Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Ahmed Aly understøttes af finansiering til Bezmialem Vakif University fra det tyrkiske ministerium for udviklingstilskud 2015BSV036, og ved hjælp af midler fra Tulane University School of Public Health og Tropical Medicine, og ved at støtte fra NIH-NIAID for R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, blev udført i henhold til de godkendte protokoller fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Tulane University og dyrenes etiske komité for Bezmialem Vakif Universitet. Alle andre forsøgsprotokoller og brugen af rekombinant DNA blev udført i henhold til de godkendte protokoller fra det institutionelle biosikkerheds udvalg (IBC) på Tulane University.
1. infektion af mus med blod-fase parasitter for Parasitemia analyse og myg in...

På trods af ligheden i den generelle biologi i deres liv cykler til at af menneskelige malaria parasitter, mus malaria modeller har også mange forskelle til menneskelige Plasmodium arter, der ville begrænse deres anvendelse som pålidelige in vivo modeller. For eksempel, med undtagelse af levende svækkede parasitter som vacciner, alle vaccine undersøgelser med underenhed og DNA og andre vacciner gav fremragende resultater i musemodel, men hos mennesker, der bor i endemiske områder, resultaterne va...

Malaria parasitter forårsager hundredvis af millioner af malaria infektioner hos mennesker over hele verden, med mere end 600.000 dødsfald hvert år1. Humane infektioner forårsages af fem malaria parasiter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaeog p. knowlesi. De fleste kliniske malaria MORTALITET er forårsaget af P. falciparum i Afrika syd for Sahara1. En anden Human malaria parasiter arter, der forårsager omfattende verdensomspændende morbiditeter uden for Afrika syd for Sahara er P. vivax2. De tre andre arter er alle mere geografisk begrænset og forårsage godartede malaria infektioner, undtagen den dødbringende P. knowlesi3. Den manglende adgang til relevante og praktiske ikke-humane in vivo-modeller af infektioner har altid været og er stadig en hindring for malariavaccine og lægemiddeludvikling. Tidligere malaria Drug målretning og metaboliske undersøgelser har påberåbt sig udførligt på aviær malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, inficere kyllinger og ænder, henholdsvis4. Derefter blev gnaver malaria arter gradvist introduceret i forskellige vacciner og stof målretning undersøgelser som in vivo-modeller. I årenes løb, beviser for ligheder i biologi og vært-parasisite interaktioner af livscyklus stadier af gnavere malaria modeller til menneskelige malaria arter har akkumuleret.
Især, gnaver malaria modeller var yderst vigtigt at udforske og karakterisere biologi af myg og præ-erythrocytiske stadier5. Men, der er fire gnaver malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei), der har forskellige biologiske egenskaber, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er i blodet faser6. Gnavere malaria arter adskiller sig i synkronicitet af blod stadier, hvor blod stadier af p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkrone, mens blodets stadier af p. berghei og p. yoelii ikke er6 , 7. en anden bemærkelsesværdig forskel er den selvstændige clearance af blod stadier, der forekommer i nogle stammer (f. eks p. yoelii 17x-NL, p. berghei NK65, og p. vinckei lentum), mens blodinfektion af andre stammer af samme art kunne være dødelig, hvis venstre ubehandlet (p. yoelii 17x-L, p. berghei Anka, og p. chabaudi AS). Desuden, p. yoelii 17x-NL stamme og p. berghei Anka stamme fortrinsvis invadere reticulocytter8,9,10,11, selv om disse funktioner i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vækst krav12,13,14. Derfor, mus er behandlet med phenylhydrazin før en infektion med blod stadier af disse parasitter til at øge parasitemia og gametocytemia nødvendig for en myg infektion for p. berghei Anka stamme og for p. yoelii 17x-NL15,16,17,18,19.
Forskelle i myg stadier udvikling også findes blandt forskellige gnavere malaria arter, den mest bemærkelsesværdige er den temperatur og tid, der kræves for optimale myg faser udvikling og sporozoite længde5,6, 20. I præ-erythrocytiske stadier af gnavere malaria arter, forskelle omfatter gnaverarter og stamme, der er mest modtagelige for infektiøs sporozoit inokulation, antallet af sporozoiter nødvendig for inokulation i en modtagelig gnaver stamme, pattedyrscelle typer, der er nødvendige til in vitro-udvikling af lever stadiet, og tid til at fuldføre udviklingen af lever stadiet5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
På trods af disse variabilitet, gnaver malaria parasitter var de gunstige modeller tidligt for anvendelsen af omvendte genetiske tilgange, fordi de var mindre tid-og ressourcekrævende med en høj sandsynlighed for succes31. Faktisk, gnaver malaria modeller var de bedste modeller, og i mange tilfælde de eneste modeller, der er tilgængelige i mange år til funktionelt karakterisere gener udtrykt i myg og leveren stadier.
I lyset af den popularitet og modtagelighed af omvendte genetiske tilgange i gnavere malaria modeller, en række forskellige metoder er blevet udnyttet til at analysere fænotyper af transgene parasitiske livscyklus stadier, især blod stadier. Nogle af disse metoder er imidlertid inkonsekvente; for eksempel, sammenligne infektioner i blod-fase parasitter efter en IP injektion (som muligvis drænet til peritonealdialyse lymfeknuder og, derfra, kan komme ind i blodbanen; derfor, de injicerede parasitter ikke ender lige i blodbanen) , sammenligne myg transmission af kloner med et andet antal serielle blod-Stage overførsler eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naive vildtype (WT) parasitter, der aldrig blev udsat for elektroporation og positive Drug udvælgelse og de forskellige ustandardiserede evalueringer af mandlig gamet exflagellation. Derfor er det afgørende at standardisere protokoller, der er enkle at følge for fænotypiske analyse af enhver form for transgene eller WT gnavere malaria parasitter i blodet og i myg til at rumme for de biologiske intra af gnavere malaria parasiter.
Heri, rapporterer vi om en standardiseret, detaljeret forsøgsprotokol for fænotypisk analyse af blod og myg livscyklus stadier af transgene eller vild-type p. yoelii og p. berghei parasitter. Disse protokoller gælder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

