Name: glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

JBBは王の英国心臓財団センターでのキャリア構築フェローです。 MMは、英国心臓財団（FS / 13/29892分の2）のシニアフェローです。研究は優秀イニシアティブ（優れた技術のためのコンピテンス・センター - COMET）によってサポートされていましたオーストリアの研究振興事業FFGの「血管における優秀研究センターエイジング - チロル、VASCage」（K-プロジェクト番号843536）とNIHR生物医学研究をキングスカレッジ病院との提携でガイさんとセントトーマスの国民保健サービス財団トラストとキングス・カレッジ・ロンドンを拠点センター。

<ol>
	<li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts:+at+the+heart+of+myocardial+remodeling.">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia/reperfusion+injury.">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation.">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li><li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li><li>Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Roles+of+Glycans.">Biological Roles of Glycans.</a> Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+-+opportunities+and+challenges:+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix.">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li><li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. 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Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms:+a+proteomics+approach.">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice:+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis.">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li><li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells.">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment.">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Pepinsky, R. 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B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity.">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues.">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+extracellular+matrix:+an+ever-changing+and+diverse+entity.">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li></ol>

このプロテオミクスプロトコルは、我々の研究室で過去数年間に最適化されています。ここでは、心臓組織を使用したが、わずかな調整は、他の組織への適用のために必要となる場合があります。例えば、抽出プロトコルを考慮に組織の細胞性を取る必要があります。心臓組織、血管組織と比較して高い細胞です。血管組織を使用する場合、SDS濃度が低い（ すなわち、0.08％）であることができ、脱細胞化時間が短い（ すなわち 4時間）11、12、13です。脱グリコシル化酵素の使用は、ECM組成物のLC-MS / MS分析のために重要です。しかし、インキュベーション時間は、異なる組織タイプのために調整する必要があります。 （データは示していない）（ 例えば、アグリン、パールカン）基底膜タンパク質が豊富で皮膚などのサンプルを使用する場合、例えば、25℃でII必要拡張インキュベーション時間をヘパリナーゼ。直接糖ペプチド解析は、培養液15中の細胞からの馴化培地上で実行することができます。濃縮手順は、この単純化されたsubproteomeの分析のために必要とされない場合があります。 GuHCl抽出物と同様に、NaClの抽出物はまた、小さな変更を有するグライコプロテオミクス分析のために適しています。 ECMタンパク質の濃縮のための他の抽出プロトコルは、ECM糖ペプチド19、20を特徴付けるために適合させることができます。 グリコシル化は、最も複雑なPTM 5です。糖ペプチドの間接的な同定は、NXT / Sのシークオンに組み込ま18 Oで脱アミド化Asnでの検出によって達成されます。他の位置で脱アミド化Asnが偽陽性を表すことができます。同様に、Nグリコシル化は、タンパク質オントロジーの文脈で考慮されなければならない：NXT / Sのシークオンを含む細胞内タンパク質はグリコシル化されることはありませんが、偽陽性を生じる可能性があります。現在searcとして、Hアルゴリズムは所定の配列のみ（NXT / Sで、すなわち ASN）でのPTMのスクリーニングを可能にしない、データの手動フィルタリングが必要とされます。これらの位置でのグリコシル化の存在/非存在の同定は、疾患と対照試料間で比較することができます。 