Name: mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

GLP-1 immun-analyser utfördes av Core biokemisk analys Laboratory vid Addenbrooke sjukhus. Detta arbete har under årens lopp fått stöd av Wellcome Trust (för närvarande aktiva bidrag 106.262 / Z / 14 / Z och 106263 / Z / 14 / Z) och Medical Research Council (MRC) (bidrag MRC_MC_UU_12012 / 3 och MRC_MC_UU_12012 / 5).

Alla djurförsök godkändes av University of Cambridge djurskydd och etiska granskningsorganet och överensstämde med de djur (Scientific Procedures) Act 1986 Ändring förordningarna (SI 2012/3039). 1. Framställning i Advance <ol><li> Placeras en alikvot av basalmembranmatrisen (BMM) (~ 200 | il) på is för att tina. OBS: BMM stelnar vid rumstemperatur (RT). </li><li> Pre-warm 50 ml steril hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (med inga tillsatser) och ~ 40 ml sterilt odlingsmedium (hög glukos DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin (P / S) och 2 mM L-glutamin) i 50 ml centrifugeringsrör i ett vattenbad vid 37 ° C </li><li> Pre-chill kalcium- och magnesiuminnehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS). </li><li> Väg upp 15 mg kollagenas (XI rå), lägga till ett 50 ml centrifugrör och hålla den på is. <ol><li&gt; VARNING: Kollagenas är skadligt. Det orsakar hudirritation (H315) och allvarlig ögonirritation (H319). Det kan orsaka allergi- eller astmasymtom eller andningssvårigheter vid inandning (H334). Det kan orsaka irritation i luftvägarna (H335). Använd lämplig personlig skyddsutrustning, undvika dammbildning och undvika att andas in damm. Se till att ventilationen är tillräcklig. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Collection <ol><li> Lägga ~ 20 ml L-15 medium till ett 50 ml centrifugrör och placera den på is. </li><li> Euthanize en mus genom cervikal dislokation, eller annan godkänd schema 1 metoden. OBS: Intestinal vävnad erhålls typiskt från möss på en C57BL6 bakgrund. Emellertid har andra genetiska bakgrunder också använts t.ex. 129 / SvEv 15. Imaging experiment kräver användning av fluorescerande reporter möss t.ex. GLU-Venus 1. Vävnad erhålls från vuxna möss (2-6 månader) av båda könen. Mössen inrymda i individually ventilerad burar med fri tillgång till vatten och regelbunden chow. Men experiment testa effekten av en fettrik diet, till exempel på enteroendokrina cellsfunktionen 16 kan utföras om de stöds av en projektlicens. </li><li> Dissekera och försiktigt bort mus tarm (från pylorus till start av rektum) med hjälp av pincett och dissektion sax. Förvara den i L-15-medium på is tills det ska användas. </li></ol> 3. Vävnadsberedning <ol><li> Placera tarmvävnad i en 10 cm petriskål innehållande tillräckligt PBS för att täcka vävnaden. Ta 10 cm av önskad vävnad (t.ex. övre tunntarmen, topp 10 cm, distala till pylorus). </li><li> Spola ut tarminnehållet med hjälp av en plast pasteurpipett och kylda PBS. <ol><li> Använd pincett, fint grepp ena änden av tarmsegmentet och placera spetsen på en pasteurpipett i den. Spola ut innehållet med kyld PBS. Upprepa från båda ändarna tills majohet av innehållet har tömts ut. Överföring till en ren petriskål som innehåller färsk kyld PBS. </li></ol></li><li> Använd pincett, ta bort fettvävnad och tarmkäx, var noga med att inte dra av muskellagret samtidigt. </li><li> Skala muskellagret off &quot;som en strumpa&quot; under ett dissektionsmikroskop med hjälp av två uppsättningar av fin pincett. OBS: Detta steg är inte nödvändigt men rekommenderas starkt. Det finns alternativa sätt att ta bort muskellagret till den som beskrivs här. Till exempel, kan tarmen skäras upp i längdriktningen först, före avlägsnandet av muskellagret. <ol><li> Hitta en utgångspunkt vid mer proximala änden av vävnaden där det finns en synlig flik av muskler. Dra försiktigt bort en liten mängd muskellagret hela vägen runt tarmen. OBS: För att undvika sönderrivning av muskelskiktet eller det intestinala epitelet, minska dragkraften genom att spänna fast en större ytarea stället för