Name: mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

GLP-1, иммуно-анализы проводили с помощью анализа лаборатории биохимического Ядра в больнице Адденбрукса. Эта работа, на протяжении многих лет, была поддержана Wellcome Trust (в настоящее время активные гранты 106262 / Z / 14 / Z и 106263 / Z / 14 / Z) и Совета по медицинским исследованиям (MRC) (гранты MRC_MC_UU_12012 / 3 и MRC_MC_UU_12012 / 5).

<ol>
	<li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+A+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li><li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+chemosensing+mechanisms.">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li><li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incretin-based+therapies+for+type+2+diabetes+mellitus.">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors.">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li><li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture:+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides.">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716,+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium.">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li><li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells.">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1.">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li><li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells.">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li><li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2.">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li><li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells.">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells.">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li><li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans.">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li><li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents.">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li><li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells.">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника, чтобы позволить исследование секреции кишечника пептида и одной клеточной визуализации меченых клеток энтероэндокринные. Для того, чтобы увеличить вероятность тонкого кишечника культур быть успешным, важно, что протокол осуществляется так же быстро, как это возможно (в идеале, в течение 3 ч уборки ткани), и что ткань хранится в ледяной среде или буфера перед в процессе пищеварения, чтобы ограничить гибель клеток. Хотя это не является существенным, особенно для ободочных культур, удаление мышечного слоя из тонкого кишечника настоятельно рекомендуется. Небольшой протокол кишечной культуры был стандартизирован как можно больше. Тем не менее, важно отметить, что ни один процесс пищеварения не идентичен. Есть много шагов , в ходе этого протокола , где изменчивость может быть введена на основе изо дня в день , например , от степени удаления мышц, размер тон фарш &quot;кусочки ткани, силу встряхивания, потенция конкретной партии коллагеназы и др. Следовательно, чрезвычайно важно, чтобы осмотреть аликвот каждого из различных «переваривает» под микроскопом, чтобы оценить ход процесса пищеварения и в соответствии с ними встряхивания и число «дайджесты» соответственно. Рекомендуется встряхнуть более осторожно, чтобы начать с, и если фрагменты крипт не очевидны из «переварить» 3 года, чтобы начать встряхивая более энергично. Исходя из нашего опыта, энтероэндокринные клетки не размножаются в культуре и, как правило, теряется из тонкого кишечника культур в течение 4 дней. Тем не менее, это позволяет достаточно времени, чтобы выполнить эксперименты секреции кишечника пептид (обычно проводят в течение 2 ч, 18-24 ч после металлизации), чтобы проверить физиологические стимулы и / или фармакологических агентов. Эксперименты , требующие инкубации в течение ночи перед экспериментом секреции также возможно , например ,в случае предварительной обработки с коклюшного токсина 15. Методика первичной культуры представлены здесь устоявшийся метод, о чем свидетельствует объем научной продукции она производится на протяжении многих лет. Модель первичной культуры была использована для изучения секреции различных кишечных пептидов, включая GLP-1 1, GIP 18 и PYY 19, в ответ на разнообразные питательные вещества и без питательных веществ 14, 20 стимулов и ингибиторов. Кроме того, тот же метод был успешно применен к культуре клеток кишечника человека 21. Часто, сочетание метода первичной клеточной культуры , наряду с дополнительной экспериментальной модели , например. ех естественных условиях или в естественных условиях может обеспечить наиболее понимание 6. Примечательно, и в отличие от других методов, этот метод имеет внутримышечноВАЖНЫ приложения за пределами измерения кишки пептидного высвобождения. Мы показали , что первичные культуры тонких кишечника , полученные из трансгенных мышей репортера являются мощными инструментами для допроса внутриклеточных сигнальных путей в сочетании кишки секреции пептида, используя, например , Са 2+ и датчики цАМФа, GCaMP3 11, 13 и 14 Epac2camps, соответственно, а также электрофизиологические методы 12. Как и все модели в пробирке, первичные кишечные культуры имеют определенные ограничения , присущие включая потерю полярности эпителиальных клеток в культуре, а также к потере кровоснабжения и иннервации. Трудно оценить потенциальное влияние этих искусственных условий на функции энтероэндокринных клеток. Однако данные , полученные из первичных культур часто были переводимые в в естественных условиях Settiнг (например , эффекты короткоцепочечных жирных кислот на GLP-1 секреции 15). Первичные культуры кишечника являются универсальным методом, с большим количеством потенциальных применений. Они уже обеспечили важное механистическое понимание регуляции секреции кишечника пептидов.

