Name: glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

JBB הוא עמית הקמת קריירה במרכז קרן הלב הבריטית של המלך. MM הוא עמית בכיר של קרן הלב הבריטית (FS / 13/2 / 29,892). המחקר נתמך על ידי יוזמה ומצוינת (מרכזי כשירות עבור טכנולוגיות מעולות - COMET) של FFG סוכנות קידום המחקר האוסטרי: &quot;מרכז המחקר של אקסלנס ב Vascular הזדקנות - טירול, VASCage&quot; (K-Project מספר 843,536) לבין המחקר ביו-הרפואי NIHR מרכז מבוסס על ו של גיא סנט תומאס National Health Service Foundation Trust ו בקינגס קולג &#39;בלונדון בשיתוף עם בית החולים קינגס קולג&#39;.

<ol>
	<li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts:+at+the+heart+of+myocardial+remodeling.">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia/reperfusion+injury.">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation.">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li><li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li><li>Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Roles+of+Glycans.">Biological Roles of Glycans.</a> Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+-+opportunities+and+challenges:+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix.">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li><li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+the+application+of+organelle+proteomics+to+heart+failure.">Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure.</a> Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).</li><li>Mason, R. M., Mayes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+cartilage+protein-polysaccharides+with+inorganic+salt+solutions.">Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions.</a> Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).</li><li>Vogel, K. G., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteoglycans+from+tendon.">Isolation of proteoglycans from tendon.</a> Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).</li><li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+in+response+to+venous+hypertension:+proteomics+of+human+varicose+veins.">Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins.</a> Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms:+a+proteomics+approach.">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice:+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis.">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li><li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells.">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment.">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Pepinsky, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+precipitation+of+proteins+from+guanidine+hydrochloride-containing+solutions+with+ethanol.">Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol.</a> Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).</li><li>de Castro-Br&#225;s, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texas+3-step+decellularization+protocol:+looking+at+the+cardiac+extracellular+matrix.">Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix.</a> J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+matrix+proteins+from+tissues+and+digestion+into+peptides+for+mass+spectrometry+analysis.">Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis.</a> J Vis Exp. (101), e53057 (2015).</li><li>Decaris, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity.">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues.">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+extracellular+matrix:+an+ever-changing+and+diverse+entity.">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li></ol>

אף אחד.