O-脱グリコシル化のためのPNGアーゼFへの酵素と同等（ すなわち、トレオニンまたはセリンに質量シフトを導入する）が存在しません。従って、O-グリコシル化の同定は、直接糖ペプチドの分析に限定されます。直接グリコペプチド解析は、タンパク質に付​​着した糖の組成情報を得るために使用されるが、グリカンの構造的な情報を提供しません。また、グリカン組成物は、分泌後のグリカン合成およびプロセシングの結果です。 ECMタンパク質のための私達の3段階抽出法（「英語クイックステップ」）6は、心臓血管組織の様々なECMを特徴付ける可能にしました。組織の分別他所6論じたように、いくつかの抽出に簡略化されたECMプロテオームを得るために必要とされます。細胞内タンパク質は、そうでなければあまり豊富ECMタンパク質の同定を妨げる抽出物中のタンパク質の存在量の過剰なダイナミックレンジに貢献します。また、細胞内タンパク質は、ECM糖ペプチドの濃縮及びその後のMS分析を複雑になるO -グリコシル化5を運びます。他の著者は、しかし、彼らはグリコシル化の分析を追求していなかった、例の肺21と軟骨組織10のために特徴付けるために同様の抽出方法論を適用します。 glycositesの識別に焦点を当てたグリコシル化の前の分析は、タンパク質コアからのグリカンの除去を必要とし、O-グリコシル化22、23を評価することはできません。レクチンアレイと化学濃縮は、グリカン標準の評価のために用意されてい生物学的サンプルのESは、それらの結合特異性に基づいて、これらの技術は、特定のタンパク質24にグリカンタイプを割り当てることができないも、彼らは、グリコシル化部位を評価することができます。 最初に、我々は、従来のECMタンパク質のLC-MS / MSにゲル電気泳動を使用します。ゲル分離は、LC-MS / MS分析に適し簡略化されたタンパク質画分を得る上で有用であるが、最新の機器は、より速いスキャン速度を提供します。このように、電気泳動分離工程を省略することができます。ゲルの上に保持されている大型のECMタンパク質は、より効率的に分析され、これは付加的な利点を提供します。しかし、完全なタンパク質のMwに関する情報が失われます。 PNGアーゼF脱グリコシル化前に蒸発工程は、偽陰性を最小限に抑えるために、通常のH 2 Oの完全な除去を保証します。糖残基（ すなわち、可変グリカン質量）LCによる分離に干渉し、MS / MSによって後続ペプチド同定を損ないます。 P- 脱グリコシル化プロトコルはまた、グリコシル化に焦点を当てていないECMタンパク質のプロテオミクス解析のために推奨されます。 プロテオミクスはECMに前例のない洞察を提供することができます。構造的な支持を超えて、ECMに添付グリカンは、臓器移植後の同種移植片拒絶反応、 すなわち宿主-病原体相互作用、細胞間コミュニケーションと免疫応答25のために不可欠です。グライコプロテオミクスは糖鎖生物学に不可欠なツールとなるでしょう。

線維症は、多くの疾患の特徴です。線維芽細胞が増殖し、細胞外マトリックス（ECM）1の悪化分泌および沈着に関連している高度に合成表現型に向かって分化します。過剰なECM沈着は、機能障害につながる、最初の損傷が弱まった後でも、続けることができます。プロテオミクスを使用して、我々は以前に心臓組織2、3で150以上のECMとECM関連タンパク質を同定しました。彼らは唯一の構造タンパク質ではなく、また、継続的な改造や心臓のダイナミックな適応に貢献マトリックス細胞タンパク質およびプロテアーゼ。特に、多くのECMタンパク質が4グリコシル化されています。この翻訳後修飾（PTM）は、特定のアミノ酸位置への糖残基の付加を伴い、それが結合、タンパク質の折り畳み、溶解度に影響を与え、劣化5 </s&gt;アップ。 哺乳類で発生する二つの主要なグリコシル化のタイプがあります。 （1）N-グリコシル化は、Xaaは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、コンセンサス配列はAsn-Xaaは、Thrで/ SER内のアスパラギン残基（ASN）のカルボキサミド窒素で起こります。 （2）O-グリコシル化において、糖残基ヒドロキシプロリンとヒドロキシリシンするために、はるかに少ない程度に、セリンおよびトレオニン残基（セリン、Thrで）に付着又は。 O-グリコシル化は、タンパク質グループの様々な起こり得るが、N-グリコシル化は、分泌タンパク質または膜タンパク質5の細胞外ドメインに制限されています。 ECMを勉強するときに、N-グリコシル化に魅力的な標的になります。 プロテオミクスは、疾患におけるタンパク質の変化を分析するための新しい標準を設定します。これまでのところ、ほとんどのプロテオミクス研究では、細胞内タンパク質6に焦点を当ててきました。これは、主に次のような理由によるものです。まず、豊富な細胞内タンパク質は、同定を妨げます希少なECM成分の品名。これは、ミトコンドリア及び筋フィラメントタンパク質は、タンパク質含有量7の大きな割合を占めた心臓組織において特に重要です。第二に、一体型ECMタンパク質が重く架橋および可溶化することは困難です。最後に、豊富のPTM（ すなわち、グリコシル化）の存在は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）による分離及び同定の両方に影響を与える、分子量、電荷、及びペプチドの電気泳動特性を変化させます。ここ数年、私たちは、その後の質量分析（MS）分析と互換性のあるECMタンパク質のための逐次抽出および濃縮法を開発し、改善しています。戦略は、順次インキュベーションに基づいています。 最初のステップをNaCl、ECM関連し、緩く結合したECMタンパク質、ならびに新たに合成されたECMタンパク質の抽出を容易にイオン緩衝液を用いて行われます。それは私S洗剤フリー、非変性、細胞膜の無停止、およびさらに生化学的アッセイのために8やすいです。次いで、脱細胞化は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を用いて達成されます。この段階で、低いSDSの濃度は、膜不安定化及びより可溶性非整数ECM成分の破壊を防止しながら、細胞内タンパク質の放出を確実にします。最後に、ECMタンパク質をグアニジン塩酸塩緩衝液（のGuHCl）で抽出します。 GuHClは、腱9、軟骨10、容器11、12、13及び心臓2、3のような組織から高濃度架橋タンパク質およびプロテオグリカンを抽出するのに有効です。