Общая цель этого метода заключается в изоляции и культуры смешанных мышиные клеток кишечника для того, чтобы исследования секреции кишечника пептидов и клеточной визуализации энтероэндокринных клеток живой. Ранняя версия этой процедуры была впервые опубликована в 2008 году Рейман и др. 1 и с тех пор легли в основу еще 20 публикаций из нашей группы. Для этой рукописи, мы решили сосредоточиться на небольших кишечных культурах, поскольку они являются более сложными, чтобы установить, чем ободочная культур. Энтероэндокринные клетки секретируют множество кишечных пептидов , включая глюкагон-подобный пептид 1 (GLP-1), глюкозо-инсулинотропный пептид (GIP), холецистокинин (CCK) и пептида YY (PYY) 2. Эти кишечные пептиды играют важную физиологическую роль в организуя постпрандиальную реакцию, такие как замедление транзита кишечника, потенцирование глюкозо-стимулированной секреции инсулина и индукции сытости. GLP-1 миметики ай препараты , которые ингибируют его деградацию в настоящее время лицензированы для лечения сахарного диабета 2 -го типа и существует постоянная оценка терапевтического потенциала стимулировать секрецию эндогенной этого пептида 3. Лучшее понимание энтероэндокринных физиологий и механизмы, с помощью которых секреция либо стимулируется или подавляется, таким образом, решающее значение. Gut секреции пептида может быть изучена с помощью различных в пробирке и бывших естественных экспериментальных моделей, каждая имеет свои преимущества и недостатки (для всестороннего недавнего обзора также охватывающее использование моделей в естественных условиях см Свендсен и др. 4). Ex естественных условий методы , такие как изолированная перфузия кишечника 5 и Ussing камеры 6 в настоящее время используется для изучения секреции пептида кишечника в ответ на различные вещества. Главное преимущество этих методов, так какпо сравнению с первичными культурами, является то, что непосредственное окружение из энтероэндокринных клеток остается в значительной степени нетронутого и, что важно, сохраняется полярность клеток. Таким образом, можно вызвать информацию о том, какие клетки поверхность а секрецию действует на 6. Однако, эти методы, как правило, низкой пропускной способности, а качество данных, полученных из них в значительной степени зависит от целостности и жизнеспособности ткани кишечника, что неизбежно снижаться с течением времени. Кишечные органоиды теперь все чаще используются в качестве моделей в пробирке для исследования функции и развития 7 энтероэндокринных клеток. Органоиды, которые могут быть получены как из мышиных и человеческих тканей, имеют преимущество формирования 3D «крипт-подобный» структур, которые поддерживают полярность клеток в культуре. Тем не менее, органоидные полученные энтероэндокринные клетки до сих пор не полностью охарактеризованы, и их сходство с нативным L CELLs остается в значительной степени неизвестны. Первичные культуры имеют преимущество быть на шаг ближе к физиологическому установке, поскольку энтероэндокринные клетки не сохраняются и дифференцируются в искусственных условиях в течение длительных периодов времени. Альтернативный метод первичной культуры , которая была использована для оценки секреции кишечника пептида является выделением кишечных клеток плода крысы (FRICS) 8. Однако культура кишечной ткани взрослого встретился с меньшим успехом , и некоторые различия наблюдались в отзывчивости FRICS против взрослых мышиных клеток кишечника (например , глюкозы 8). Энтероэндокринные подобные клеточные линии (например , GLUTag, STC-1 и NCI-H716) традиционно используется , чтобы различать прямые против. косвенное воздействие на клетки и энтероэндокринных рассекать основные молекулярные механизмы сцепных стимул секрецию; см Kuhre др </em&gt;. 