Name: glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry
Uploaded: 2017-04-21T15:00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

JBB er en karriere Etablering Fellow i kongens British Heart Foundation Center. MM er en Senior Fellow ved British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). Studien ble støttet av en fremragende initiativ (kompetansesentre for Excellent Technologies - Comet) av østerrikske Forskning Promotion Agency FFG det: &quot;Research Center of Excellence i Vaskulær Aldring - Tyrol, VASCage&quot; (K-Prosjektnummer 843536) og NIHR Biomedical Research senter basert på Guy og St. Thomas&#39; National Health service Foundation Trust og Kings College London i samarbeid med Kings College Hospital.

Studien ble godkjent av Wandsworth lokale forskningsetiske komité (referansenummer: 06 / Q0803 / 37) og fikk institusjonelle godkjenning fra forskning og utvikling kontor. Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke. 1. Utvinning av ekstracellulære matrix proteiner MERK: Den menneskelige atrial vev som brukes for disse forsøkene ble oppnådd fra auriklene under kardiopulmonal bypass, like etter kardioplege arrestasjonen av hjertet. Alle prøvene ble samlet ved St. Jørgens Hospital, London, UK. Alle vevsprøver skal fryses ved -80 ° C. Ikke bruk Prøvene bevarte med fiksativer, slik som paraformaldehyd, at kryssbinde proteiner. <ol><li> Forbered alle utvinning buffere i forkant av forsøk, som angitt i tabell 1, for å minimalisere den tiden mellom de ekstraksjonstrinnene. Utføre alle inkubasjoner ved romtemperatur (RT) i et temperaturkontrollert miljø(Dvs. ~ 20 ° C) for å sikre overensstemmelse mellom ekstraksjonene. </li><li> Veier 20-50 mg vev. Dersom flere prøver skal tas ut, skjæres og veie dem en etter en for å unngå fullstendig tining av vevet. Ved hjelp av en skalpell, terninger vevet inn 3-4 mindre biter (dvs. 2-3 mm) og plassere dem sammen i 1,5 ml rør. </li><li> Tilsett 500 ul iskald fosfat-bufret saltvann (PBS; se tabell 1 og tabell of Materials) og utføre fem vaskinger for å redusere blodforurensning. </li><li> Ekstraksjon Trinn 1: Inkubering med NaCl Buffer <ol><li> Etter vasking med PBS, plasserer prøvene på 1,5 ml rør med skrukork. Legg NaCl-buffer (se tabell 1) til 10 ganger (v: v) den vevsvekt. Vortex rørene ved RT i 1 time ved minimum hastighet (dvs. 600 rpm). MERK: En lav virvelhastighet er avgjørende for å unngå mekanisk ødeleggelse av vevet i løpet av dette trinn.Bruke et skum adapter for å sette alle rørene under ekstraksjonen. </li><li> Overfør ekstrakter til nye rør og sentrifuger ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Oppbevar ekstraktene ved -20 ° C inntil bruk. I korthet vaske de gjenværende vev pellets med frisk NaCl-buffer. Bruk samme type buffer (dvs. 100 ul NaCl-buffer) for vasking for å forhindre ekstraksjon av andre proteiner med forskjellig oppløselighet (dvs. proteiner som ikke er ekstraherbare med NaCl). </li><li> Etter vasking, for å sikre fullstendig fjerning av buffer for å redusere overlappingen i proteininnhold med etterfølgende ekstraheringstrinn. Kast den NaCl-buffer som brukes for vasking. MERK: Forholdet mellom buffervolum og vekt vev er viktig for en reproduserbar ekstraksjon. En 10: 1-forhold (v: v) for NaCl og SDS ekstraksjoner og 5: 1 for den GuHCl trinnet gi tilstrekkelige mengder protein uten å fukte buffer. Proteinkonsentrasjonen er omtrent 1-2 pg / mL etter extraction. </li></ol></li><li> Utvinning Trinn 2: Decellularization med SDS Buffer <ol><li> Legg SDS buffer (tabell 1) til ti ganger (v: v) i vevet vekt; bruken av lave SDS konsentrasjoner (det vil si, 0,1%) er avgjørende for å unngå tap av ECM-proteiner under decellularization. Vortex rørene ved RT i 16 timer ved minimum hastighet (dvs. 600 rpm). MERK: En lav vortex hastighet minimerer mekanisk forstyrrelse av ECM. </li><li> Overfør ekstraktene til nye rør. Sentrifuger ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C; oppbevar ved -20 ° C inntil bruk. I korthet vaske de gjenværende vev pellets med dd H2O for å fjerne SDS. Sikre fullstendig fjerning av væsken etter vaskingen. </li></ol></li><li> Ekstraksjon Trinn 3: Inkubering med GuHCl Buffer <ol><li> Legg GuHCl buffer (tabell 1) ved fem ganger (volum: w) av de vevsvekt. Vortex rørene ved RT i 72 timer ved maksimal hastighet (dvs. </em&gt; 3200 rpm); kraftig virvling letter mekanisk ødeleggelse av ECM. </li><li> Overfør ekstraktene til nye rør. Sentrifuger ved 16000 x g i 10 min ved 4 ° C og oppbevares ved -20 ° C inntil bruk. </li></ol></li></ol> 2. Protein Kvantifisering og nedbør MERK: På grunn av tilstedeværelsen av vaskemidler, er det SDS buffer uforenlig med direkte protein kvantifisering basert på målinger av absorbans ved 280 nm. For å sikre reproduserbare kvantifisering, bruke kolorimetriske assays for alle proteinekstrakter 17. <ol><li> Kvantifisering. <ol><li> Forbered standarder for en kalibreringskurve ved anvendelse av bovint serumalbumin (BSA) serielt fortynnet i det egnede ekstraksjonsbuffer (dvs. NaCl, SDS, eller GuHCl) 17. I løpet av denne tiden, tine prøve ekstrakter. </li><li> Fortynn prøvene i utvinning buffer for å oppnå konsentrasjoner innenfordet lineære området av absorbans; en 1:10 fortynning (v: v), gir tilfredsstillende resultater. Fortynn de GuHCl prøver med en lik mengde av DDH 2 O for kvantifisering, som den kolorimetriske analyse er ikke kompatibel med konsentrasjoner på&gt; 4 M GuHCl. </li><li> Bruke en bicinchoninic syre (BCA) -baserte kolorimetrisk analyse 17 (se tabell of Materials), ved å følge produsentens instruksjoner for prøving i et 96-brønners plater; Det anbefales å utføre i det minste duplikate målinger. </li><li> Etter inkubering i 30 min, ta avlesninger ved en bølgelengde