פרוטוקול פרוטאומיקה זה ממוטב במהלך השנים האחרונות במעבדה שלנו. הנה, השתמשנו ברקמת לב, אבל רק שינויים קלים עשויים להידרש ליישום שלה לרקמות אחרות. לדוגמה, פרוטוקול החילוץ צריך לקחת את cellularity של הרקמה בחשבון. ברקמת לב היא מאוד הסלולר לעומת רקמת כלי דם. בעת שימוש ברקמת כלי הדם, ריכוז SDS יכול להיות נמוך יותר (כלומר 0.08%) ואת הזמן decellularization הוא קצר יותר (כלומר 4 h) 11, 12, 13. השימוש באנזימי deglycosylation חיוני לניתוח LC-MS / MS של רכב ECM. עם זאת, פעמי דגירה צריכות להיות מותאמות עבור סוגי רקמות שונים. לדוגמה, heparinase השנייה פעמים דגירה ממושכת הנדרשת על 25 מעלות צלזיוס, כאשר באמצעות דגימות כגון העור, אשר עשירים בחלבונים קרום במרתף (למשל Agrin, perlecan) (מידע לא מוצג). ניתן לבצע ניתוח glycopeptide ישיר על התקשורת המותנה מתאי בתרבות 15. צעדים עשרה לא ייתכן שיידרשו לניתוח subproteome פשוטה זו. בדומה תמציות GuHCl, תמציות NaCl הם גם מקובל לניתוח glycoproteomics עם שינויים קלים. פרוטוקולי מיצוי אחרים להעשרה של חלבוני ECM ניתן להתאים לאפיין glycopeptides ECM 19, 20. Glycosylation הוא PTM 5 המורכבים ביותר. זיהוי עקיף של glycopeptides מושג על ידי זיהוי של ASN deamidated עם 18 שולבו O בכל sequon NXT / S. Deamidated ASN על עמדות אחרות עשוי לייצג חיוביות שגויות. כמו כן, N-glycosylation חייב להיחשב בהקשר של אונטולוגיות חלבון: חלבונים תאיים המכילים sequon NXT / S לא יהיה glycosylated אבל אולי להצמיח תוצאות חיוביות שגויות. כפי searc הנוכחיאלגוריתמים h אינם מאפשרים הקרנת PTMs על רצפים שנקבעו מראש בלבד (כלומר ASN ב NXT / S), סינון ידני של נתונים נדרש. זיהוי נוכחות / היעדרות של glycosylation על עמדות אלה ניתן להשוות בין דגימות ולניטור מחלות. אין מקבילת אנזים כדי PNGase F עבור O-deglycosylation (כלומר החדרת שינוי מסה על תראונין או סרין). לכן, זיהוי של glycosylation O מוגבל ניתוח glycopeptide ישיר. ניתוח glycopeptide ישיר משמש להשגת מידע הלחנה של סוכרים המחוברים לחלבונים, אך אינו מספק מידע מבני של glycan. יתר על כן, את הרכב glycan הוא התוצאה של סינתזת glycan ועיבוד לאחר הפרשה. שיטת החילוץ 3-צעד שלנו עבור חלבונים ECM ( &quot;אנגלית Quickstep&quot;) 6 אפשרה המאפיינת את ECM במגוון של רקמות וכלי דם. היפוך של הרקמהלכמה תמציות נדרש לקבל proteome ECM מפושטת כפי שפורט במקום אחר 6. חלבונים תאיים אחרת יתרמו טווח דינמי מוגזם של שכיחותם חלבון בתוך התמציות כי הייתה לעכב זיהוי של חלבוני ECM בשפע פחות. יתר על כן, חלבונים תאיים לשאת O-glycosylations 5 כי תסבך עשרת glycopeptide ECM וניתוח MS עוקב. מחברים אחרים להחיל מתודולוגיות חילוץ דומות לאפיין עבור ריאות למשל 21 ורקמות סחוס 10, אולם הם לא רדפו אחרי הניתוח של glycosylation. הניתוח קודם של glycosylation התמקד זיהוי glycosites בלבד, דורש הסרה של glycan מן ליבת החלבון, ולא ניתן להעריך O-glycosylation 22, 23. מערכים לקטינים והעשרה כימיים זמינים עבור הערכה של typ glycanes על דגימות ביולוגיות המבוסס על סגוליות המחייבות שלהם, אבל הטכניקות הללו לא יכולות להקצות סוגי glycan לחלבונים ספציפיים 24 וגם הם יכולים להעריך אתרי glycosylation. בתחילה, השתמשנו ג&#39;ל אלקטרופורזה לפני LC-MS / MS של חלבוני ECM. למרות הפרדת ג&#39;ל שימושית בקבלת שברי חלבון פשוטים מקובלים לניתוח LC-MS / MS, המכשירים האחרונים מציעים מהירויות סריקה מהירה יותר. לכן, צעד הפרדת electrophoretic ניתן להשמיט. זה מספק יתרון נוסף כמו חלבוני ECM גדולים, אשר נשמרים על גבי ג&#39;ל, מנותח בצורה יעילה יותר. עם זאת, המידע לגבי Mw של חלבונים שלמים הולך לאיבוד. צעד האידוי לפני deglycosylation PNGase F מבטיח הסרה מלאה של O הרגיל H 2 למזער שלילי שווא. שאריות סוכר (כלומר המוני glycan משתנים) להפריע הפרדה על ידי LC ו להתפשר זיהוי הפפטיד עוקב ידי MS / MS. עמ &#39;פרוטוקול א-deglycosylation מומלץ גם עבור ניתוח חקר חלבונים של חלבוני ECM לא התמקדו glycosylation. פרוטאומיקה יכול לספק תובנות חסרות תקדים לתוך ECM. מעבר לתמיכה מבנית, גליקנים המחוברים ECM חיוניים אינטראקציה מארח הפתוגן, תקשורת בין תאים לבין התגובה החיסונית 25, כלומר דחייה של השתל לאחר השתלת איברים. Glycoproteomics תהיה כלי חיוני glycobiology.

