Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Ahmed Aly 得到土耳其发展部 2015BSV036 赠款给 Bezmialem Vakif 大学的资金支持,以及杜兰大学公共卫生和热带医学学院提供的资金,以及 NIH-NIAID 为 R21Grant 提供的资金1R21AI111058-01A1。

这里描述的所有动物实验都是根据杜兰大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)和贝兹米亚莱姆·瓦基夫大学动物伦理委员会批准的规程进行的。所有其他实验规程和重组DNA的使用都是根据杜兰大学机构生物安全委员会(IBC)批准的规程进行的。
1. 小鼠感染血期寄生虫,用于寄生虫病分析和蚊子感染分析
<ol><li>第3天:可选地将苯乙酰胺注射到受体小鼠中
	<ol>
<li>使用 26 G ...

尽管小鼠疟疾模型在一般生物学中与人类疟原虫的生命周期相似,但鼠疟疾模型与人类疟原虫物种也有许多不同,这将限制其作为可靠体内模型的使用。例如,除了作为疫苗的活减毒寄生虫外,所有带有亚单位、DNA和其他疫苗的疫苗研究在小鼠模型中都取得了优异的结果,但在生活在流行地区的人类中,结果远不能令人满意。
另一个问题是生命周期阶段感染性从一个小?...

疟原虫在全世界造成数以亿计的疟疾感染,每年有60多万人死于疟疾。人类感染是由五种疟原虫引起的,即恶性疟原虫、疟原虫、疟原虫、疟原虫和疟原虫。 大多数临床疟疾死亡是由撒哈拉以南非洲地区恶性疟原虫引起的。另一种在撒哈拉沙漠以南的非洲地区引起广泛全球病症的人类疟原虫是P.vivax2。其他三个物种都更受地理限制,并引起良性疟疾感染,除了致命的P. 缺乏相关和实际的非人类体内感染模型一直是而且仍然是疟疾疫苗和药物开发的障碍。早期的疟疾药物靶向和代谢研究已经广泛依赖于禽流感模型,如胆汁和P.lophurae,分别感染鸡和鸭,分别4。此后,各种疫苗和药物靶向研究逐渐引入啮齿动物疟疾物种,作为体内模型。多年来,啮齿动物疟疾模型与人类疟疾物种的生物学和宿主-寄生虫相互作用的相似性证据不断积累。
特别是,啮齿动物疟疾模型对于探索和描述蚊子生物学和红细胞前第5阶段极为重要。然而,有四种啮齿动物疟疾物种(P.berghei,P.yoelii,P.chabaudi和P.vinckei)具有不同的生物特征,其中最显著的是血液阶段6。 疟疾的疟疾物种在血液阶段的同步性上有所不同,其中P.chabaudi和P.vinckei菌株的血期大部分是同步的,而P.berghei和P.yoelii的血期不是6,7.另一个显著区别是某些菌株(例如,P. yoelii 17X-NL、P. berghei NK65 和P. vinckei lentum)的血液阶段的自我清除,而其他菌株的血液感染如果得不到治疗,同一物种的菌株可能是致命的(P.yoelii 17X-L,P. berghei ANKA 和P. chabaudi AS)。此外,P.yoelii 17X-NL 菌株和P. berghei ANKA 菌株优先入侵视网膜 8、9、10、11,尽管 P 的这些特征。尤利和宝海菌株不是严格的生长要求12,13,14。因此,在感染这些寄生虫的血液阶段之前,小鼠使用苯乙酰乙酰胺进行治疗,以增加P.berghei ANKA菌株和P.yoelii的蚊子感染所需的寄生虫血症和肌细胞血症17X-NL15,16,17,18,19。
不同啮齿动物疟疾物种之间也存在蚊子阶段发育的差异,其中最显著的是最佳蚊子阶段发育所需的温度和时间以及孢子菌长度5、6 20.在啮齿动物疟疾菌群的红细胞前阶段,差异包括最易感染孢子菌的啮齿动物种类和菌株,易感啮齿动物菌株接种所需的孢子菌数量,体外肝阶段发育测定所需的哺乳动物细胞类型,以及完成肝阶段发育的时间5、21、22、23、24、25 ,26,27,28,29,30.
尽管存在这些变异性,啮齿动物疟原虫在早期是应用反向遗传方法的有利模型,因为它们较少耗费时间和资源,成功概率高31。事实上,啮齿动物疟疾模型是最好的模型,在许多情况下,是唯一的模型,可用于功能特征基因表达在蚊子和肝脏阶段多年。
鉴于反向遗传方法在啮齿动物疟疾模型中的流行性和可得性,已采用多种不同的方法分析转基因寄生虫生命周期阶段的表型,特别是血液阶段。然而,其中一些方法不一致;例如,比较注射IP后血期寄生虫的感染(可能排到围肠淋巴结,从那里进入血液;因此,注射的寄生虫在血液中不会同样地进入),将克隆的蚊子传播与不同数量的序列血阶段转移或G数(可能影响细胞生成32,33)进行比较,或将转基因寄生虫直接与幼稚的野生型(WT)进行比较从未接受电穿孔和阳性药物选择以及各种非标准化的雄性配药除虫评价的寄生虫。因此,对血液和蚊子中任何类型的转基因或WT啮齿动物疟原虫进行类称分析,以适应啮齿动物疟疾的生物变异性,使简单易遵循的协议标准化至关重要。寄生虫物种。
本文报告转基因或野生P.yoelii和P.berghei寄生虫的血液和蚊子生命周期阶段的标准化、详细的实验方案。这些协议也适用于P.chabaudi和P.vinckei寄生虫。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