私たちは、心血管疾患2にECMリモデリングを探るために、LC-MS / MSとの組み合わせで、この生化学的分別を適用しました<sup&gt;、3、11、12、13、14。 MSの最近の進歩は、無傷の糖ペプチド3、15の直接分析を可能にするより高いエネルギーの衝突解離（HCD）および電子移動解離（ETD）の組み合わせ、などの新規な断片化方法が挙げられます。 ここでは、タンパク質組成物、グリコシル化部位の同定、およびグリカン形態の特性の分析を可能にするMS分析のためにECMを調製する方法を記載しています。 ECMのグリコシル化16の以前の分析と比較すると、この方法論は、MSを用いた部位特異的にグリコシル化プロファイルの組成変化を直接評価することができます。私たちは、心血管組織にこの方法論を適用しています。しかし、それができアルので、他の組織標本におけるECMの研究に、わずかな変更で、適用されるとECMの生物学に前例のない洞察を提供することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A. Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS-grade&#160;(ACN, C2H3N)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail of proteinase inhibitors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2H2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (C2H6O)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437433T</td>
			<td>2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (C3H8O3)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>158920025</td>
			<td>Suppl 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O LC-MS Cromasolv</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td>Throughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H218O</td>
			<td>Taiyo Nippon Sanso</td>
			<td>FO3-0027</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HA, H3NO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51226</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (C2H3NaO2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7545</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>1.4.1, 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>466143</td>
			<td>1.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11268</td>
			<td>4.7, 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T62200</td>
			<td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea (CH4N2S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>1.4.1, Suppl 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (CH4N2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U1250</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0012)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;1,4-Galactosidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0004)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-N-Acetylglucosaminidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0013)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0011)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6512</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratanase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6920</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase-F (N-Glycosidase F)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0001)</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. Reagent kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 kDa MWCO spin filters&#160;</td>
			<td>Amicon, Millipore</td>
			<td>10256744</td>