på 570 nm for å beregne proteinkonsentrasjon ved bruk av BSA-standard kalibreringskurve 17. </li></ol></li><li> protein Nedbør <ol><li> Tine GuHCl ekstrakter ved RT. Alikvoter 10 ug av protein for hver prøve til nye rør. For et glykopeptid direkte analyse, delmengde 50 ug. Tilsett 10 ganger volumet av etanol og incubate over natten ved -20 ° C. MERK: GuHCI er ikke kompatibel med ytterligere enzymatiske reaksjoner og de fleste elektro applikasjoner. Fjerning av GuHCI er nødvendig før deglycosylering og trypsin fordøyelsen. Løseligheten av GuHCl i etanol, og omvendt, den lave oppløselighet av proteinene muliggjøre effektiv fjerning av GuHCl mens man oppnår omtrent et 98% utbytte av proteiner 18. </li><li> Prøvene sentrifugeres ved 16000 x g i 30 minutter ved 4 ° C og aspirer supernatanten. Pass på å ikke forstyrre utfelt pellet. Tørk pelletene i 15 minutter under anvendelse av vakuum-konsentrator (se tabell of Materials) ved romtemperatur. MERK: Protokollen kan stoppes her, og de tørkede pelletene lagret ved -20 ° C inntil bruk. </li><li> Eventuelt kan drives av en gel-elektroforese som kvalitetskontroll (QC, se de supplerende metoder). </li></ol></li></ol> 3. Sekvensiell Deglykosylering forVurdering av N-glykosylering nettstedet Occupancy <ol><li> Under prøvetørking (se trinn 2.2.2), fremstille det deglykosylering buffer som inneholder deforgren deglykosyleringseksperimenter enzymer, i henhold til tabell 1. Se tabell for material for produktdetaljer. </li><li> Tilsett 10 pl av deglykosylering buffer inneholdende enzymer til hver prøve. Sikre riktig pellet resuspensjon ved å utføre en rask vortex og spin-down av prøver. MERK: Fjerning av sukkermonomere ved hjelp av avgrenende enzymer som er vesentlig for den etterfølgende og fullstendig fjerning av O-bundne kompleks sakkarider og letter den senere spalting av N-bundede sukkere ved PNGase-F. </li><li> Inkuber i 2 timer ved 25 ° C for å gi adgang for fjerning av heparansulfat med heparinase II.Increase temperaturen til 37 ° C og inkuberes i 36 timer med forsiktig omrøring. MERK: Gitt den lave reaksjonsvolumer og forlengede inkubasjonstider, bruk inkubator ristere og tett pakke multiplum 1,5 ml kares inne i en 50 ml konisk rør lener seg inne i inkubator ved ca. 45 °. </li><li> Etter 36 timer, sentrifugering av prøvene i 1 minutt ved 16.000 xg og fordamp H 2 O fra prøvene ved anvendelse av en vakuum-konsentrator ved romtemperatur i ca 45 min. </li><li> Resuspender de tørkede prøver med 10 pl H 2 18 O inneholdende 50 U / mL PNGase-F, som spalter alle asparagin-bundne glykaner i en Deamideringsreaksjonen. NB: Den resulterende asparaginsyre bærer et overskudd masse på 2,98 Da, som indikerer nærvær av N-glykosylering i løpet av MS-analyse. </li><li> Inkuber i 36 timer ved 37 ° C under konstant omrøring i risteinkubator. </li></ol> 4. I-løsning Trypsinspaltning MERK: Dette trinnet bør utføres for både ikke-deglykosylert (dvs., som brukes for direkte analyse glykopeptid) og deglykosylert prøver (dvs. som brukes for vurdering av glykan occupancy). <ol><li> Bruk 10 mikrogram av totalt protein for vurdering av N-glykosyleringssete belegg (som angitt i det foregående trinn). For prøver som er beregnet for direkte glycopeptide analyse ved å bruke 50 ug protein som utgangs beløp. MERK: De følgende trinn er beskrevet for 10 ug protein. Skalere opp th evolumes (dvs. 5 ganger til 50 ug) etter behov. </li><li> Denaturere proteinene på hver prøvealiquot anvendelse av 9 M urea og 3 M tiourea, med en sluttkonsentrasjon på 6 M urea og 2 M tiourea, henholdsvis (for eksempel, for en 10 ul prøve, 20 ul av urea / tiourea). </li><li> Reduser proteinene ved tilsetning av 100 mM ditiotreitol (DTT, 3,33 ul, sluttkonsentrasjon: 10 mM). Inkuber ved 37 ° C i 1 time med omrøring ved 240 rpm. </li><li> Kjøl ned prøvene til romtemperatur før det utføres alkyleringen ved tilsetning av 0,5 M jodacetamid (3,7 ul; sluttkonsentrasjon: 50 mM). Inkuber i mørke i 1 time. </li><li> Bruk forhånd avkjølt (-20° C) aceton (6 ganger volumet av prøven) for å inkubere prøvene over natten ved -20 ° C. Bunnfall ved sentrifugering ved 14 000 xg i 25 min ved 4 ° C. </li><li> Aspirer supernatanten. Pass på å ikke forstyrre utfelt pellet. Tørk de proteinpelletene ved hjelp av en vakuum-konsentrator i 30 minutter ved RT. </li><li> Resuspender i 20 ul 0,1 M trietylammoniumbikarbonat (TEAB) buffer, pH 8,2, inneholdende trypsin (0,01 ug / ul) og fordøye over natten ved 37 ° C og 240 rpm. </li><li> Stopp fordøyelse ved surgjøring av prøven med 10% trifluoreddiksyre (TFA, ble 2 ul for en endelig konsentrasjon på 1% TFA). </li></ol> 5. Peptide Cleanup Bruke C18 kolonner MERK: Fjerning av forstyrrende forurensninger fra peptidblandingen etter fordøyelse reduserer ion undertrykkelse og forbedrer signal-til-støy-forhold og sekvens dekning. Dette trinnet bør utføres for både ikke-deglykosylert og deglykosylert SAmples. <ol><li> Aktiver harpiks på C18 sentrifugeplaten (se tabell of Materials) ved bruk av 200 pl metanol pr brønn, og sentrifuger ved 1000 xg i 1 min. </li><li> Vask ved tilsetning av 200 ul per brønn av 80% acetonitril (ACN) og 0,1% TFA i H2O Sentrifuger ved 1000 x g i 1 min. </li><li> Ekvilibrer ved tilsetning av 200 ul per brønn av 1% ACN og 0,1% TFA i H2O Sentrifuger ved 1000 x g i 1 min. Gjenta dette trinnet to ganger til. </li><li> Load prøvene (totalvolum) fra trinn 4 inn i brønnene inneholdende harpiksen og sentrifuger ved 1500 xg i 1 min. Last gjennomstrømning en gang til og gjenta sentrifugering. </li><li> Vask ved tilsetning av 200 ul per brønn av 1% ACN og 0,1% TFA i H2O Sentrifuger ved 1500 x g i 1 min. Gjenta dette trinnet to ganger til. </li><li> Eluere prøvene med 170 ul per brønn av 50% ACN, 0,1% TFA i H2O Sentrifuger ved 1500 