פיברוזיס היא סימן היכר של מחלות רבות. פיברובלסטים להתרבות להבדיל כלפי פנוטיפים סינתטי מאוד, אשר משויכים את הפרשת מחריפה בתצהיר של מטריקס (ECM) 1. בתצהיר ECM מוגזם יכול להמשיך, גם לאחר הפגיעה הראשונית כבר שככה, שמוביל פגיעה תפקודית. פרוטאומיקה שימוש, זיהינו בעבר יותר מ 150 ECM ו- ECM-הקשורים חלבונים ברקמת הלב 2, 3. הם אינם חלבונים מבניים בלבד, אלא גם חלבונים matricellular ו פרוטאזות התורמים שיפוץ מתמשך והתאמה דינמית של הלב. יש לציין, רבי חלבוני ECM הם glycosylated 4. שינוי שלאחר translational זה (PTM) יהיה כרוך בתוספת שאריות סוכר לעמדות חומצת אמינו מסוימות, וזה משפיע קיפול חלבונים, מסיסות, מחייב, ושפלת 5 </sעד&gt;. ישנם שני סוגים עיקריים glycosylation המתרחשות יונקים. (1) N-glycosylation מתרחשת חנקן carboxamido של שאריות asparagine (ASN) בתוך רצף קונצנזוס ASN-XAA-Thr / שירו, שבו XAA הוא כל חומצת אמינו למעט פרולין. (2) בשנת O-glycosylation, שאריות סוכר לצרף שאריות סרין ו תראונין (שירו, Thr) או, במידה פחותה בהרבה, כדי hydroxyproline ו hydroxylysine. בעוד O-glycosylation יכול להתרחש במגוון של קבוצות חלבון, N-glycosylation מוגבל חלבונים מופרשים או תחומים תאיים של חלבונים בממברנה 5. זה עושה N-glycosylation יעד אטרקטיבי כאשר לומדים את ECM. פרוטאומיקה קובע סטנדרט חדש עבור ניתוח של שינויים חלבון המחלה. עד כה, רוב המחקרים פרוטאומיקה כבר התמקדו חלבונים תאיים 6. זהו בעיקר בשל הסיבות הבאות. ראשית, חלבונים תאיים בשפע לעכב את ההזדהותfication של רכיבי ECM נדירים. זה חיוני במיוחד ברקמת לב, שבו חלבונים המיטוכונדריה myofilament מהווים חלק גדול מתוכן החלבון 7. שנית, חלבוני ECM אינטגרליים הם צולבים בכבדות וקשה solubilize. לבסוף, נוכחותה של PTMs בשפע (כלומר, glycosylation) משנה את המסה המולקולרית, אחראי, ומאפיינים electrophoretic של פפטידים, המשפיעים הן הפרדה וזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS / MS). במהלך השנים האחרונות, פתחנו ושפרנו חילוץ רציף ושיטה והעשרת חלבוני ECM התואמת ספקטרומטריית מסה עוקב (MS) ניתוח. האסטרטגיה מבוססת על incubations הרציף. השלב הראשון מתבצע עם NaCl, חוצץ יוני המאפשר ההוצאה קשור ECM וחלבוני ECM הכרוך ברפיון, כמו גם חלבוני ECM מסונתזים חדש. זה אניים תכשיר נטול, הלא denaturing, ללא הפרעה של קרום התא, וכן מקובל עבור 8 מבחני ביוכימיים נוספים. ואז, decellularization מושגת עם סולפט dodecyl נתרן (SDS). בשלב זה, ריכוז נמוך SDS מבטיח יציבות הממברנה ואת שחרורו של חלבונים תאיים תוך מניעת השיבוש של רכיבי ECM יותר המסיסים שאינם נפרדים. לבסוף, חלבונים ECM המחולצים עם חיץ הידרוכלוריד guanidine (GuHCl). GuHCl יעיל לחילוץ חלבונים צולבים בכבדות ו proteoglycans מרקמות כגון גידים 9, הסחוס 10, כלי 11, 12, 13 ו הלב 2, 3. יישמנו חלוקה ביוכימיים זו, בשילוב עם LC-MS / MS, לחקור שיפוץ ECM במצב מחלת לב 2 <sup&gt;, 3, 11, 12, 13, 14. התקדמות MS כוללת שיטות פיצול רומן, כגון שילובים של ניתוק התנגשות אנרגיה גבוהה יותר (HCD) לבין ניתוק העברת אלקטרונים (ETD), המאפשרים ניתוח הישיר של glycopeptides השלם 3, 15. כאן אנו מתארים שיטה להכין ECM לניתוח MS המאפשרת ניתוח של הרכב החלבון, לזיהוי האתרים glycosylation, ואת האפיון של צורות glycan. לעומת ניתוחים קודמים של glycosylation ECM 16, מתודולוגיה זו מאפשרת הערכה הישירה של שינויים ב רכב פרופילי glycosylation באופן אתר ספציפי באמצעות MS. יש לנו ליישם מתודולוגיה זו לרקמות לב וכלי דם. עם זאת, זה יכול alכך להיות מיושם, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM בדגימות רקמה אחרות והוא יכול לספק תובנה חסרות תקדים לתוך ביולוגית ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A. Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS-grade&#160;(ACN, C2H3N)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail of proteinase inhibitors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2H2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (C2H6O)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437433T</td>
			<td>2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (C3H8O3)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>158920025</td>
			<td>Suppl 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O LC-MS Cromasolv</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td>Throughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H218O</td>
			<td>Taiyo Nippon Sanso</td>