att använda tips av fin pincett. </li><li> Kläm tarmen och så mycket av muskeln flik som möjligt genom att försiktigt dra isär och börja dra bort muskellagret från hela tarmen. För att undvika att riva både muskellagret och epitel, hålla omjustering placeringen av pincett för att hålla dem nära varandra. På detta sätt, avlägsna muskelskiktet från hela längden av tarmsegmentet och kassering. </li></ol></li><li> Skär tarmen öppna längs och tvätta med virvlande i en ren petriskål med färsk kyld PBS. Upprepa om så behövs för att avlägsna eventuella kvarvarande CHYMUS eller slem. </li><li> Färs vävnad med en kirurgisk skalpellblad för att uppnå rutor av ~ 1-2 mm 2 och lägga till dessa i ~ 20 ml kyld PBS i en 50-ml centrifugrör med användning av en Pasteur-pipett. För att undvika vävnadsbitar fastnar på pipetten, avskurna spetsen och väta pipetten genom triturering med PBS. </li><li> Skaka försiktigt röret för att ytterligare tvätta vävnaden bitar. Tillåta vävnaden sedimentera och häll eller pipette bort majoriteten av PBS och upprepa med färsk PBS tills PBS ser klart. </li></ol> 4. Framställning av BBM-belagda plattan / Porslin och Digestion Medium OBS: Följande steg skall utföras i en vävnadsodling huva (med inkubationssteg i 37 ° C vattenbad). <ol><li> Bered en 2% BMM lösning i kylt DMEM (utan tillsatser). Under arbetet, hålla lösningen på is. För en 2% -ig lösning, tillsätt 140 | il upptinade BMM till 7 ml DMEM (tillräckligt för att framställa en enda 24-brunnsplatta). <ol><li> Tillsätt 250 | il 2% BMM lösning per brunn (24-brunnsplatta) eller per glas botten avbildning skålen. </li><li> Inkubera belagda plattor / rätter för minst 30 min i en inkubator vid 37 ° C för att möjliggöra adekvat polymerisation av BMM. </li></ol></li><li> Tillsätt 50 ml förvärmda DMEM (utan tillsatser) till 15 mg kollagenas (från steg 1,2 och 1,4) för att bilda en 0,3 mg / ml lösning och invertera för att lösa upp. <ol><li> Påce fullständigt upplöst, med användning av en 20 ml spruta, filtrera kollagenas lösningen genom ett 0,2 ^ m sterilfilter i en ny steril 50 ml centrifugrör. Märk detta som matsmältningen medium. </li></ol></li></ol> 5. Vävnads Digestion <ol><li> Avlägsna vävnaden bitar från PBS med användning av en 10 ml serologisk pipett och tillsätt till en steril 50-ml centrifugrör innehållande kylt sterilt DMEM (utan tillsatser), virvla runt och sedan bort DMEM. OBS: För att undvika vävnad fastnar i serologiska pipett blöt det genom rivning med DMEM före kontakt med vävnaden. </li><li> &#39;Digest&#39; 1 och 2: Avlägsnande av cellrester och enstaka celler <ol><li> Lägga 7 ml uppslutningsmediet till vävnadsbitar och ge röret en virvel. </li><li> Inkubera i 5 min i ett vattenbad vid 37 ° C. </li><li> Skaka försiktigt (ej virvla) röret för ~ 3 s. </li><li> Tillåta vävnaden sedimentera och kassera uppslutningsmediet, reservera enliten volym för att titta på under mikroskop. OBS: Speciellt när börjat, är det starkt rekommenderat att inspektera en liten volym av varje &#39;digest&#39; (~ 30 | il) under mikroskop för att mäta fortskridandet av rötningsprocessen. Om många kryptor observeras vid detta skede kan skakningen vara alltför kraftig. För representativa bilder av vad de olika &#39;Digest&#39; stadier ser normalt ut, se figur 1. </li><li> Upprepa steg 5.2.-5.2.4 (med färskt uppslutningsmedium). </li></ol></li><li> &#39;Digest&#39; 3 och 5: Insamling av crypt fragment <ol><li> Lägga 7 ml uppslutningsmediet till vävnaden. </li><li> Inkubera i 10 min vid 37 ° C. <ol><li> Under inkubation, skaka varje 5 min för 10-12 s. OBS! Skakning är mer kraftfull än att skaka på &#39;Digest&#39; 1 och 2. </li></ol></li><li> Tillåta osmält vävnad sedimentera och samla uppslutningsmedium i en 15 ml centrifugrör. Omvävnad oavsiktligt uppsamlas tillsammans med mediet, tillåter den sätta sig, ta bort den med hjälp av en 10 ml serologisk pipett och överföra den tillbaka till 50-ml centrifugrör innehållande osmält vävnad. </li><li> Centrifug uppsamlades medium / supematant vid RT under 3 min vid 100 x g. </li><li> Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 ml förvärmda odlingsmediet genom försiktig triturering och ställ åt sidan. </li><li> Inspektera en liten volym av cellsuspensionen under mikroskop (se anmärkning från steg 5.2.4). OBS: Helst crypt fragment börjar visas i &#39;digest&#39; 3 tillsammans med celldebris och enskilda celler. &#39;Digest&#39; 4 och 5 innehåller en signifikant större antal crypt fragment med nedsatt cellrester (Figur 1). Justera skakning intensitet som behov, dvs. om vävnaden inte smälta och crypt fragmenten visas inte, skaka mer kraftfullt. </li><li> Upprepa steg 5.3.1-5.3.6 fram till 5 &#39;Digest&#39; harfullbordats eller tills majoriteten av vävnaden har digererats (en 6: e digere kan behövas). </li><li> När alla supernatanter från &#39;digere&#39; 3-5 (eller 3-6) har samlats in, centrifugera smälta supernatanter vid RT under 3 min vid 100 x g. </li><li> För sekretionsexperiment, kombinera supernatanterna från &#39;digere&#39; 3-5 (eller 3-6) före centrifugering. OBS: Mindre vävnad behövs för avbildningsexperiment, därför välja den digest supernatant som är den renaste (frånvaro av cellrester och enstaka celler) med det större antalet crypt fragment. Detta är vanligtvis &#39;smälta&#39; 4 eller 5. </li><li> Kassera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten genom triturering tills inga klumpar är synliga. Återsuspendera pelleten i förvärmda odlingsmedium kompletterat med 10 | iM Y-27.632 dihydroklorid (för att förhindra anoikis 17). Använda 5 ml för sekretionsexperiment och 2 ml odlingsmedium för avbildning experiment. </li><li> Filtreracellsuspension genom en 100-pm filter (för att avlägsna eventuellt osmält vävnad). Köra en ytterligare 2 ml förvärmda odlingsmedium genom filtret för att tvätta (total volym: 7 ml och 4 ml för utsöndring och avbildning, respektive). OBS: Filtrering är inte nödvändigt, emellertid, större vävnadsfragment tenderar att inte vidhäfta till plåt / rätter. </li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figur 1: representativa bilder av &#39;digere&#39; från primär tunntarmsodlingsmetod. (A) Karaktäristisk material från &#39;digere&#39; 1 och 2 innehållande primärt enskilda celler och cellrester. (B) Ett exempel på produkter från &#39;smälta&#39; 3. De svarta pilarna visar crypt fragment som förekommer i det smälta materialet. (C) Typiska för &#39;digest&#39; 4 eller 5. Panel (D) representerar poolade smälta materialet från&#39;digere&#39; 3-5 passera genom ett 100 pm filter för att avlägsna de större oönskade vävnadsfragment som ses i (C). Alla bilder togs med hjälp av en digital inverterat mikroskop med en 20X mål. Skalstrecken = 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 6. Plätering Tarmkulturer (Berikat för kryptceller) <ol><li> Avlägsna överskott av BMM-lösning från plattan eller rätter, och tillsätt 250 | il förvärmd odlingsmedium per utsöndring brunn. OBS: Imaging rätter lämnas utan mediet så vidare till nästa steg snabbt för att förhindra att skålen från att torka ut. </li><li> Plattan 250 | il cellsuspension per brunn (24-brunnsplatta) eller per glas nedre skålen. <ol><li> Plate droppvis i en långsam &#39;sick-sack&#39; rörelse över brunnen. Tillåta crypt fragment sedimentera under ~ 5 min innan förflytta plattan till the inkubator. OBS: Detta bör uppmuntra en jämn fördelning av kryptor / celler i brunnen. </li></ol></li><li> Inkubera plattan eller rätter över natten vid 37 ° C och 5% CO2. OBS! &#39;Ojämn&#39; monolager borde ha bildats. För en representativ bild av kulturer efter tre tvättar, se figur 2A. </li><li> översvämning avbildnings rätter med 2 ml förvärmda odlingsmedium per skål. OBS! Dessa rätter kommer att vara lämpliga för avbildning upp till ~ 72 timmar efter plätering. Kolon kulturer varar vanligtvis längre, upp till 7 dagar. Celler som inte har vidhäftade kan avlägsnas genom ett tvättsteg. Primära kulturer är nu redo att användas för experiment. </li></ol>