x g i 1 min. Gjenta forrige trinnog kombinere den oppsamlede eluat. </li><li> Tørk eluatet ved hjelp av en vakuum-konsentrator i 2 timer ved RT. Dersom det ikke er i bruk med en gang, holder de tørkede prøvene ved -80 ° C inntil bruk. MERK: deglykosylert prøvene beregnet på protein identifikasjon bare er klar til bruk til LC-MS / MS etter dette trinnet. Trinn 6 og 7 er ikke nødvendig for disse prøvene. </li><li> Tine og resuspender deglykosylert prøvene i 2% ACN og 0,05% TFA i H2O til en endelig proteinkonsentrasjon på 0,5 pg / pl. Gå til trinn 6 for den direkte glykopeptid-analyse av ikke-deglykosylert prøver. </li><li> Eventuelt kan filtrere peptidene før merking med tandem massemerker (TMT); se de supplerende Metoder for peptid filtreringen. </li></ol> 6. Merking med TMT (for direkte glykopeptidreagens Analysis Only) <ol><li> Tine og resuspender tørkede pellet i 50 pl av 50 mM TEAB for å oppnå en konsentrasjon på 1 pg / pl. </li><li> Resusped den 0,8 mg hetteglass av TMT null (TMT 0, se tabell of Materials) reagens i 41 mL av ACN. Følg produsentens recommendantions for resuspensjon. </li><li> Etiketten peptidprøver i et forhold på 50 ug peptider til 0,4 mg TMT 0 (det vil si, 50 pl av peptider til 20,5 ul av TMT 0). Inkuber ved RT i 1 time. </li><li> Reaksjonen stanses merkingsreaksjonen ved tilsetning av 5% hydroksylamin i forholdet 6: 100 (dvs. 4,23 ul av 5% hydroksylamin). Inkuber ved RT i 15 min. </li><li> Tørk de TMT 0 -merkede peptidprøver i 1 time ved romtemperatur under anvendelse av vakuum-konsentrator. Resuspender i 10 pl av DDH 2 O. MERK: På grunn ved sukkerrester, glykopeptider vise en høyere molekylmasse enn ikke-glykosylerte peptider. TMT 0 øker ladetilstanden av glykopeptider. Dette reduserer deres relative masse og ladning (m / z)-forhold og letter ETD fragmentering. </li></ol> 7. glycopeptide Enrichment <ol><li> Bruk reaksjons buffere levert med settet (se tabell of Materials). </li><li> Tilsett 50 ul bindingsbuffer til hver 10 ul prøve fra trinn 6,5. Vortex glycocapture harpiksoppløsningen inntil den blir homogen. Bruke en zwitterionisk hydrofil interaksjon væskekromatografi (ZIC-HILIC) -basert fange 15. </li><li> Alikvoter 50 mL av harpiksen suspensjonen til nye 1,5 ml rør. Spin i 1 minutt ved 2500 xg og fjern supernatanten. Legg 60 il prøve (dvs. prøven med bindingsbuffer) til rørene inneholdende de harpikspellets. Bland ved hjelp av en pipette og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter i omrøring ved 1200 rpm. </li><li> Sentrifuge i 2 minutter ved 2000 xg og Overfør supernatanten til nye rør. Hold rørene. Tilsett 150 ul vaskebuffer til harpiksrørene. Bland ved hjelp av en pipette og inkuber ved værelsestemperatur i 10 min i omrøring ved 1200 rpm. </li><li> Spin i 2 min ved 2500 x g. Overføresupernatanten til de samme rør (fra trinn 7,4). Gjenta vaske trinn to ganger. </li><li> Legg 75 ul elueringsbuffer, og blande ved hjelp av en pipette. Omrør ved 1200 rpm i 5 min ved RT og deretter sentrifugere rørene i 2 minutter ved 2500 x g. Overfør supernatanten til nye 1,5 ml rør. Gjenta vasketrinn, og deretter overføre eluatet supernatanten til det samme røret. </li><li> Sentrifuger rør inneholdende eluatet (dvs. glykopeptider) i 2 min ved 2500 x g. Overfør supernatanten til nye rør for å sikre fjerning av eventuelt gjenværende harpiks fra de foregående trinn. </li><li> Tørk de totale 150 ul av eluatet ved bruk av en vakuum-konsentrator i omtrent 2 timer ved RT. Resuspender tørket ned glykopeptidene i 15 ul av 2% ACN og 0,05% TFA i DDH 2 O. </li><li> Fortsett å utføre LC-MS / MS-fragmenteringen ved hjelp av HCD å analysere ECM proteinsammensetningen, og LC-MS / MS ved å bruke HCD og ETD fragmentering for glykopeptid karakterisering. Se punkt 8. </li></ol&gt; 8. massespektrometrianalyse <ol><li> Utføre LC-MS / MS-fragmenteringen ved hjelp av HCD å analysere ECM proteinsammensetningen; se de supplerende metoder for detaljer. </li><li> Utføre LC-MS / MS ved å bruke HCD og ETD fragmentering for glykopeptidet karakteristikk (se de supplerende metoder for detaljer); den anrikede prøven bør være i forhold til det ikke-anrikede inngangsmaterialet 15. MERK: Detaljerte beskrivelser av LC-MS / MS metoder for indirekte glycopeptide analyse, direkte glycopeptide analyse og database søk er gitt i de supplerende metoder. Forskere er interessert i å karakterisere ECM protein og glycan sammensetning ved hjelp av massespektrometri oppfordres til å referere til tidligere publikasjoner 3, 11, 15. </li></ol>

<ol>
	<li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts:+at+the+heart+of+myocardial+remodeling.">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia/reperfusion+injury.">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation.">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li><li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li><li>Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Roles+of+Glycans.">Biological Roles of Glycans.</a> Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+-+opportunities+and+challenges:+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix.">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li><li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+the+application+of+organelle+proteomics+to+heart+failure.">Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure.</a> Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).</li><li>Mason, R. M., Mayes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+cartilage+protein-polysaccharides+with+inorganic+salt+solutions.">Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions.</a> Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).</li><li>Vogel, K. G., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteoglycans+from+tendon.">Isolation of proteoglycans from tendon.