遗传学和系统生物学技术的最新进展促进了我们对疟原虫生物学在分子水平上的理解。然而,疫苗和化疗开发的有效疟原虫目标仍然有限。这主要是由于人类疟原虫物种缺乏相关和实用的体内感染模型,最显著的是恶性疟原虫和P.vivax。 因此,啮齿动物疟疾物种在体内被广泛用作疟疾疫苗、药物靶向、免疫反应和保存的疟原虫基因的功能表征研究的实用替代物。事实上,啮齿动物疟疾模型已被证明是无价的,特别是对于探索蚊子传播和肝阶段生物学,并且对于免疫学研究是必不可少的。然而,用于评估转基因和野生类无性及性血期寄生虫的表型的方法存在差异。这些差异的例子包括选择静脉注射与内腹感染啮齿动物与血期寄生虫,以及评估雄性Gamete灭菌。本文详细介绍了标准化的实验方法,以评估转基因寄生虫中无性血和性血阶段的表型,表达报告基因或野生型啮齿动物疟原虫物种。我们还详细介绍了评估疟原虫蚊媒内疟原虫阶段(配子、卵母细胞、卵泡和孢子菌)的表型的方法。 这些方法在这里详细和简化,用于P.berghei和P.yoelii的致命和非致命菌株,但也可用于对P.chabaudi和P.vinckei啮齿动物疟疾物种进行一些调整。

将反向遗传工具和技术应用于疟原虫的成功彻底改变了疟疾研究领域,能够添加、删除或修改几种疟原虫物种39的特定基因组片段。重要的是,可分配基因组位点已被识别并成功用于通过双同源重组在啮齿动物和人类疟原虫中引入荧光蛋白标记物,以确保在所有生命周期阶段具有稳定的表达40 ,41,<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

啮齿动物疟原虫无性、性血期和蚊子阶段的类状分析

由于啮齿动物疟原虫的生命周期和生物学与人类疟原虫有着惊人的相似性,啮齿动物疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的一部分。在这里,我们标准化了野生型和转基因啮齿动物疟疾物种的类名分析中使用的一些最重要的技术。