Nylige fremskridt inden for Genetik og systemer biologi teknologier har fremmet vores forståelse af biologi malaria parasitter på molekyleniveau. Men, effektive malaria parasisite mål for vaccine og kemoterapi udvikling er stadig begrænset. Dette skyldes hovedsagelig, at der ikke findes relevante og praktiske in vivo -infektions modeller for humane Plasmodium arter, især for p. falciparum og p. vivax. Derfor, gnaver malaria arter er blevet flittigt anvendt som praktisk alternativ in vivo modeller for malariavaccine, Drug målretning, immunrespons, og funktionelle karakterisering undersøgelser af bevaret Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnaver malaria modeller har vist sig at være uvurderlig, især for at udforske myg transmission og leveren scenen biologi, og var uundværlige for immunologiske undersøgelser. Der er dog afvigelser i de metoder, der anvendes til at evaluere phenotyper af transgene og vildtype aseksuelle og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse uoverensstemmelser er valget af en intravenøs vs. intraperitoneal infektion af gnavere med blod-fase parasitter og evaluering af mandlig gamet exflagellation. Heri, vi detaljeret standardiserede eksperimentelle metoder til at evaluere phenotyper af aseksuelle og seksuelle blod stadier i transgene parasitter udtrykker reporter-gen eller vild-type gnaven malaria parasitten arter. Vi også detaljer metoderne til at evaluere phenotyper af malaria parasitisk myg stadier (gametes, ookinetes, oocyster, og sporozoiter) inde Anopheles myg vektorer. Disse metoder er detaljeret og forenklet her for de dødbringende og ikke-dødelige stammer af p. berghei og p. yoelii men kan også anvendes med nogle justeringer af p. chabaudi og p. vinckei gnavere malaria arter.