</a> Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).</li><li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+in+response+to+venous+hypertension:+proteomics+of+human+varicose+veins.">Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins.</a> Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms:+a+proteomics+approach.">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice:+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis.">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li><li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells.">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment.">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Pepinsky, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+precipitation+of+proteins+from+guanidine+hydrochloride-containing+solutions+with+ethanol.">Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol.</a> Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).</li><li>de Castro-Br&#225;s, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texas+3-step+decellularization+protocol:+looking+at+the+cardiac+extracellular+matrix.">Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix.</a> J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+matrix+proteins+from+tissues+and+digestion+into+peptides+for+mass+spectrometry+analysis.">Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis.</a> J Vis Exp. (101), e53057 (2015).</li><li>Decaris, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity.">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues.">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+extracellular+matrix:+an+ever-changing+and+diverse+entity.">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li></ol>

Dette proteomikk protokollen er optimalisert i løpet av de siste årene i vårt laboratorium. Her har vi brukt hjertevevet, men kan kreves kun mindre justeringer for sin søknad til andre vev. For eksempel, må ekstraksjonen protokollen for å ta cellularitet av vev i betraktning. Hjertevev er stor grad på cellene i forhold til vaskulært vev. Ved bruk av vaskulært vev, kan SDS-konsentrasjonen være lavere (det vil si 0,08%) og den decellularization tid er kortere (dvs. 4 h) 11, 12, 13. Bruken av deglykosyleringseksperimenter enzymer er avgjørende for LC-MS / MS-analyse av ECM sammensetning. Men inkubasjonstider må justeres for forskjellige typer vev. For eksempel, heparinase II kreves lengre inkubasjonstid ved 25 ° C ved bruk av prøver slik som hud, som er rike på basalmembranproteiner (f.eks agrin, perlekan) (data ikke vist). Direkte glykopeptid analyse kan utføres på kondisjonert medium fra celler i kultur 15. Enrichment trinn kan være nødvendig for analysen av denne forenklede subproteome. I likhet med GuHCl ekstrakter, NaCl ekstrakter er også mottagelig for glycoproteomics analyse med mindre modifikasjoner. Andre ekstraksjonsmetoder for anriking av ECM-proteiner kan være tilpasset for å karakterisere ECM glykopeptider 19, 20. Glykosylering er den mest komplekse PTM 5. Indirekte identifikasjon av glykopeptider er oppnådd ved påvisning av deamidert Asn med inkorporert 18 o ved en NXT / S sequon. Deamidert Asn ved andre steder kan representere falske positiver. Likeledes må N-glykosylering bli betraktet i sammenheng med protein ontologier: intracellulære proteiner som inneholder en NXT / S sequon vil ikke være glykosylert, men kan gi opphav til falske positiver. Som dagens search algoritmer tillater ikke for screening av PTMs ved forutbestemte sekvenser bare (dvs. Asn i nxt / S), er manuell filtrering av data som kreves. Identifisering av tilstedeværelse / fravær av glykosylering i disse posisjoner kan sammenlignes mellom sykdom og kontrollprøver. Det er intet enzym ekvivalent med PNGase F for O-deglykosylering (dvs. innføring av en masseforskyvning på treonin eller serin). Derfor er identifiseringen av O-glykosylering er begrenset til direkte glykopeptid analyse. Direkte glykopeptid analyse blir anvendt for å oppnå sammensetningsinformasjon av sukkere festet til proteiner, men gir ikke strukturell informasjon for glycan. Dessuten er det glykan sammensetningen resultatet av glykanet syntese og bearbeiding etter sekresjon. Våre 3-trinns ekstraksjon metode for ECM-proteiner ( &quot;English Quickstep&quot;) 6 har gjort det mulig å karakterisere ECM i en rekke kardiovaskulære vev. Fraksjonering av veveti flere ekstrakter er nødvendig for å oppnå en forenklet ECM proteom- som omtalt ellers 6. Intracellulære proteiner ellers ville føre til en overdreven dynamisk område av protein forekomster innenfor de ekstrakter som forhindrer en identifikasjon av mindre tallrike ECM-proteiner. Videre intracellulære proteiner bære O-glycosylations 5 som ville komplisere ECM glykopeptidsensitivitet anrikning og påfølgende MS-analyse. Andre forfattere søkt lignende ekstraksjonsmetodologier for å karakterisere for eksempel lunge 21 og brusk vev 10, men de ikke forfølge analyse av glykosylering. Foregående analyse av glykosylering fokusert på identifisering av bare glycosites, krever fjerning av glykanet fra proteinkjernen, og kan ikke vurdere O-glykosylering 22, 23. Lektin arrays og kjemiske berikelse er tilgjengelig for vurdering av glycan types av biologiske prøver, basert på deres bindende spesifisitet, men disse teknikkene kan ikke tilordne glykan typer til spesifikke proteiner 24 og heller ikke kan de vurdere glykosyleringsseter. Til å begynne med brukte vi gelelektroforese før LC-MS / MS i henhold til ECM-proteiner. Selv gel separering er gunstig å skaffe en forenklet proteinfraksjoner mottagelig for LC-MS / MS-analyse, de siste instrumentene gir raskere søkehastigheter. Således kan den