9 для производства и пептида секреции «клеточноподобных L» иммортализованных клеточных линий. Это было необходимо , так как энтероэндокринные клетки, разбросанные вдоль желудочно - кишечного тракта, составляет чуть менее 1% эпителиальных клеток кишечника 10 и отсортированных клеток, в наших руках, не выживают в культуре 1. Клеточные линии остаются полезными инструментами в связи с тем, что они в значительной степени гомогенной клеточной популяции, которая способствует генетическим манипуляциям, таким как ген-глушители. Следовательно, легко исследовать роль белков, которые не могут быть целевыми фармакологический, когда трансгенные мыши не доступны. Однако, клеточные линии, не всегда действующие модели первичных клеток. В то время как есть много общих черт, выводы из первичных культур по поводу определения различий в сигнальных путях , активируемых определенных питательных веществ в первичных L клеток по сравнению с клетками GLUTag, например , (например, пептоны &lt;вир класс = &quot;внешние ссылки&quot;&gt; 11). Важно отметить, что в сочетании с трансгенными флуоресцентными мышами репортера, модель первичной культуры дает детальное изучение отдельных первичному энтероэндокринные клеток на внутриклеточном уровне. Флуоресцентно-меченый L клеток в первичных культурах, были использованы нашей группой для патч зажима 1, 12 исследований, а также для одной ячейки кальция 11, 13 и циклический аденозин монофосфат-FRET изображений 14 исследований, которые были достигнуты значительные успехи в области энтероэндокринные физиология. Следующий протокол оптимизирован для выполнения экспериментов секреции, с использованием 24-луночного планшета с или для приготовления до 16 блюд изображений, из секции 10 см тонкой кишки от одной взрослой мыши. Протокол может быть легко модифицирован для изучения ободочных клеток путем увеличения времени пищеварения и сотрудничестваllagenase концентрация.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>For secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bombesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4272</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 ml, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml, sterile</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430828</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI (Crude)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>For making up digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4500 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td>For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps/Tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT520</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td><a href="https://ufslive.admin.cam.ac.uk/OA_HTML/OA.jsp?OAFunc=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;OASF=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;reqHeaderId=%7B%21%21VHZooXq3GHQ6ng85h4o4sA%7D&amp;retainAM=Y&amp;addBreadCrumb=Y&amp;_ti=372495995&amp;oapc=18&amp;oas=dSLT2zPz7cgLm-ZkBP6Y6Q.." title="MatTek glass bottom dishes P35G-0-14-C">P35G-0-14-C</a></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision tweezer (110 mm)</td>
			<td>IDEAL-TEK</td>
			<td>3480641 (5 SA)</td>
			<td>For removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution digital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-ER</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td>For collecting tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaFluor&#160;</td>
			<td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence ratio imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL6)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>For calcium imaging and secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (EVOS XL Core)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>For photomicrographs of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4234</td>
			<td>For cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>For washing tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT554</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>0308</td>
			<td>For dicing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip</td>
			<td>BD</td>
			<td>300613</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp 75W</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

