (Triethylammonium بيكربونات، C 7 H 17 </فرعية&gt; NO 3) </td><td> TEAB 1M في في ddH2O، ودرجة الحموضة 8.5 </td></tr><tr><td> ثيوريا (ثيوريا، CH 4 N 2 S) </td><td> 3 M ثيوريا في ده 2 O. </td></tr><tr><td> تريس، حمض الهيدروكلوريك (تريس، هيدروكلوريد (NH 11 C 4 O 3 [حمض الهيدروكلوريك]) </td><td> 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك في ده 2 O، ودرجة الحموضة 7.5. </td></tr><tr><td> اليوريا (اليوريا، CH 4 N 2 O) </td><td> 9 M اليوريا في ده 2 O. </td></tr><tr><td> B. مخازن رد الفعل </td><td></td></tr><tr><td> C18 عازلة موازنة تنظيف </td><td> 1٪ ACN، 0.1٪ TFA في ده 2 O </td></tr><tr><td> C18 تنظيف غسل العازلة العمود </td><td> 80٪ ACN، 0.1٪ TFA في H 2 O </td></tr><tr><td> C18 شطف العازلة تنظيف </td><td> 50٪ أسيتونيتريل، 0.1٪ TFA في ده 2 O </td></tr><tr><td> Deglycosylation العازلة (4X) </td><td> 600 مم كلوريد الصوديوم والفوسفات 200 ملي نا في [ده 2 O، ودرجة الحموضة 6.8. </td></tr><tr><td> عازلة GuHCl 4 </td><td> 4 M جوانيداين هيدروكلوريد، 50 ملي نا خلات و 25 ملي EDTA في ده 2 O، ودرجة الحموضة 5.8. إضافة 1: 100 (ت: ت) من مزيج من مثبطات بروتين قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> عازلة كلوريد الصوديوم 4 </td><td> 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك و 25 ملي EDTA في ده 2 O، ودرجة الحموضة 7.5. إضافة 1: 100 (ت: ت) من مزيج من مثبطات بروتين قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني (1X) </td><td> 1.7 ملي KH 2 PO 4، 5 مم نا 2 هبو 4، 150 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4. إضافة 25 ملي EDTA و 1: 100 (ت: ت) من مزيج من مثبطات بروتين قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> عينة العازلة (4X) </td><td> 100 ملي تريس، 2٪ SDS، 40٪ الجلسرين، 0.02٪ برموفينول الأزرق في ده 2 O، ودرجة الحموضة 6.8. إضافة 10٪ SS-المركابتويثانول قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td> العازلة SDS 4 </td><td> 0.1٪ SDS و 25 ملي EDTA في ده 2 O. إضافة 1: 100 (ت: ت) من مزيج من مثبطات بروتين فرنكااستخدام خام. </td></tr><tr><td> C. إنزيمات </td><td></td></tr><tr><td> Chondroitinase ABC 5 </td><td> 0.5 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> Keratanase 5 </td><td> 0.1 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> Heparinase II 5 </td><td> 0.1 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> α2-3،6،8،9-النورامينيداز (سياليداز) 5 </td><td> 0.025 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> β1،4 غالاكتوزيداز 5 </td><td> 0.015 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> بيتا-N-5 Acetylglucosaminidase </td><td> 0.25 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> إندو-α-N-acetylgalactosaminidase (O-غليكوزيداز) 5 </td><td> 0.013 U / مل في المخزن deglycosylation (1X) </td></tr><tr><td> PNGase-F (N-غليكوزيداز-F) 6 </td><td> 50 U / مل في H 2 O 18 </td></tr><tr><td> التربسين </td><td> 0.01 ميكروغرام / ميكرولتر العازلة في TEAB </td></tr><tr><td> NOTES الجدول. </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 الحفاظ على حل الأوراق المالية المجمدة في -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan="2"> يجب أن تبقى 2 IAA محمية من الضوء. </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 SDS يبلور بسهولة في &lt;20 ° C. من أجل تسهيل الإذابة من 1٪ SDS (المحلول)، تدفئة العازلة تحت صنبور الماء الساخن. </td></tr><tr><td colspan="2"> ويمكن تخزين 4 مخازن استخراج في RT. إضافة كوكتيل واسعة الطيف من مثبطات بروتين كما هو مبين قبل الاستخدام. </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 يجب أن تضاف هذه الانزيمات خلال الخطوة الأولى deglycosylation. </td></tr><tr><td colspan="2"> 6-F PNGase ينبغي أن يضاف فقط خلال خطوة deglycosylation الثانية. </td&gt; </tr></tbody></table> الجدول 1: حلول المالية، المخازن رد الفعل والانزيمات. يسرد هذا الجدول تكوين كل عازلة حل الأوراق المالية وردود الفعل اللازمة لاستخراج ومعالجة لاحقة (بما في ذلك الهضم الأنزيمية) من البروتينات ECM القلب قبل تحليل MS.

Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

وتصف هذه الورقة منهجية لإعداد عينات الأنسجة القلب والأوعية الدموية لتحليل MS التي تسمح لل(1) تحليل ECM تكوين البروتين، (2) تحديد مواقع بالغليكوزيل، و (3) توصيف التركيبي أشكال غليكان. هذه المنهجية يمكن تطبيقها، مع تعديلات طفيفة، لدراسة ECM في الأنسجة الأخرى.

Glycoproteomics من مصفوفة خارج الخلية: منهج في تحليل سكري سليمة عن طريق قياس الطيف الكتلي

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...