elektroforetiske separasjonstrinnet utelates. Dette gir en ytterligere fordel som store ECM-proteiner, som blir holdt tilbake på toppen av gelen, ble analysert mer effektivt. Imidlertid er informasjon om Mw av intakte proteiner tapt. Fordampningen trinn før PNGase F deglykosylering sikrer fullstendig fjernelse av faste H 2 O for å minimalisere falske negativer. Sukkerrester (dvs. variable glykan masser) kan forstyrre separasjonen av LC og kompromiss påfølgende peptid identifikasjon ved MS / MS. En pen-deglykosylering protokoll er også anbefalt for proteomforskning analyse av ECM-proteiner ikke fokusert på glykosylering. Proteomikk kan gi enestående innsikt i ECM. Utover strukturell støtte, glykaner festet til ECM er avgjørende for vert-patogen interaksjon, celle-celle-kommunikasjon og immunrespons 25, det vil si allograft avvisning etter organtransplantasjon. Glycoproteomics vil være et viktig verktøy i glykobiologi.

Fibrose er et kjennetegn på mange sykdommer. Fibroblaster proliferere og differensiere mot høyt syntetiske fenotyper, som er forbundet med forverret sekresjon og avsetning av ekstracellulær matriks (ECM) 1. Overdreven ECM avsetning kan fortsette, selv etter at den innledende skaden har avtatt, som fører til funksjonssvikt. Ved hjelp av proteomikk, har vi tidligere har identifisert over 150 ECM og ECM-assosierte proteiner i hjertevevet 2, 3. De er ikke bare strukturelle proteiner, men også matricellulære proteiner og proteaser som bidrar til den kontinuerlige ombygging og dynamisk tilpasning av hjertet. Spesielt er mange ECM-proteiner glykosylert 4. Denne post-translasjonell modifikasjon (PTM) omfatter tilsetning av sukkerrester til visse aminosyreposisjoner, og det påvirker protein folding, løselighet, binding og nedbrytning 5 </sopp&gt;. Det er to hoved glykolyseringsmetoder typer som oppstår i pattedyr. (1) N-glykosylering forekommer ved den karboksamido nitrogen av asparaginrester (Asn) innenfor konsensussekvensen Asn-Xaa-Thr / Ser, hvor Xaa er enhver aminosyre med unntak av prolin. (2) I O-glykosylering, sukkerrester fester seg til serin og treonin-rester (Ser, Thr) eller, i en mye mindre grad, hydroksyprolin og hydroksylysin. Selv om O-glykosylering kan forekomme i en rekke protein-grupper, N-glykosylering begrenset til sekreterte proteiner eller ekstracellulære domener av membranproteiner 5. Dette gjør N-glykosylering et attraktivt mål når studere ECM. Proteomics setter en ny standard for analyse av endringer i protein sykdom. Så langt har de fleste proteomics undersøkelser vært rettet mot intracellulære proteiner 6. Dette er hovedsakelig på grunn av følgende årsaker. Først rikelig intracellulære proteiner hemme identification av knappe ECM komponenter. Dette er spesielt viktig i hjertevev, der mitokondrielle og myofilament proteiner som utgjør en stor andel av proteinet 7. For det andre integrerte ECM-proteiner er sterkt tverrbundet og er vanskelig å oppløseliggjøre. Endelig nærvær av rikelige PTMs (dvs. glykosylering) endrer den molekylære massen, lade, og elektroforetiske egenskaper av peptider, som påvirker både separasjon og identifikasjon ved væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS). I løpet av de senere år, har vi utviklet og forbedret en sekvensiell utvinning og anrikning metode for ECM-proteiner som er forenlig med etterfølgende massespektrometri (MS) -analyse. Strategien er basert på sekvensielle inkubasjoner. Det første trinnet utføres med NaCl, en ionisk buffer som muliggjør utvinning av ECM-assosierte og løst bundet ECM-proteiner, så vel som nylig syntetiserte ECM-proteiner. det jegs vaskemiddel fri, ikke-denaturerende, ikke-forstyrrende av cellemembraner, og mottagelig for ytterligere biokjemiske analyser 8. Deretter blir decellularization oppnås med natriumdodecylsulfat (SDS). På dette trinnet, sikrer en lav konsentrasjon av SDS membran destabilisering og frigivelse av intracellulære proteiner, men hindrer forstyrrelse av de mer oppløselige ikke-integrerte ECM komponenter. Endelig er ECM-proteiner ekstraheres med et guanidin-hydroklorid-buffer (GuHCl). GuHCl er effektiv i å trekke mange kryssbundne proteiner og proteoglykaner fra vev som sener, brusk 9 10, fartøy 11, 12, 13 og hjertet 2, 3. Vi har anvendt denne biokjemiske fraksjonering, i kombinasjon med LC-MS / MS, for å utforske ECM ombygging i kardiovaskulær sykdom 2 <sup&gt;, 3, 11, 12, 13, 14. Nylige fremskritt innen MS innbefatter nye fragmentering metoder, for eksempel kombinasjoner av høyere energi kollisjon dissosiasjon (HCD) og elektronoverføring dissosiasjon (ETD), som gir mulighet for direkte analyse av intakte glykopeptider 3, 15. Her beskriver vi en metode for å fremstille ECM for MS-analysen, som gjør det mulig for analyse av proteinsammensetningen, identifisering av glykosyleringsseter, og karakterisering av glykan former. Sammenlignet med tidligere analyser av ECM glykosylering 16, tillater denne metode for direkte vurdering av sammensetningsendringer i glykosylering profiler i en setespesifikk måte ved hjelp av MS. Vi har brukt denne metoden til hjerte vev. Men det kan alså skal påføres, med mindre modifikasjoner, til studiet av ECM i andre vevsprøver, og kan tilveiebringe enestående innsikt i ECM biologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>A. Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS-grade&#160;(ACN, C2H3N)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51101</td>
			<td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocktail of proteinase inhibitors</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2H2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td>1.3,&#160; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (C2H6O)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437433T</td>