			<td>5.9, Suppl 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-5657</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>NP0322PK2</td>
			<td>Suppl 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>72103</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem mass tag 0 (TMT0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>900067</td>
			<td>6.2, 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. Equipment and software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300&#181;m, 5&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75&#181;m, 3&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byonic Search Engine</td>
			<td>Protein Metrics</td>
			<td>Version 2.9.30</td>
			<td>Suppl 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray Ion Source&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES081</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&#160; 50cm x 75&#181;m, 2&#956;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot Search Engine</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Version 2.3.01</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Version 2.1.1.21</td>
			<td>Suppl 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoview Nanospray Source</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>550</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Savant SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD131DDA</td>
			<td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaffold Software</td>
			<td>Proteome Software&#160;</td>
			<td>Version 4.3.2</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry

線維症は、多くの心血管疾患の顕著な特徴であり、細胞外マトリックス（ECM）の悪化分泌および堆積に関連しています。プロテオミクスを使用して、我々は以前に、心血管組織における150以上のECMとECM関連タンパク質を同定しました。特に、多くのECMタンパク質は、グリコシル化されています。この翻訳後修飾は、タンパク質の折り畳み、溶解性、結合、および劣化に影響を与えます。我々は、無傷の糖ペプチドのその後の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS / MS）分析に対応しているECMタンパク質に対する逐次抽出及び濃縮方法を開発しました。戦略は、組織の脱細胞化、およびECMタンパク質の可溶化のための塩酸グアニジンのためにNaClを、SDSによる逐次インキュベーションに基づいています。 LC-MS / MSにおける最近の進歩はを可能にするような、より高いエネルギーの衝突解離（HCD）および電子移動解離（ETD）の組み合わせのような断片化方法を、含みますECMタンパク質の糖ペプチドの直接の組成分析。本論文では、組織サンプルからECMを調製する方法を記載します。この方法は、タンパク質プロファイリングもMS分析による評価およびグリコシル化の特徴付けのためにできるだけでなく。

プロトコルの概略的なワークフローを図1に提供されます。 ECM抽出プロトコル抽出の効率は、アリコートを実行することによってモニターすることができるビス - トリスアクリルアミドゲル上の各抽出物を形成し、視覚化のために銀染色を用いました。 図2Aは、逐次抽出後のNaCl、SDSとのGuHCl抽出物の相補性を示します。このQCは、過剰なタンパク質分解などのサンプル品質の潜在的な問題の識別を可能にします。抽出後、ECM糖タンパク質は、のGuHCl抽出物（ 図2B）において豊富です。 脱グリコシル化脱グリコシル化の効率を評価するために、非脱グリコシル化制御は、PAで実行する必要がありますrallel。脱グリコシル化時間は、図3（a）に例示したように、糖残基の完全かつ均質な除去を達成するために適していることがあります。 図3Bは、効率的に小さくN-およびO-結合オリゴ糖を標的化GAGの除去および脱グリコシル化酵素の酵素の添加によって脱グリコシル化試料の代表的な例を示しています。 グライコプロテオミクス NXT / Sのセクオンの占有率を評価するためのプロトコルは、MS（ 図3C）の後ECM糖タンパク質についてのタンパク質配列カバー率を改善し、糖タンパク質の存在の最初のスクリーニングを可能にします。データベースが以前に同定された糖タンパク質を含むようにカスタマイズすることができ、これは、糖ペプチドのための検索時間を短縮するのに役立ちます。 HCD-ETDフラグメンテーションは、ECM gに取り付けられたオリゴ糖の同定および組成特徴付けのために使用されています<html> lycoproteins。 