			<td>FO3-0027</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HA, H3NO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51226</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (C2H3NaO2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7545</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>1.4.1, 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>466143</td>
			<td>1.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11268</td>
			<td>4.7, 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T62200</td>
			<td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea (CH4N2S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>1.4.1, Suppl 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (CH4N2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U1250</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0012)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;1,4-Galactosidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0004)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-N-Acetylglucosaminidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0013)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0011)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6512</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratanase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6920</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase-F (N-Glycosidase F)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0001)</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. Reagent kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 kDa MWCO spin filters&#160;</td>
			<td>Amicon, Millipore</td>
			<td>10256744</td>
			<td>5.9, Suppl 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-5657</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>NP0322PK2</td>
			<td>Suppl 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>72103</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem mass tag 0 (TMT0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>900067</td>
			<td>6.2, 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. Equipment and software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300&#181;m, 5&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75&#181;m, 3&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byonic Search Engine</td>
			<td>Protein Metrics</td>
			<td>Version 2.9.30</td>
			<td>Suppl 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray Ion Source&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES081</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&#160; 50cm x 75&#181;m, 2&#956;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot Search Engine</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Version 2.3.01</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Version 2.1.1.21</td>
			<td>Suppl 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoview Nanospray Source</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>550</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Savant SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD131DDA</td>
			<td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaffold Software</td>
			<td>Proteome Software&#160;</td>
			<td>Version 4.3.2</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry

פיברוזיס היא סימן היכר של מחלות לב וכלי דם רבות והיא קשורה עם הפרשת המחריפה בתצהיר של מטריקס (ECM). פרוטאומיקה שימוש, זיהינו בעבר יותר מ 150 ECM ו- ECM-הקשורים חלבונים ברקמות הלב וכלי הדם. יש לציין, חלבוני ECM רבים glycosylated. שינוי שלאחר translational זה משפיע חלבון מתקפל, מסיסות, מחייב, ושפלה. פתחנו חילוץ רציף ושיטה והעשרת חלבוני ECM כי הוא תואם ספקטרומטריית מסת טנדם כרומטוגרפיה הנוזלית עוקבת (LC-MS / MS) הניתוח של glycopeptides השלם. האסטרטגיה מבוססת על incubations הרציף עם NaCl, SDS עבור decellularization רקמות, ו הידרוכלוריד guanidine עבור solubilization של חלבוני ECM. התקדמות LC-MS / MS כוללת שיטות פיצול, כגון שילובים של ניתוק התנגשות אנרגיה גבוהה יותר (HCD) לבין ניתוק העברת אלקטרונים (ETD), המאפשריםניתוח ההלחנה הישיר של glycopeptides של חלבוני ECM. בעבודה הנוכחית, אנו מתארים שיטה להכנת ECM מן דגימות רקמה. השיטה לא רק מאפשרת אפיון חלבון אלא גם את ההערכה ואפיון של glycosylation ידי ניתוח MS.