			<td>2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3272</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol (C3H8O3)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>158920025</td>
			<td>Suppl 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O LC-MS Cromasolv</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253-1L-R</td>
			<td>Throughout the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H218O</td>
			<td>Taiyo Nippon Sanso</td>
			<td>FO3-0027</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxylamine (HA, H3NO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>467804</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3221</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51226</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate (C2H3NaO2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7545</td>
			<td>1.6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>1.4.1, 3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>466143</td>
			<td>1.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11268</td>
			<td>4.7, 6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T62200</td>
			<td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea (CH4N2S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>1.4.1, Suppl 1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea (CH4N2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U1250</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0012)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;1,4-Galactosidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0004)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-N-Acetylglucosaminidase</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0013)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitinase ABC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3667</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0011)</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparinase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6512</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratanase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6920</td>
			<td>3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase-F (N-Glycosidase F)</td>
			<td>EDM Millipore</td>
			<td>362280 (KP0001)</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>4.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. Reagent kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 kDa MWCO spin filters&#160;</td>
			<td>Amicon, Millipore</td>
			<td>10256744</td>
			<td>5.9, Suppl 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>74-5657</td>
			<td>5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>NP0322PK2</td>
			<td>Suppl 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>72103</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem mass tag 0 (TMT0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>900067</td>
			<td>6.2, 6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. Equipment and software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5mm x 300&#181;m, 5&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap100 C18, 50cm x 75&#181;m, 3&#181;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Byonic Search Engine</td>
			<td>Protein Metrics</td>
			<td>Version 2.9.30</td>
			<td>Suppl 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Suppl 3, 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray Ion Source&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES081</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&#160; 50cm x 75&#181;m, 2&#956;m, 100&#197;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot Search Engine</td>
			<td>Matrix Science</td>
			<td>Version 2.3.01</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td>
			<td>Suppl 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer Software</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Version 2.1.1.21</td>
			<td>Suppl 3, 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoview Nanospray Source</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>550</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Savant SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD131DDA</td>
			<td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scaffold Software</td>
			<td>Proteome Software&#160;</td>
			<td>Version 4.3.2</td>
			<td>Suppl 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry

Fibrose er et kjennetegn på mange kardiovaskulære sykdommer og er forbundet med forverret sekresjon og avsetning av den ekstracellulære matriks (ECM). Ved hjelp av proteomikk, har vi tidligere har identifisert over 150 ECM og ECM-assosierte proteiner i kardiovaskulære vev. Spesielt er mange ECM-proteiner glykosylert. Denne post-translasjonell modifikasjon påvirker protein folding, løselighet, binding, og degradering. Vi har utviklet en sekvensiell utvinning og anrikning metode for ECM-proteiner som er kompatibelt med den etterfølgende væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS) -analyse av intakte glykopeptider. Strategien er basert på sekvensiell inkubasjoner med NaCl, SDS til vev decellularization, og guanidinhydroklorid for oppløseliggjøring av ECM-proteiner. Nylige fremskritt innen LC-MS / MS-fragmentering omfatter metoder, for eksempel kombinasjoner av høyere energi kollisjon dissosiasjon (HCD) og elektronoverføring dissosiasjon (ETD), som tillaterden direkte sammensetningsanalysen av glykopeptider av ECM-proteiner. I det foreliggende papir, beskriver vi en fremgangsmåte for å fremstille ECM fra vevsprøver. Fremgangsmåten tillater ikke bare for protein profilering men også vurdering og karakterisering av glykosyleringen av MS-analyse.