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

由于啮齿动物疟疾寄生虫的生命周期和生物学惊人的相似性，人类疟疾寄生虫、啮齿动物疟疾模型已成为疟疾研究不可或缺的模式。这些标准方法可以帮助回答疟疾研究领域中关于如何对野生类型和转基因啮齿动物疟疾物种进行表型分析的关键问题。演示程序将是研究生戈兹德德韦奇和伊尔克努尔耶尔马兹从我的实验室。首先快速解冻冷冻保存的冷冻寄生虫，并立即使用配备26量针的1毫升注射器，每基因型至少注射两只供体小鼠，并注射约200微升的库存。注射24小时后，使用24或26测针刺第一只小鼠的尾巴，并在显微镜滑梯上收集血滴。使用另一张幻灯片的短边快速涂抹第一张幻灯片上的血液。当血液完全干燥后，将幻灯片固定为100%甲醇至少一分钟。将固定样品在 Giemsa 中染色 10 至 15 分钟，然后进行单或双蒸馏水洗涤。当幻灯片干燥后，在 100 倍的物目下查看样品，并在光学显微镜上浸入油，以计算每个网格受感染的红细胞总数。感染后两到三天，保护麻醉小鼠，其中寄生虫已经达到0.1至1%之间的upine位置，并使用钳子抬起胸骨底部附近的皮肤，以促进皮肤切口的产生。将切口部位的皮肤拉开，露出隔膜和腹腔顶部，并使用钳子握住肋骨的基座，同时穿过隔膜进入胸腔。将肋骨固定回，以暴露心脏，并使用含有至少 20 微升肝素的一毫升注射器，并配备 26 量针轻轻刺穿心脏组织。慢慢收回柱塞，收集大约一毫升的血液，将血液分配到微离心管中。当所有血液都收获后，在红色热灯下加热受助小鼠，并加载一个胰岛素注射器，每个接受者配备27个量表针，并携带适当剂量的寄生虫。然后将第一个接受者放入抑制器中，将全剂量的受感染红细胞注射到扩张的尾静脉中。对于蚊子喂养，允许成年的4至7天大雌性阿诺尔菲斯·斯蒂芬西或阿甘尼蚊子饿死8至12小时，以补充15分钟，以麻醉感染的小鼠，其排泄率最高。为了确定每只蚊子的卵石数量，在冰箱里对20至30只蚊子实施安乐死不少于10分钟，并使用双目解剖范围和两根26或27针解剖含有适当解剖溶液的玻璃幻灯片上的蚊子中游。要解剖中腹，首先用一根针将腹部的下部握到位，然后小心地将胸部轻轻推入腹部和胸部之间的交叉处，直至将胸部分开，从胸部向下晃来晃去一个白色中腹。现在，用用来将胸部向上推的相同针头从食道端切开中肠，从而分离并分散中肠。用针头从解剖介质中抬起解剖的中缝，将其转移到装满200微升RPMI的管子上。当所有中古体被解剖和收获后，将含有中古的管子放入离心机中一分钟，以700倍的g。然后用刺擦研磨收获的纸巾两次。将稀释组织溶液的12微升转移到一个血液计，并在室温下孵育血液计5分钟，使内装物沉淀。然后在相位对比度和 40 倍放大率下，确定光学显微镜上卵母细胞的平均数量。为了确定每只蚊子唾液腺孢子虫的数量，在喂养后的适当时间点，如证明，冷冻安乐死50至100只雌性蚊子，并使用解剖显微镜和26或27个量表针的侧面分离唾液腺。要解剖唾液腺，首先用一根针的斜面将上腹部或胸部握住，然后小心地轻轻推头，在头部和胸部之间的交界处向上推。推至头部小心地与胸部分离，而不会撕裂玻璃唾液腺。使用短玻璃巴斯德移液器将解剖唾液腺从解剖介质中提升，并放入1.5毫升管中。当所有唾液腺被解剖和收获后，将含有腺体的管子放入离心机中，以700倍g的浓度进入离心机1分钟。用刺磨两次收获的组织。然后确定唾液腺孢子虫的平均数量，如以前做。转基因记者疟疾寄生虫被设计成在强而有组织促进剂的控制之下表达EGFP，在血液阶段、尿素、阿诺菲斯·斯蒂芬西中古特和从阿诺菲利斯·斯蒂芬西雌性唾液腺中分离出的孢子体中表现出荧光信号。流细胞学寄生虫百分比值直接对应于通过监测Giemsa染色的薄血涂片获得的估计寄生虫百分比，证明证实了后一种定量方法的有效性。此外，对不同无性阶段和性阶段的百分比的估计取决于红细胞的形态评估，而红细胞不能通过流细胞学进行评估。对感染内皮内与静脉注射途径的比较表明，与感染前四天的IV感染群体寄生虫百分比相比，IP感染群体寄生虫病百分比在统计学上显著下降，表明IV感染途径是疟疾寄生虫血期测定的定量更准确的途径。值得注意的是，苯甲苯酶治疗显著增加了多细胞的数量，从而增加了雄性游戏细胞形成的速度，进而增加了受精率和随后的所有蚊子阶段的数量。对啮齿动物疟疾血期寄生虫及其传播媒介进行表型分析的标准化方法缺乏。这些方法将有助于提供标准化和简化的协议，研究这些病原体及其生命周期阶段。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

补消耗的特定细胞群的枯竭

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

科研

免疫与感染

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

特定细胞群的净化荧光激活细胞分选（FACS）

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

生产的灭鼠疟疾寄生虫的遗传交叉议定书“

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

活体显微镜的脾：寄生虫的流动性和血流量的定量分析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

牛痘病毒记者量化病毒功能在基因表达的各个阶段

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

小鼠胎肝文化系统解剖靶基因功能的终端红细胞生成的早期和晚期

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

从表型分析和人体皮肤淋巴细胞分离<em&gt;离体</em&gt;细胞培养

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

表型和慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠中分离激活调节性T细胞的功能分析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

乙型肝炎病毒记者系统的开发监控复制周期的早期阶段

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...