זרימת עבודה סכמטי של הפרוטוקול מסופקת באיור 1. פרוטוקול חילוץ ECM היעילות של מיצוי ניתן לנטר ידי הפעלת aliquots יוצרים כל תמצית על ג&#39;ל acrylamide Bis-טריס ושימוש צביעת כסף עבור להדמיה. 2A האיור מראה את מידת ההשלמה של NaCl, SDS ו GuHCl תמציות לאחר מיצוי רציף. QC זו מאפשרת זיהוי של בעיות פוטנציאליות עם איכות מדגם כגון פירוק חלבונים מופרז. לאחר החילוץ, גליקופרוטאינים ECM הם בשפע תמציות GuHCl (איור 2B). deglycosylation כדי להעריך את היעילות של deglycosylation, שליטה בלתי deglycosylated יש להפעיל parallel. פעמים deglycosylation צריך להיות מתאים כדי להשיג הסרה מלאה ואחידה של שאריות סוכר, כפי שהודגם 3A איור. איור 3 ב מציג דוגמה מייצגת של דגימות deglycosylated ביעילות על ידי תוספת של אנזימים אנזימים להסרת deglycosylation GAG כי יעד קטן N- ו- O צמודות אוליגוסכרידים. Glycoproteomics פרוטוקול עבור הערכה של תפוסה של sequons NXT / S משפר כיסוי רצף חלבון עבור גליקופרוטאינים ECM לאחר MS (איור 3 ג) ומאפשר סינון ראשוני של נוכחות של גליקופרוטאינים. זה עוזר להפחית את זמן החיפוש אחר glycopeptides, כמו יכול להיות מותאם אישית מסדי להכיל גליקופרוטאינים זוהו בעבר. פיצול HCD-ETD משמש לזיהוי ואפיון הלחנה של אוליגוסכרידים המצורף גרם ECM<html> lycoproteins. איור 4A מציג ספקטרום נציג שהושג עבור פפטיד שכותרתו עם 18 O לאחר deglycosylation (ניתוח glycopeptide עקיף). איור 4B הוא דוגמא מייצגת של קשת שהושגה לאחר הניתוח של glycopeptides השלם מתמציות ECM (ניתוח glycopeptide ישיר). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית שיטה. (א) לאחר העשרת סדרתי עבור חלבוני ECM, ניתוחי LC-MS / MS מבוצעים על תמציות deglycosylated. (ב) לחלופין, תמציות ECM deglycosylated שאינם מועשרים נוספת glycopeptides. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2: הפקת חלבוני ECM. (א) 3 תמציות שונות הליך החילוץ הרציף ( &quot;Quickstep אנגלית&quot;) הן משלימות תכול החלבון שלהם. בעוד תמציות SDS מועשרים בחלבונים תאיים, תמציות GuHCl מכילים את רוב החלבונים ECM. חלוקה מוצלחת היא דמיינה ידי דפוס מכתים כסף השונה. (ב) חלבוני ECM כגון decorin proteoglycans לאוצין העשיר הקטן, biglycan ו mimecan מזוהים בעיקר תמציות GuHCl, עם נוכחות מעט תמציות SDS ו NaCl. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח של Glycosylation. (א) זמני דגירה מתאימים לצורך deglycosylation השלם. הדוגמה מראה את ההשפעה של זמן הדגירה במהלך הסרת שרשראות גליקוז מן decorin גליקופרוטאין. (ב) גליקופרוטאינים ECM הם שרשרות גליקוז גדולות חוזרות N- קצר ומגוונים אוליגוסכרידים צמוד O. ליין 1 על כל אחד immunoblots מייצג תמציות לב לא מטופל. ליין 2 מכיל תמציות שטופלו אנזימים מעכלים glycosaminoglycans. דוגמאות בנתיב 3 מכילות, בנוסף, אנזימים להסרת N- ו- oligossacharides O צמוד. Galectin-1 הוא לא glycosylated, ומכאן שאין שינוי גודל החלבון. מעובד מתוך לינץ M, et al. 4 (ג) LC-MS / MS ניתוח, דגימות שטופלו PNGase-F בנוכחות H 2 O 18 להשיג כיסוי רצף טוב יותר (%, בצד ימין) לעומת דגימות הלא deglycosylated. Dשטחים ירוקים ארון מייצגים כיסוי רצף ידי LC-MS / MS. הקווים האדומים, מנוקד מייצגי glycosites, עם מספרים המציין עמדת חומצת אמינו שלהם. איתור של glycosylation של decorin במיקום ASN 211 (N, מודגשים) מוצג בפירוט כדוגמה באיור 4. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח Glycopeptide ידי MS. (א) שימוש בגישת פרוטאומיקה רובה על תמציות מועשרות ECM, ניתן לזהות glycopeptides ידי הנוכחות של asparagines deamidated בתוך sequons NXT / S ו שכותרתו עם 18 O. הדוגמא מראה ספקטרום HCD MS / MS עבור פפטיד של decorin המכיל את בעבר glycosylated ASN 211. הנתונים המתקבלים יכולים לשמשכדי ליצור גליקופרוטאינים נתונים של ECM אישית. (ב) פיצול HCD-ETD משמש כדי לנתח את תמצית ECM מועשר glycopeptide. הספקטרום ETD MS / MS מאפשר אפיון של הרכב glycan. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פתרונות מניות א </td><td></td></tr><tr><td> DTT (Dithiotreitol, C 4 H 10 O 2 S 2) </td><td> 100 מ&quot;מ DTT ב DDH 2 O. 1 </td></tr><tr><td> EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic, C 10 H 16 N 2 O 8) </td><td> 250 מ&quot;מ EDTA ב DDH 2 O, pH 8.0. </td></tr><tr><td> GuHCl (hydrochloride guanidine, CH 6 Cln 3) </td><td> 8 M GuHCl בDDH 2 O. </td></tr><tr><td> רש&quot;ת (iodoacetamide, C 2 H 4 INO) </td><td> 500 מ&quot;מ רש&quot;ת ב DDH 2 O. 1,2 </td></tr><tr><td> Na אצטט (אצטט נתרן, C 2 H 3 נאו 2) </td><td> 1 אצטט M Na ב DDH 2 O, pH 5.8. </td></tr><tr><td> NaCl (נתרן כלורי, NaCl) </td><td> 1 M NaCl ב DDH 2 O. </td></tr><tr><td> Na פוספט dibasic (פוספט Disodium, Na 2 H 2 PO 4) </td><td> 1 dibasic פוספט M Na ב dd H 2 O, pH 6.8. </td></tr><tr><td> SDS (סולפט dodecyl נתרן, NAC 12 H 25 SO 4) </td><td> 1% SDS (35 מ&quot;מ) ב DDH 2 O. 3 </td></tr><tr><td> TFA (חומצה trifluoroacetic, C 2 HF 3 O 2) </td><td> 10% TFA (1.2 M) ב DDH 2 O. </td></tr><tr><td> TEAB (ביקרבונט Triethylammonium, C 7 H 17 </sub&gt; NO 3) </td><td> 1M TEAB ב ב ddH2O, 8.5 pH </td></tr><tr><td> Thiourea (Thiourea, CH 4 N 2 S) </td><td> 3 M thiourea ב DDH 2 O. </td></tr><tr><td> Tris-HCl (טריס-הידרוכלוריד (NH 11 C 4 O 3 [HCl]) </td><td> 100 מ&quot;מ טריס-HCl ב DDH 2 O, pH 7.5. </td></tr><tr><td> אוראה (שתנן, CH 4 N 2 O) </td><td> 9 אוריאה M ב DDH 2 O. </td></tr><tr><td> מאגרי תגובת B. </td><td></td></tr><tr><td> חיץ איזון לנקות C18 </td><td> 1% ACN, 0.1% TFA ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> חיץ לשטוף טור לנקות C18 </td><td> 80% ACN, 0.1% TFA ב H 2 O </td></tr><tr><td> חיץ elution לנקות C18 </td><td> 50% אצטוניטריל, 0.1% TFA ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> Deglycosylation חוצץ (4x) </td><td> 600 מ&quot;מ NaCl ו 200 פוספט mM Na ב DDH 2 O, pH 6.8. </td></tr><tr><td> GuHCl חיץ 4 </td><td> 4 M הידרוכלוריד guanidine, 50 אצטט mM Na ו 25 מ&quot;מ EDTA ב DDH 2 O, 5.8 pH. להוסיף 1: 100 (v: v) של קוקטייל של מעכבי proteinase לפני השימוש. </td></tr><tr><td> חיץ NaCl 4 </td><td> 0.5 M NaCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl ו 25 מ&quot;מ EDTA ב DDH 2 O, pH 7.5. להוסיף 1: 100 (v: v) של קוקטייל של מעכבי proteinase לפני השימוש. </td></tr><tr><td> PBS (1x) </td><td> 1.7 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 5 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4. להוסיף 25 מ&quot;מ EDTA ו 1: 100 (v: v) של קוקטייל של מעכבי proteinase לפני השימוש. </td></tr><tr><td> חיץ מדגם (4x) </td><td> 100 מ&quot;מ טריס, 2% SDS, 40% גליצרול, 0.02% כחול bromophenol ב DDH 2 O, pH 6.8. להוסיף 10% SS-mercaptoethanol לפני השימוש. </td></tr><tr><td> חיץ SDS 4 </td><td> 0.1% SDS ו 25 מ&quot;מ EDTA ב DDH 2 O. הוסף 1: 100 (v: v) של קוקטייל של מעכבי proteinase BEFשימוש עפרות. </td></tr><tr><td> אנזימי ג </td><td></td></tr><tr><td> Chondroitinase ABC 5 </td><td> 0.5 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> Keratanase 5 </td><td> 0.1 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> Heparinase השנייה 5 </td><td> 0.1 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9-Neuraminidase (sialidase) 5 </td><td> 0.025 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> β1,4-galactosidase 5 </td><td> 0.015 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> בטא-N-Acetylglucosaminidase 5 </td><td> 0.25 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> אנדו-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) 5 </td><td> 0.013 U / mL במאגר deglycosylation (1x) </td></tr><tr><td> PNGase-F (N-glycosidase-F) 6 </td><td> 50 U / mL ב H 2 O 18 </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> 0.01 מיקרוגרם / μL במאגר TEAB </td></tr><tr><td> הערות בטבלה. </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 שמור פתרון מניות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 רש&quot;ת צריך להישמר מפני אור. </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 SDS מתגבש בקלות על &lt;20 ° C. על מנת להקל solubilization של 1% SDS (פתרון מניות), לחמם את החיץ תחת מים ברז חמימים. </td></tr><tr><td colspan="2"> ניתן לאחסן 4 מאגרי חילוץ ב RT. הוסף קוקטייל ספקטרום רחב של מעכבי proteinase כמצוין לפני השימוש. </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 אלה אנזימים יש להוסיף במהלך השלב הראשון deglycosylation. </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGase-F יש להוסיף רק במהלך השלב השני deglycosylation. </td&gt; </tr></tbody></table> טבלה 1: פתרונות מניות, חוצצי תגובה ואנזימים. טבלה זו מפרטת את ההרכב של כל חיץ פתרון ותגובת מניות הנדרשים להפקה והעיבוד הבא (כולל digestions אנזימטי) של חלבוני ECM לב לפני ניתוח MS.

Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...