En skjematisk arbeidsflyt av protokollen er gitt i figur 1. ECM ekstraksjon protokollen Effektiviteten av ekstraksjonen kan overvåkes ved å kjøre alikvoter danne hvert ekstrakt på Bis-Tris akrylamidgeler og ved hjelp av sølvfarging for visualisering. Figur 2A viser komplementaritet av NaCl, SDS og GuHCl ekstrakter etter sekvensiell ekstraksjon. Dette QC muliggjør identifikasjon av potensielle problemer med prøven kvalitet slik som overdreven proteinnedbrytingen. Etter ekstraksjon ECM glykoproteiner er rikelig i GuHCl ekstrakter (figur 2B). deglykosylering For å vurdere effektiviteten av deglycosylering, bør en ikke-deglykosylert kontroll kjøres i parallel. Deglykosylering ganger må være egnet for å oppnå en fullstendig og homogen fjerning av sukkerrester, som eksemplifisert i figur 3A. Figur 3B viser et representativt eksempel på prøvene effektivt deglykosylert ved tilsetning av enzymer for GAG fjerning og deglykosyleringseksperimenter enzymer som er rettet mot mindre N- og O-bundne oligosakkarider. Glycoproteomics Protokollen for vurdering av belegg på NXT / S sequons forbedrer proteinsekvens dekning for ECM-glykoproteiner etter MS (figur 3C) og gjør det mulig for en innledende screening av tilstedeværelsen av glykoproteiner. Dette bidrar til å redusere søketiden for glykopeptider, som databaser kan tilpasses til å inneholde tidligere identifiserte glykoproteiner. HCD-ETD fragmentering brukes for identifikasjon og karakterisering av sammensetnings oligosakkarider bundet til ECM g<html> lycoproteins. Figur 4A viser et representativt spektrum oppnådd for et peptid som er merket med 18 O etter deglykosylering (indirekte glykopeptid-analyse). Figur 4B er et representativt eksempel på et spektrum oppnådd etter analyse av intakte glykopeptider fra ECM-ekstrakter (direkte glykopeptid-analyse). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> Figur 1: Metode oversikt. (A) etter sekvensiell anrikning av ECM-proteiner, er LC-MS / MS-analyser utført på de deglykosylert ekstrakter. (B) eventuelt ikke-deglykosylerte ECM ekstrakter blir ytterligere anriket på glykopeptider. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2: Utvinning av ECM-proteiner. (A) De 3 forskjellige ekstrakter fra den sekvensielle ekstraksjonsprosedyren ( &quot;English Quickstep&quot;) er komplementære i sitt proteininnhold. Mens SDS-ekstrakter som er anriket på intracellulære proteiner, GuHCl ekstrakter inneholder mesteparten av ECM-proteiner. Vellykket fraksjonering blir visualisert ved sølvfarging forskjellig mønster. (B) ECM-proteiner, slik som den lille leucine-rich proteoglykaner decorin, biglycan og mimecan blir hovedsakelig detektert i ekstrakter GuHCl, med lite tilstedeværelse i SDS og NaCl-ekstrakter. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> Figur 3. Analyse av Glycosylation. (A) en egnet inkubasjonstid er nødvendig for fullstendig deglykosylering. Eksemplet viser virkningen av inkubasjonstid ved fjerning av glykosaminoglykan-kjeder fra glykoprotein decorin. (B) ECM glykoproteiner er dekorert med store og gjentatte glykosaminoglykan kjeder og korte og mangfoldige N- og O-bundne oligosakkarider. Bane 1 på hver av immunoblottene representerer ubehandlede hjerte ekstrakter. Spor 2 inneholder ekstrakt behandlet med enzymer som fordøyer glykosaminoglykaner. Prøvene i spor 3 i tillegg inneholde enzymer for fjerning av N- og O-koblede oligossacharides. Galectin-1 er ikke glykosylert, dermed er det ingen forskyvning i proteinstørrelse. Tilpasset fra Lynch M, et al. 4 (C) I LC-MS / MS-analyse, Prøver behandlet med PNGase-F i nærvær av H2 18 O oppnå bedre dekning sekvens (%, på den høyre side) sammenlignet med ikke-deglykosylert prøver. Dark grønne områder representerer sekvens dekning ved LC-MS / MS. De røde, stiplede linjene representerer glycosites, med tall som viser hvor aminosyre posisjon. Påvisning av glykosylering av decorin i posisjon 211 Asn (N, uthevet med fet skrift) er vist i detalj som et eksempel på figur 4. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">Trykk her for å vise en større versjon av denne figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> Figur 4. glykopeptidreagens Analyse ved MS. (A) ved hjelp av en hagle proteomforskning tilnærming på ECM anrikede ekstrakter, kan glykopeptider bli identifisert ved tilstedeværelsen av deamiderte asparagines innenfor nxt / S sequons og merket med 18 O. Eksemplet viser en HCD MS / MS-spekteret for et peptid av decorin inneholdende tidligere glykosylert Asn 211. De oppnådde data kan benytteså lage en tilpasset database med ECM glykoproteiner. (B) HCD-ETD fragmentering blir brukt til å analysere glykopeptidet anriket ECM ekstrakt. ETD MS / MS-spektrum tillater karakterisering av glykan sammensetning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. Stamløsninger </td><td></td></tr><tr><td> DTT (ditiotreitol, C4-H 10 O 2 S 2) </td><td> 100 mM DTT i DDH 2 O. 1 </td></tr><tr><td> EDTA (Ethylendiamintetraeddiksyre, C 10 H 16 N 2 O 8) </td><td> 250 mM EDTA i DDH 2 O, pH 8,0. </td></tr><tr><td> GuHCl (guanidinhydroklorid, CH 6 ClN 3) </td><td> 