図4Aは、脱グリコシル化（間接的な糖ペプチド分析）の後に18 Oで標識されたペプチドについて得られた代表的なスペクトルを表示します。 図4Bは、ECM抽出物から無傷の糖ペプチド（直接糖ペプチド分析）の分析後に得られたスペクトルの代表例です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> 図1：メソッドの概要。 （A）ECMタンパク質について順次濃縮した後、LC-MS / MS分析は、脱グリコシル化された抽出物に対して行われます。 （B）あるいは、非脱グリコシル化されたECM抽出物をさらに糖ペプチドについて濃縮されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：ECMタンパク質の抽出。 （A）逐次抽出手順（「英語クイックステップ」）から、3つの異なる抽出物は、それらのタンパク質含有量に相補的です。 SDS抽出物は、細胞内タンパク質に富んでいるが、のGuHCl抽出物は、ECMタンパク質の大部分を含んでいます。成功した分別は異なる銀染色パターンにより可視化されます。 （B）ECMタンパク質は、小ロイシンリッチプロテオグリカンのデコリン、バイグリカン及びmimecanとして主SDSおよびNaCl抽出物中のほとんど存在と、のGuHCl抽出物中で検出されます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> 図3. Glycの分析osylation。 （A）は、適切なインキュベーション時間は、完全な脱グリコシル化のために必要とされます。例は、糖タンパク質デコリンからのグリコサミノグリカン鎖の除去の間インキュベーション時間の効果を示しています。 （B）ECM糖タンパク質は、大規模で繰り返しグリコサミノグリカン鎖と短い多様なN-およびO-結合オリゴ糖が施されています。イムノブロットの各々の上のレーン1は、未処理の心臓抽出物を表します。レーン2は、グリコサミノグリカンを消化する酵素で処理した抽出物を含んでいます。レーン3のサンプルは、加えて、N-およびO-結合oligossacharidesを除去するための酵素を含みます。ガレクチン-1は、したがって、タンパク質の大きさには変化がない、グリコシル化されていません。リンチM、 らから適応。 図4（C）LC-MS / MS分析では、H 2 18 Oの存在下でPNGアーゼFで処理した試料は、非脱グリコシル化されたサンプルと比較して（右側％）より良好な配列カバレッジを達成します。 DLC-MS / MSによって配列カバレッジを表す緑色領域をアーク。赤い点線は、それらのアミノ酸の位置を示す数字と、glycositesを表します。位置におけるデコリンのグリコシル化の検出211のAsn（N、太字で強調）は、図4に一例として詳細に示されている<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">。この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> 図4. MSによる糖ペプチドの分析。 （A）ECM富化された抽出物にショットガンプロテオミクスアプローチを用いて、糖ペプチドをNXT / Sのセクオン内の脱アミド化アスパラギンの存在によって同定され、18 Oで標識することができる例は、含有デコリンのペプチドに対するHCD MS / MSスペクトルを示します以前のAsn 211にグリコシル化。得られたデータを使用することができますECM糖タンパク質のカスタマイズされたデータベースを作成します。 （B）HCD-ETDフラグメンテーションは、グリコペプチド富化ECM抽出物を分析するために使用されます。 ETD MS / MSスペクトルは、グリカン組成の特徴付けを可能にします。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A.ストック溶液 </td><td></td></tr><tr><td> DTT（ジチオトレイトール、C 4 H 10 O 2 S 2） </td><td> 100のddH 2 Oで1 mMのDTT </td></tr><tr><td> EDTA（エチレンジアミン四酢酸、C 10 H 16 N 2 O 8） </td><td> ddH 2 O、pH8.0中の250mM EDTA。 </td></tr><tr><td> GuHCl（塩酸グアニジン、CH 6 CLN 3） </td><td> 8 MのGuHCl中ddH 2 O. </td></tr><tr><td> IAA（ヨードアセトアミド、C 2 H 4 INO） </td><td> ddH 2 O 1,2における500mMのIAA </td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム（酢酸ナトリウム、C 2 H 3 NaOが2） </td><td> ddH 2 O中1M酢酸Na、pHは5.8。 </td></tr><tr><td> NaCl（塩化ナトリウム、NaCl）で</td><td> ddH 2 O中1MのNaCl </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基（リン酸二ナトリウムのNa 2 H 2 PO 4） </td><td> DD H 2 O、pHを6.8に1 Mリン酸ナトリウム二塩基。 </td></tr><tr><td> SDS（ドデシル硫酸ナトリウム、のNaC 12 H 25 SO 4） </td><td> ddH 2 O 3 1％SDS（35ミリモル） </td></tr><tr><td> TFA（トリフルオロ酢酸、C 2 HF 3 O 2） </td><td> ddH 2 O中の10％TFA（1.2 M） </td></tr><tr><td> TEAB（重炭酸トリエチルアンモニウム、C 7 H 17 </サブ&gt; NO 3） </td><td> ddH 2 O、pH8.5の中での1M TEAB </td></tr><tr><td>チオ尿素（チオ尿素、CH 4 N 2 S） </td><td> ddH 2 Oで3 Mチオウレア</td></tr><tr><td>トリス-HCl（トリス-塩酸（NH 11 C 4 O 3 [塩酸]） </td><td> ddH 2 O、pH7.5中の100mMのTris-HCl。 </td></tr><tr><td>尿素（尿素、CH 4 N 2 O） </td><td> ddH 2 O 9 M尿素</td></tr><tr><td> B.