<ol>
	<li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+A+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li><li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+chemosensing+mechanisms.">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li><li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incretin-based+therapies+for+type+2+diabetes+mellitus.">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li><li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines.">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li><li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine.">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li><li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors.">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li><li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids.">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li><li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture:+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides.">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li><li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag,+NCI-H716,+and+STC-1+cells:+a+comparison+to+native+L-cells.">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li><li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium.">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li><li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells.">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li><li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1.">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li><li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells.">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li><li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2.">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li><li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells.">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells.">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li><li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans.">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li><li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents.">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li><li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells.">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och enkelcell avbildning av märkta enteroendocrine celler. För att öka sannolikheten av de små tarm kulturer vara framgångsrika, är det viktigt att protokollet genomförs så snabbt som möjligt (helst inom 3 h från skörd av vävnad) och att vävnaden hålles i is-kallt medium eller buffert före till uppslutningsprocessen, för att begränsa celldöd. Även om det inte är nödvändigt, särskilt för kolon kulturer är avlägsnande av muskellagret från tunntarmen uppmuntras starkt. Tunntarmens kultur protokoll har standardiserats så mycket som möjligt. Det är dock viktigt att notera att ingen rötningen är identiska. Det finns många steg under detta protokoll där variabilitet kan införas på en dag till dag, t.ex. graden av muskel borttagning, storleken på than &#39;malet&#39; vävnadsbitar, styrkan i skakning, potensen hos en viss sats av kollagenas osv. Det är därför, av största vikt för att inspektera alikvoter av var och en av de olika &#39;digests&#39; under mikroskop för att bedöma utvecklingen av rötningsprocessen och skräddarsy skakning och antalet &#39;digere&#39; i enlighet därmed. Det rekommenderas att skaka mer försiktigt till att börja med, och om crypt fragment inte är uppenbara från &#39;smälta&#39; 3 och framåt, för att börja skaka mer kraftfullt. Från vår erfarenhet, inte enteroendocrine cellerna inte förökar sig i kultur och vanligtvis försvinner från små tarm kulturer inom 4 dagar. Icke desto mindre, ger detta gott om tid att utföra tarmpeptidsekretionsexperiment (genomföres typiskt över 2 h, 18-24 h efter plätering) för att testa fysiologiska stimuli och / eller farmakologiska medel. Experiment som kräver en inkubation över natten före utsöndringen experimentet är också möjliga, t.ex.i fallet med förbehandling med pertussistoxin 15. Den primära tekniken kulturen presenteras här är en väl etablerad metod, vilket framgår av volymen av forskningsresultaten har producerat genom åren. Primärkulturen modell har använts för att studera utsöndringen av en mängd olika tarmpeptider, inklusive GLP-1 1, GIP 18 och PYY 19, som svar på varierande näringsämnen och icke-närings 14, 20 stimuli och hämmare. Vidare har samma teknik med framgång tillämpas på odling av humana intestinala celler 21. Ofta, en kombination av den primära cellodlingsmetod tillsammans med ytterligare en experimentmodell t.ex.. ex vivo eller in vivo kan ge den mest insikt 6. Noterbart och till skillnad från andra metoder, har denna teknik imtig applikationer utöver mätningen av tarmen peptidfrisättning. Vi har visat att primära tunntarms kulturer härledda från transgena reporter möss är kraftfulla verktyg för förhör av intracellulära signaleringsvägar är kopplade till gut peptidsekretion, med användning av exempelvis Ca2 + och cAMP-sensorer, GCaMP3 11, 13 och Epac2camps 14, respektive, såväl som elektrofysiologiska tekniker 12. Som med alla in vitro-modeller, de primära intestinala kulturer har vissa inneboende begränsningar, inkluderande minskning av polariteten hos epitelceller i odling, samt förlust av försörjning och innervation blod. Det är svårt att uppskatta de potentiella effekterna av dessa konstgjorda villkor enteroendokrina cellfunktion. Dock har data som erhållits från primära kulturer ofta varit översättnings i in vivo Setting (t ex effekter av kortkedjiga fettsyror på GLP-1-utsöndring 15). De primära intestinala kulturer är en mångsidig teknik med många potentiella tillämpningar. De har redan gett viktiga mekanistiska inblick i regleringen av tarmpeptidsekretion.