8 M GuHCl iDDH 2 O. </td></tr><tr><td> IAA (Jodacetamid, C-2 H 4 INO) </td><td> 500 mM IAA i DDH 2 O. 1,2 </td></tr><tr><td> Na-acetat (natriumacetat, C2-H 3 NaOC 2) </td><td> 1 M Na-acetat i DDH 2 O, pH 5,8. </td></tr><tr><td> NaCl (natriumklorid, NaCl) </td><td> 1 M NaCl i DDH 2 O. </td></tr><tr><td> Na-hydrogenfosfat (Dinatriumfosfat, Na 2 H 2 PO 4) </td><td> 1 M Na-fosfat, dibasisk dd H2O, pH 6,8. </td></tr><tr><td> SDS (natrium-dodecylsulfat, NaC 12 H 25 SO 4) </td><td> 1% SDS (35 mM) i DDH 2 O. 3 </td></tr><tr><td> TFA (trifluoreddiksyre, C-2 HF 3 O 2) </td><td> 10% TFA (1,2 M) i DDH 2 O. </td></tr><tr><td> TEAB (trietylammoniumbikarbonat, C7 H 17 </sub&gt; NO3) </td><td> 1 M TEAB i i ddH2O, pH 8,5 </td></tr><tr><td> Tiourea (Tiourea, CH4 N2 S) </td><td> 3 M tiourea i DDH 2 O. </td></tr><tr><td> Tris-HCl (Tris-hydroklorid (NH 11 C 4 O 3 [HCl]) </td><td> 100 mM Tris-HCl i DDH 2 O, pH 7,5. </td></tr><tr><td> Urea (Urea, CH4 N2 O) </td><td> 9 M urea i DDH 2 O. </td></tr><tr><td> B. Reaksjons buffere </td><td></td></tr><tr><td> C18 opprydding -ekvilibreringsbuffer </td><td> 1% ACN, 0,1% TFA i DDH 2 O </td></tr><tr><td> C18 clean-up-kolonne vaskebuffer </td><td> 80% ACN, 0,1% TFA i H 2 O </td></tr><tr><td> C18 clean-up elueringsbuffer </td><td> 50% acetonitril, 0,1% TFA i DDH 2 O </td></tr><tr><td> Deglykosylering Buffer (4x) </td><td> 600 mM NaCl og 200 mM Na-fosfat i DDH 2 O, pH 6,8. </td></tr><tr><td> GuHCl buffer 4 </td><td> 4 M guanidinhydroklorid, 50 mM Na-acetat og 25 mM EDTA i DDH 2 O, pH 5,8. Tilsett 1: 100 (v: v) blanding av proteinaseinhibitorer før bruk. </td></tr><tr><td> NaCl-buffer 4 </td><td> 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl og 25 mM EDTA i DDH 2 O, pH 7,5. Tilsett 1: 100 (v: v) blanding av proteinaseinhibitorer før bruk. </td></tr><tr><td> PBS (1 x) </td><td> 1,7 mM KH 2PO 4, 5 mM Na 2HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Tilsett 25 mM EDTA og 1: 100 (v: v) blanding av proteinaseinhibitorer før bruk. </td></tr><tr><td> Prøvebuffer (4x) </td><td> 100 mM Tris, 2% SDS, 40% glycerol, 0,02% bromfenolblått i DDH 2 O, pH 6,8. Tilsett 10% ß-merkaptoetanol før bruk. </td></tr><tr><td> SDS-buffer 4 </td><td> 0,1% SDS og 25 mM EDTA i DDH 2 O. Tilsett 1: 100 (v: v) blanding av proteinaseinhibitorer befmalm bruk. </td></tr><tr><td> C. Enzymer </td><td></td></tr><tr><td> Kondroitinase ABC 5 </td><td> 0,5 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> Keratanase 5 </td><td> 0,1 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> Heparinase II 5 </td><td> 0,1 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9-neuraminidase (sialidase) 5 </td><td> 0.025 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> β1,4-galaktosidase 5 </td><td> 0,015 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> p-N-acetylglukosaminidase 5 </td><td> 0,25 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> Endo-α-N-acetylgalaktosaminidase (O-glykosidase) 5 </td><td> 0,013 U / ml i deglykosylering buffer (1x) </td></tr><tr><td> PNGase-F (N-glykosidase-F) 6 </td><td> 50 U / ml i H 2 18 O </td></tr><tr><td> trypsin </td><td> 0,01 ug / ul i TEAB buffer </td></tr><tr><td> Tabell notater. </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1 Hold stamløsning fryses ved -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 IAA bør holdes beskyttet mot lys. </td></tr><tr><td colspan="2"> 3. SDS krystalliserer lett ved &lt;20 ° C. For å lette oppløsningen av 1% SDS (stamløsning), varme bufferen under rennende varmt vann fra springen. </td></tr><tr><td colspan="2"> 4. Ekstraksjon buffere kan lagres ved romtemperatur. Legg bredspektret cocktail av proteinaseinhibitorer som indikert før bruk. </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 Disse enzymer bør tilsettes i løpet av det første trinnet deglykosylering. </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGase-F bør bare tilsettes i løpet av det andre trinnet deglykosylering. </td&gt; </tr></tbody></table> Tabell 1: Aksje Solutions, Reaction buffere og enzymer. Denne tabellen viser sammensetningen av hver standardoppløsning og reaksjonsbufferen som kreves for ekstraksjonen og etterfølgende behandling (inklusive enzymatiske spaltninger) av hjerte ECM-proteiner før MS-analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Denne artikkelen beskriver en metode for å fremstille kardiovaskulære vevsprøver for MS-analyse som tillater (1) analyse av ECM proteinsammensetning, (2) identifisering av glykosyleringsseter, og (3) den sammensetnings karakterisering av glykan former. Denne metodikk kan også anvendes, med mindre modifikasjoner, til studiet av ECM i andre vev.

Glycoproteomics av ​​den ekstracellulære matrise: En metode for Intakt glykopeptidreagens analyse ved hjelp av massespektrometri

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Glycoproteomics av ​​den ekstracellulære matrise: En metode for Intakt glykopeptidreagens analyse ved hjelp av massespektrometri

Glycoproteomics av den ekstracellulære matrise: En metode for Intakt glykopeptidreagens analyse ved hjelp av massespektrometri