反応バッファー </td><td></td></tr><tr><td> C18クリーンアップ平衡緩衝液</td><td> ddH 2 O中1％ACN、0.1％TFA </td></tr><tr><td> C18クリーンアップカラム洗浄バッファー</td><td> H 2 O中80％ACN、0.1％TFA </td></tr><tr><td> C18のクリーンアップの溶出バッファー</td><td> ddH 2 O中の50％アセトニトリル、0.1％TFA </td></tr><tr><td>脱グリコシル化バッファー（4×） </td><td> 600mMのNaClおよびのddH 2 O、pHは6.8で200mMのリン酸Na。 </td></tr><tr><td> GuHClバッファ4 </td><td> 4 M塩酸グアニジン、50mMの酢酸ナトリウムとのddH 2 O中に25mMのEDTA、pHは5.8。使用前にプロテアーゼ阻害剤のカクテル：100（V V：1）を追加します。 </td></tr><tr><td> NaCl緩衝液4 </td><td> 0.5MのNaCl、10mMのトリス-HClとのddH 2 O中に25mMのEDTA、pHは7.5。使用前にプロテアーゼ阻害剤のカクテル：100（V V：1）を追加します。 </td></tr><tr><td> PBS（1×） </td><td> 1.7 mMのKH 2 PO 4、5mMののNa 2 HPO 4、150mMのNaCl、pH7.4中。使用前にプロテイナーゼ阻害剤カクテル：100（V V：）、25mMのEDTA及び1を加えます。 </td></tr><tr><td>サンプルバッファー（4×） </td><td> 100mMのTris、2％SDS、のddH 2 O、pH6.8の中40％グリセロール、0.02％ブロモフェノールブルー。使用前に10％のβメルカプトエタノールを追加します。 </td></tr><tr><td> SDSバッファー4 </td><td> O. 1の追加のddH 2中0.1％SDSおよび25mM EDTA：100（V：V）プロテイナーゼインヒビターBEFのカクテル鉱石の使用。 </td></tr><tr><td> C.酵素 </td><td></td></tr><tr><td>コンドロイチナーゼABCの5 </td><td> 0.5脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td>ケラタナーゼ5 </td><td> 0.1脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td>ヘパリナーゼII 5 </td><td> 0.1脱グリコシル化緩衝液（1×）でU / mLの</td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9 -ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.025 U / mLの</td></tr><tr><td> β1,4ガラクトシダーゼ5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.015 U / mLの</td></tr><tr><td> β-N-アセチルグルコサミニダーゼ5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.25 U / mLの</td></tr><tr><td>エンドα-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（O-グリコシダーゼ）5 </td><td>脱グリコシル化緩衝液（1×）で0.013 U / mLの</td></tr><tr><td> PNGアーゼF（N-グリコシダーゼF）6 </td><td> 5H 2 18 O中0 U / mLの</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td> TEABバッファーで0.01μgの/μL </td></tr><tr><td> テーブルNOTES。 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 -20℃で凍結保存溶液を保管してください。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 IAAは、光から保護し維持しなければなりません。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 SDS容易に&lt;20℃で結晶化します。 1％SDS（原液）の可溶化を促進するために、熱い水道水で緩衝液を温めます。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 4つの抽出バッファは室温で保存することができます。使用前に示されるように、プロテアーゼ阻害剤の広域スペクトルのカクテルを追加します。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 5これらの酵素は、第一脱グリコシル化工程の間に添加されるべきです。 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGアーゼFは、第二の脱グリコシル化工程の間に添加されるべきです。 </TD&gt; </tr></tbody></table> 表1：株価ソリューション、反応緩衝液および酵素。このテーブルは、MS分析の前に心臓ECMタンパク質の抽出、（酵素的消化を含む）以降の処理に必要な各ストック溶液を、反応緩衝液の組成を示しています。

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Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

本稿では、ECMタンパク質組成物の（1）分析、グリコシル化部位の（2）識別、およびグリカン形態の（3）組成の特徴付けを可能にするMS分析のために心臓血管組織サンプルを調製する方法を記載しています。この方法は、他の組織におけるECMの研究に、軽微な修正を適用することができます。

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