Det övergripande målet med denna metod är att isolera och kultur blandade murina tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och levande cell imaging av enteroendocrine celler. En tidig version av detta förfarande publicerades ursprungligen 2008 av Reimann et al. 1 och har sedan legat till grund för ytterligare 20 publikationer från vår grupp. För detta manuskript, valde vi att fokusera på små tarm kulturer eftersom de är svårare att fastställa än kolon kulturer. Enteroendocrine celler utsöndrar en array av tarmpeptider inklusive glukagonliknande peptid 1 (GLP-1), glukosberoende insulinotropisk peptid (GIP), kolecystokinin (CCK) och peptid YY (PYY) 2. Dessa gut peptider har viktiga fysiologiska roller i iscensätta postprandial svar såsom det långsammare tarm transitering, potentiering av glukosstimulerad insulinfrisättning och induktion av mättnad. GLP-1-mimetika and läkemedel som inhiberar dess nedbrytning närvarande godkänt för behandling av typ 2-diabetes och det finns pågående bedömning av den terapeutiska potentialen att stimulera den endogena sekretionen av denna peptid 3. En bättre förståelse av enteroendokrina fysiologi och de mekanismer genom vilka utsöndring är antingen stimulerade eller hämmade är därför av avgörande betydelse. Gut peptidsekretion kan studeras med hjälp av olika in vitro- och ex vivo experimentella modeller, var och en med fördelar och nackdelar (för en omfattande senaste omdömet också täcker användningen av in vivo-modeller se Svendsen et al. 4). Ex vivo-tekniker såsom de isolerade perfuserade tarm 5 och Ussing kamrarna 6 används för närvarande för att utforska gut peptidsekretion som svar på olika ämnen. Den största fördelen med dessa metoder, somjämfört med primära kulturer är att den omedelbara omgivningen av de enteroendocrine cellerna förblir i stort sett intakt och viktigare, är polariteten hos cellerna bevaras. Därför är det möjligt att få fram information om vilka cellytan en sekretagog verkar på sex. Men dessa är vanligtvis lågt genomströmning tekniker och kvaliteten på de data som härrör från dem är starkt beroende av integriteten och viabiliteten hos tarmvävnaden, vilket oundvikligen minskar över tiden. Tarm organoids nu alltmer används som in vitro-modeller för studier av enteroendokrina cellernas funktion och utveckling 7. Organoids, som kan härledas från både murina och humanvävnad, har fördelen att bilda 3D &#39;crypt-liknande&#39; strukturer som upprätthåller cell polaritet i kultur. Emellertid organoid härledda enteroendocrine celler har ännu inte fullständigt karakteriserade och deras likhet med nativ L-cells är i stort sett okända. Primära kulturer har fördelen av att vara ett steg närmare den fysiologiska inställning, som enteroendocrine cellerna inte upprätthålls och differentieras i artificiella förhållanden under längre tidsperioder. En alternativ primär kultur metod som har använts för bedömning av tarmpeptidsekretion är isoleringen av fetala rått intestinala celler (FRICs) 8. Emellertid har den kultur av vuxna tarmvävnad träffade mindre framgång och vissa skillnader har observerats i mottagligheten hos FRICs vs. vuxna murina tarmceller (t ex glukos 8). Enteroendocrine liknande cellinjer (t.ex. GLUTag, STC-1 och NCI-H716) har traditionellt använts för att särskilja direkt vs. indirekta effekter på enteroendocrine celler och att dissekera underliggande molekylära mekanismer som kopplar stimulera utsöndring; se Kuhre m.fl. </em&gt;. 9 för peptidproduktion och utsöndring av &#39;L celliknande&#39; odödliggjorda cellinjer. Detta har varit nödvändigt eftersom enteroendocrine celler, utspridda längs mag-tarmkanalen, utgör knappt 1% av intestinala epitelceller 10 och sorteras celler, i våra händer, inte överlever i kultur 1. Cellinjer förblir användbara verktyg på grund av det faktum att de är en till stor del homogen cellpopulation, som är gynnsam för genetiska manipulationer såsom gentystande. Följaktligen är det lätt att undersöka rollen av proteiner som inte kan riktas farmakologiskt när transgena möss är inte tillgängliga. Men cellinjer är inte alltid giltiga modeller av primära celler. Medan det finns många likheter, fynd från primära kulturer har ibland markerade skillnader i de signalvägar som aktiveras av vissa näringsämnen i primära L-celler jämfört med GLUTag-celler, till exempel (t ex. Peptoner &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 11). Avgörande, i kombination med transgena fluorescerande reporter möss, gör det möjligt för primär kultur modell