Succesen med at anvende omvendte genetiske værktøjer og teknikker til malaria parasitter har revolutioneret området for malaria forskning, med evnen til at tilføje, slette eller ændre specifikke genomiske segmenter af flere Plasmodium arter39. Vigtigere er, at undværes genomloci er blevet identificeret og anvendt med succes til at introducere fluorescens protein markører i gnavere og humane malaria parasitter ved dobbelt homologe rekombination, for ...

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Fænotypisk analyse af gnaven malaria Parasisite aseksuelle og seksuelle blod stadier og myg stadier

På grund af de slående ligheder i livscyklus og biologi af gnavere malaria parasitter til humane malaria parasitter, gnaver malaria modeller er blevet uundværlig for malaria forskning. Heri, vi standardiseret nogle af de vigtigste teknikker, der anvendes i fænotypiske analyse af vildtype og transgene gnaver malaria arter.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

På grund af de slående ligheder i livscyklus og biologi af gnaver malaria parasitter, de menneskelige malaria parasitter, gnaver malaria modeller er blevet uundværlig for malaria forskning. Disse standard metoder kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i malaria forskning område om, hvordan man udfører en fænotopypisk analyse af vilde type og transgene gnavere malaria arter. Demonstrere procedurerne vil være kandidatstuderende Gozde Deveci og Ilknur Yilmaz fra mit laboratorium.Begynd med hurtigt optøning kryo konserveret frosne parasit bestande og straks ved hjælp af en en milliliter sprøjte udstyret med en 26 gauge nål til at injicere mindst to donor mus per genotype intraperitoneally med ca 200 mikroliters af materiel. Fireogtyve timer efter injektionen, bruge en 24 eller 26 gauge nål til at stikke halen af den første mus og indsamle bloddråbe på et mikroskop dias. Brug den korte kant af et andet dias til hurtigt at smøre blodet hen over det første dias.Når blodet er helt tørret, faststã neg objektglas i 100% methanol i mindst et minut. De faste prøver i Giemsa pletter i 10 til 15 minutter efterfulgt af en enkelt eller dobbelt destilleret vandvask. Når objektglassene er tørret, skal du se prøverne under et 100X mål og olienedsænkning på et let mikroskop til optælling af det samlede antal inficerede erythrocytter pr. gitter.To til tre dage efter infektionen, sikre en bedøvet mus, hvor parasitten har nået mellem 0,1 til 1% i liggende position og bruge kraftpind til at løfte huden nær bunden af brystbenet for at lette oprettelsen af en hud indsnit. Træk huden fra hinanden på det sted, hvor snittet for at udsætte mellemgulvet og toppen af bughulen og bruge de virlins til at holde bunden af brystkassen, mens skære gennem mellemgulvet for at komme ind i brysthulen. Pin tilbage brystkassen til at udsætte hjertet og bruge en en milliliter sprøjte, der indeholder mindst 20 mikroliter heparin og udstyret med en 26 gauge nål til forsigtigt punktering hjertevævet.Træk langsomt stemplet tilbage for at indsamle ca. en milliliter blod og dispensere blodet ud i et mikrocentrifugerør. Når alt blodet er høstet, varm modtagermusne under en rød varmelampe, og der indlæses en insulinsprøjt, der er udstyret med en 27 gauge-nål pr. modtager med den rette dosis parasit. Derefter placere den første modtager i en oversektor og injicere en fuld dosis af inficerede erythrocytter i en forstørret hale vene.For myg fodring, tillade voksne fire til syv-dages-gamle kvindelige Anopheles stephensi eller A.gambiae myg sultede i otte til 12 timer til at fodre mere mindst 15 minutter på bedøvet inficerede mus med den højeste exflagellation sats. For at bestemme antallet af oocyst sporozoitter pr myg, aflive 20 til 30 myg i fryseren for ikke mindre end 10 minutter og bruge en kikkert dissektion rækkevidde og to 26 eller 27 gauge nåle til at dissekere midguts af myg på et glas dias, der indeholder den relevante dissektion løsning. At dissekere midgut, først holde den nederste del af maven på plads med en nål og forsigtigt skubbe brystkassen meget let ved krydset mellem maven og brystkassen i en opadgående retning, indtil den adskiller brystkassen og en hvid farvet midgut er udsat dinglende ned fra brystkassen.Skær nu midgut fra spiserøret ende ved hjælp af samme nål, der blev brugt til at skubbe brystkassen opad og dermed adskille og sprede ud midgut. Løft den dissekerede midgut fra dissektionsmediet ved hjælp af en nål og overfør den til et rør fyldt med 200 mikroliter RPMI. Når alle midguts er blevet dissekeret og høstet, placere røret indeholder midguts i centrifugen i et minut på 700 gange g.Derefter male det høstede væv med en støder to gange. Overfør 12 mikroliter af den fortyndede vævsopløsning til et hemacytometer, og hemacytometeret inkuberes ved stuetemperatur i fem minutter, så indholdet kan falde til ro. Derefter bestemme det gennemsnitlige antal oocyst sporozoitter på et lys mikroskop under fase kontrast og en 40X forstørrelse.For at bestemme antallet af spytkirtel sporozoitter pr myg, på det rette tidspunkt efter fodring, fryse aflives 50 til 100 kvindelige myg som påvist og bruge en dissekere mikroskop og siden af en 26 eller 27 gauge nål til at isolere spytkirtlerne. For at dissekere spytkirtlerne skal du først holde den øvre del af maven eller brystkassen på plads med den skrå side af den ene nål og forsigtigt skubbe hovedet meget let og meget kort skubber ved krydset mellem hoved og brystkasse i opadgående retning. Skub, indtil hovedet er omhyggeligt adskilt fra brystkassen uden at rive op glasagtig spytkirtel.Brug en kort glas Pasteur pipette til at hæve de dissekerede spytkirtel fra dissektion medium og placere den i en 1,5 milliliter rør. Når alle spytkirtler er blevet dissekeret og høstet, placere røret indeholder kirtler i centrifugen i et minut ved 700 gange g. Grind det høstede væv med en støder to gange.Derefter bestemme det gennemsnitlige antal spytkirtel sporozoitter som tidligere gjort. Transgene reporter malaria parasitter manipuleret til at udtrykke EGFP under kontrol af en stærk og konstituerende promotor udviser fluorescens signal i blod stadier, ookinetes, unge oocysts på Anopheles stephensi midguts, og i sporozoitter isoleret fra spytkirtler af Anopheles stephensi hunner. Værdier for flowcytometriparasæmi svarer direkte til de anslåede parasitæmiprocenter, der opnås ved overvågning af Giemsa-farvede udstrygninger af tyndt blod, som påvist, der bekræfter gyldigheden af sidstnævnte kvantificeringsmetode.Desuden afhænger vurderingen af procentdelen af hver af de forskellige aseksuelle og seksuelle stadier af den morfologiske vurdering af erythrocytterne, som ikke kan vurderes ved flowcytometri. Sammenligning af intraperitoneal versus intravenøs infektionsveje afslører et statistisk signifikant fald i den IP-inficerede gruppe parasitæmi procent i forhold til IV inficerede gruppe parasitæmi procent i løbet af de første fire dage af infektion viser, at IV infektionsvej er en mere kvantitativt nøjagtig rute for analyser med malaria parasit blod stadier. Bemærk, phenylhydrazin behandling øger antallet af gametocytter, som øger antallet af mandlige gamete dannelse, hvilket igen øger befrugtning sats og antallet af alle efterfølgende myg faser.Der er en mangel på standardiserede metoder til fænopypisk analyse af gnaver malaria blod fase parasitter og deres overførsel til myg vektor. Disse metoder vil bidrage til at tilvejebringe standardiserede og forenklede protokoller til undersøgelse af disse patogener og deres livscyklustrin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Vira til kvantificering Viral Funktion på alle stadier af genekspression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Mus fosterlever Kultur System at dissekere målgenets funktioner på de tidlige og sene stadier af Terminal Erythropoiese

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fænotypisk og funktionel analyse af Aktiverede Regulatory T celler isoleret fra kronisk lymfatisk choriomeningitisvirus-inficerede mus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Udvikling af en hepatitis B virus Reporter system til at overvåge tidlige stadier af Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...