Кишка является самым большим эндокринным органом тела, с энтероэндокринные клеток, секретирующих гормон-расположенных вдоль длины желудочно-кишечного эпителия. Несмотря на их физиологическое значение, энтероэндокринные клетки представляют собой лишь небольшую часть населения эпителиальных клеток и в прошлом, их характеристика представила значительные трудности в результате в зависимости от модели клеточных линий. Здесь мы приводим подробный протокол для выделения и культуры смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры были использованы для идентификации сигнальных путей, лежащих в основе стимуляции и ингибирование секреции пептида кишечника в ответ на ряд питательных веществ и нейропептиды, а также в качестве фармакологических агентов. Кроме того, в сочетании с использованием трансгенных флуоресцентных мышей репортера, мы показали, что эти первичные культуры стали мощным инструментом для исследования флуоресцентно меченного энтероэндокринных клеток в инtracellular уровень, используя методы, такие как патч зажима и одноклеточного кальция и визуализации цАМФ-FRET.

Использование серийных этапов переваривания позволяет собирать относительно чистой подготовки фрагментов крипт, чтобы быть покрыто для экспериментов. Первые два дайджесты удалить , прежде всего , отдельные клетки и клеточные остатки от переваривания материала (рис 1А). В течение третьего дайджеста, крипты фрагменты появляются в переваренном материале (Фиг.). Дайджесты 4 и 5 выхода большего числа крипт фрагментов с меньшим количеством одиночных клетками (рис 1C). Фильтрация объединенного материала из дайджестов 3-5 удаляет крупные куски непереваренной ткани, которые могут быть вредными для культуры, производя чистые подготовки фрагмента крипты (рис 1D). После 18-24 часов культуры, наблюдаются монослоев первичных мелких клеток кишечника (фиг.2А). Используя культуры, полученные от трансгенных мышей, специфически экспрессирующих калбилирубина флюоресцентный сенсор, GCaMP3, под контролем промотора проглюкагонового 11, L - клетки легко идентифицируются и вкраплены в культуре (фигура 2В). В первичных культурах тонких кишечника, ориентированные на соединения G Q -ca 2+ я и цАМФа я -зависимые пути стимулировали секрецию GLP-1 (для методики эксперимента секреции см Райманна и др. 1). Бомбезин (BBS, 100 нМ) и совместное применение форсколина и 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) (F / I, 10 мкМ каждого) вызвало 2- и 11-кратное, стимуляцию GLP-1, по сравнению с высвобождением Базальный, соответственно (фиг.2С). Конкретное выражение L клетка GCaMP3 позволяет идентифицировать и мониторинг в режиме реального времени мобилизации кальция в отдельных клетках L. Оба 100 нМ бомбезина (BBS) и 30 мМ хлорида калия (KCl) стимулировали кратковременное повышение внутриклеточного кальция , указывающие на известной G д &lt;/ суб&gt; - и электрогенные связью пути в первичных L - клетках (фигура 2D). <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Рисунок 2: Типичные данные , полученные из первичных культур тонкого кишечника. Пример изображения смешанных первичных культур тонкого кишечника , используемых для (А) секреции и (В) экспериментов визуализации сообщение 24 ч обшивки. (А) Изображение взято из 24-луночного планшета, используя цифровой инвертированный микроскоп с объективом 4X. Шкала бар = 500 мкм. (Б) Использование Glu-Cre х мышей ROSA26 GCamP3, L клеток в поле зрения (зеленые клетки) были идентифицированы с помощью флуоресценции GCaMP3. Шкала бар составляет 50 мкм. Секреции ГПП-1 (С) измеряли в ответ на бомбезина (BBS, 100 нм) и форсколин / 3-изобутил-1-метилксантина (ИБМК) (F / I, 10 мкМ каждого). Процент секреция ГПП-1 была рассчитанапутем измерения уровней GLP-1 в супернатантах и ​​клеточных лизатах. Данные представляют собой средние значения ± SEM, п = 3 для каждого условия. (D) GCaMP3 флуоресценции (отражающий цитозольного кальция) двух клеток , описанных в (B) , мониторинг в реальном времени в ответ на хлористый калий (KCl, 30 мМ) и BBS (100 нМ). визуализация одной клетки была выполнена с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом масляной иммерсии 40X. GCaMP3 возбуждалась при 475/10 нм, с использованием 75 Вт ксеноновой дуговой лампы и монохроматор, управляемый программным обеспечением флуоресцентной томографии. Излучение регистрировали с помощью цифрового прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры с высоким разрешением, используя дихроичное зеркало и фильтр полосы пропускания в 510-560 нм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Этот протокол описывает выделение и культуру смешанных мышиных клеток тонкого кишечника. Эти первичные культуры кишечника позволяют исследование сигнальных путей, лежащих в основе секреции пептида кишечника с использованием ряда методов.

Смешанные первичные культуры мышиных тонкой кишки, предназначенные для изучения Gut Гормон Секреции и живых изображений клеток из клеток энтероэндокринных

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Генерация распределенные пресомитной мезодермы клеточных культур для работы с изображениями данио рерио Сегментация часы в одиночных камерах

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Томатный / GFP-ФЛП / FRT Метод живых изображений мозаики взрослых<em&gt; Дрозофилы</em&gt; клетки фоторецепторов

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Мышь плода Всего кишка Культура Система для<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Манипуляция сигнальных путей и трехмерных живых изображений развития ворсинки

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cell Imaging дегрануляции и секреции тромбоцитов под потоком

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Визуализация субклеточных структур в живых клетках сверхвысокого разрешения

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Мониторинг подкисления кишечника в кишечнике дрозофилы у взрослых

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...