ingående granskning av enskilda primär enteroendocrine celler vid den intracellulära nivån. Fluorescensetikette L-celler inom primära kulturer har använts av vår grupp för patch fastspänning 1, 12 studier, och encelliga kalcium 11, 13 och cykliskt adenosinmonofosfat-FRET avbildning 14 studier, som har gett betydande framsteg inom området för enteroendokrina fysiologi. Följande protokoll är optimerad för att utföra utsöndringsexperiment, med användning av en 24-brunnsplatta eller för framställning av upp till 16 avbildnings rätter, från en 10 cm sektion av tunntarmen från en enda vuxen mus. Protokollet kan lätt modifieras för studiet av kolonceller genom att öka uppslutningstider samt collagenase koncentration.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td>For secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bombesin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4272</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 ml, sterile</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188261</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 ml, sterile</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430828</td>
			<td>For tissue preperation/ digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI (Crude)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9407</td>
			<td>For making up digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High glucose (4500 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6546</td>
			<td>For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps/Tweezers</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT520</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottomed dishes (35 mm)</td>
			<td>MatTek</td>
			<td><a href="https://ufslive.admin.cam.ac.uk/OA_HTML/OA.jsp?OAFunc=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;OASF=ICX_POR_REQMGMT_DETAIL&amp;reqHeaderId=%7B%21%21VHZooXq3GHQ6ng85h4o4sA%7D&amp;retainAM=Y&amp;addBreadCrumb=Y&amp;_ti=372495995&amp;oapc=18&amp;oas=dSLT2zPz7cgLm-ZkBP6Y6Q.." title="MatTek glass bottom dishes P35G-0-14-C">P35G-0-14-C</a></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High precision tweezer (110 mm)</td>
			<td>IDEAL-TEK</td>
			<td>3480641 (5 SA)</td>
			<td>For removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution digital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-ER</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td>Positive control (secretion experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium (Leibovitz)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1518</td>
			<td>For collecting tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaFluor&#160;</td>
			<td>Molecular Devices (supplied by Cairn Research)</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescence ratio imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (C57BL6)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
			<td>For calcium imaging and secretion experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (EVOS XL Core)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMEX1000</td>
			<td>For photomicrographs of cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71</td>
			<td>Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>LW4234</td>
			<td>For cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS containing Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>For washing tissue, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0781</td>
			<td>For making up culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 20 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td>For cleaning tissue and removing muscle layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/4280/53</td>
			<td>Positive control (calcium imaging experiment)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGT554</td>
			<td>For dissection/removal of intestine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>For filtering crypt cell suspension prior to plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>0308</td>
			<td>For dicing tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, Minisart NML (0.2 &#181;m pore size)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534-K</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip</td>
			<td>BD</td>
			<td>300613</td>
			<td>For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenon arc lamp 75W</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td>-</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells

Tarmen är den största endokrina organ i kroppen, med hormonutsöndrande enteroendocrine celler belägna utmed längden av det gastrointestinala epitelet. Trots deras fysiologiska betydelse enteroendocrine celler utgör endast en liten del av epitelceller befolkningen och i det förflutna, har deras karakterisering presenteras en stor utmaning som resulterar i ett beroende av cellinje modeller. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära kulturer har använts för att identifiera de signalvägar som ligger bakom stimulering och inhibering av tarmpeptidsekretion som svar på ett antal näringsämnen och neuropeptider samt farmakologiska medel. Vidare, i kombination med användningen av transgena fluorescerande reporter möss, har vi visat att dessa primära kulturer blivit ett kraftfullt verktyg för undersökning av fluorescerande-taggade enteroendocrine celler vid itracellular nivå, med användning av metoder såsom fläckklämning och encelliga kalcium och cAMP-FRET avbildning.

Användningen av serie matsmältning steg möjliggör insamling av en relativt ren beredning av crypt fragment som skall pläteras för experiment. De två första digere avlägsna primärt enskilda celler och cellavfall från smälta materialet (Figur 1A). Under det tredje digere, crypt fragment visas i den digererade materialet (figur 1B). Digests 4 och 5 utbyte ett större antal crypt fragment med färre enskilda celler (Figur 1C). Filtrering av det poolade materialet från digere 3-5 avlägsnar större bitar av osmält vävnad, som kan vara skadliga för kulturen, som producerar en ren krypta fragmentpreparat (figur 1D). Efter 18-24 timmar av kultur, är monoskikt av primära små tarmceller observeras (Figur 2A). Med användning av kulturer som genereras från transgena möss specifikt uttrycker calcium fluorescerande sensor, GCaMP3, under kontroll av den proglukagon promotorn 11, L-celler är lätt identifierbara och uppblandat inom odlingen (figur 2B). I primära små tarm kulturer, föreningar med inriktning på Gq -Ca 2+ i och cAMP jag -beroende vägar stimulerade utsöndringen av GLP-1 (för utsöndring experiment metodik se et al. Reimann 1). Bombesin (BBS, 100 nM) och co-tillämpning av forskolin och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / I, 10 ^ M vardera) utlöste en 2- och 11-faldigt, stimulering av GLP-1 frisättning i förhållande till basala, respektive (figur 2C). Specifik L-cell expression av GCaMP3 möjliggör identifiering av och övervakning i realtid av kalciummobilisering i enskilda L-celler. Både 100 nM bombesin (BBS) och 30 mM kaliumklorid (KCl) stimulerade variga ökningar av intracellulärt kalcium indikerar den kända G q &lt;/ sub&gt; - och elektrogen kopplade vägar i primära L-celler (Fig 2D). <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figur 2: Representativa data härledda från primära små tarm kulturer. Exempel bilder av blandade primära tunntarmskulturer som används för (A) sekretion och (B) imaging experiment posta 24 h plätering. (A) Bild tagen från en 24-brunnar, med användning av en digital inverterat mikroskop med en 4X objektiv. Scale bar = 500 | im. (B) Med användning av GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 möss, L-celler i synfältet (gröna celler) identifierades genom fluorescensen av GCaMP3. Skala stapel representerar 50 um. (C) GLP-1-utsöndring mättes i respons på bombesin (BBS, 100 nM) och forskolin / 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / I, 10 ^ M vardera). Procentuell GLP-1-utsöndring beräknadesgenom mätning av GLP-1-nivåer i supernatanterna och cellysat. Data representerar medelvärden ± SEM av n = 3 för varje tillstånd. (D) GCaMP3 fluorescens (reflekterande cytosoliskt kalcium) av de två cellerna som beskrivs i (B) övervakas i realtid som svar på kaliumklorid (KCl, 30 mM) och BBS (100 nM). Enda cell imaging utfördes med användning av ett inverterat fluorescensmikroskop med ett 40X oljeimmersionsobjektiv. GCaMP3 exciterades vid 475/10 nm, med användning av en 75 W xenon båglampa och en monokromator styrs av fluorescens bildprogram. Emission registrerades med en högupplöst digital laddningskopplad anordning (CCD) kamera med användning av en dikroisk spegel och en 510-560 nm bandbreddsfilter. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells at JoVE.com

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära intestinala kulturer möjliggöra undersökning av signalvägar underliggande tarmen peptidsekretion genom att använda ett antal tekniker.

Blandade primära kulturer av murina Tunntarm för studier av Gut hormonutsöndring och Levande cell imaging av enteroendokrina Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

Primär Neuronal kulturer från hjärnan hos sent stadium Drosophila puppor

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Generering av Spritt Presomitic mesoderm cellkulturer för avbildning av Zebrafish Segmente Klocka i enstaka celler

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mus Fetal Hela tarm Kultur System för<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulering av signaleringsvägar och Tredimensionell Live avbildning av Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-cellbildning av blodplättdiplanering och utsöndring under flöde

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Superupplösning Live Cell Imaging av subcellulära strukturer

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Monitoring Gut Acidification in the Adult Drosophila Intestine

Övervakning av tarmförsurning i den vuxna Drosophila Intestine

The fruit fly midgut consists of multiple regions, each of which is composed of cells that carry out unique physiological functions required for the ...