Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
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Ahmed Aly est soutenu par le financement de l'Université Bezmialem Vakif par le ministère turc du Développement 2015BSV036, et par le financement fourni par l'École de Santé Publique et de Médecine Tropicale de l'Université de Tulane, et par le financement des NIH-NIAID pour R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Toutes les expériences animales décrites ici ont été menées selon les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de Tulane et le comité d'éthique des animaux de l'Université Bezmialem Vakif. Tous les autres protocoles expérimentaux et l'utilisation de l'ADN recombinant ont été effectués selon les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de biosécurité (BAC) de l'Université tulane.
1. Infection de so...

Malgré la similitude de la biologie générale de leurs cycles de vie avec celle des parasites du paludisme humain, les modèles de paludisme à souris présentent également de nombreuses différences avec les espèces humaines de Plasmodium qui limiteraient leur utilisation comme modèles in vivo fiables. Par exemple, à l'exception des parasites atténués vivants comme vaccins, toutes les études de vaccins avec sous-unité et ADN et d'autres vaccins ont donné d'excellents résultats dans le modè...

Les parasites du paludisme causent des centaines de millions d'infections à paludisme chez l'homme dans le monde, avec plus de 600 000 décès chaque année1. Les infections humaines sont causées par cinq espèces de parasites du paludisme, à savoir P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, et P. knowlesi. La plupart des décès cliniques du paludisme sont causés par P. falciparum en Afrique subsaharienne1. Une autre espèce humaine de parasite du paludisme qui provoque de nombreuses morbidités dans le monde en dehors de l'Afrique subsaharienne est P. vivax2. Les trois autres espèces sont toutes plus limitées géographiquement et causent des infections bénignes de paludisme, à l'exception du P. knowlesimortel3. L'indisponibilité de modèles d'infections in vivo non humains pertinents et pratiques a toujours été et constitue toujours un obstacle au développement de vaccins antipaludiques et de médicaments. Le ciblage antérieur des médicaments antipaludiques et les études métaboliques se sont largement appuyés sur des modèles de paludisme aviaire comme P. gallinaceum et P. lophurae, infectant les poulets et les canards, respectivement4. Par la suite, les espèces de paludisme de rongeur ont été graduellement introduites dans divers vaccins et études de ciblage de drogue comme modèles in vivo. Au fil des ans, les preuves de similitudes entre les interactions biologie et interaction hôte-parasite des stades du cycle de vie des modèles de paludisme des rongeurs avec les espèces humaines de paludisme se sont accumulées.
En particulier, les modèles de paludisme des rongeurs étaient extrêmement importants pour explorer et caractériser la biologie des stades de moustique et de pré-érythrocytique5. Cependant, il existe quatre espèces de rongeurs (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, et P. vinckei) qui ont des caractéristiques biologiques différentes, dont les plus notables sont dans les stades sanguins6. Les espèces de rongeurs sont différentes dans la synchronicité des stades sanguins, où les stades sanguins des souches de P. chabaudi et de P. vinckei sont pour la plupart synchrones, tandis que les stades sanguins de P. berghei et de P. yoelii ne sont pas6 , 7. Une autre différence notable est l'autodébisation des stades sanguins qui se produit dans certaines souches (par exemple, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, et P. vinckei lentum), tandis que l'infection sanguine d'autres les souches de la même espèce pourraient être mortelles si elles n'étaient pas traitées(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA et P. chabaudi AS). De plus, la souche P. yoelii 17X-NL et la souche P. berghei ANKA envahissent de préférence les réticulocytes8,9,10,11, bien que ces caractéristiques de P. les souches yoelii et P. berghei ne sont pas une exigence de croissance stricte12,13,14. Par conséquent, les souris sont traitées avec de la phénylhydrazine avant une infection par les stades sanguins de ces parasites pour augmenter la parasitemia et le gamocytemia nécessaires pour une infection par les moustiques pour la souche P. berghei ANKA et pour P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.
Des différences dans le développement des stades des moustiques existent également entre les différentes espèces de paludisme des rongeurs, les plus notables étant la température et le temps requis pour le développement optimal des stades des moustiques et la longueur de la sporozoite5,6, 20. Dans les stades pré-érythrocytiques des espèces de paludisme de rongeur, les différences incluent les espèces de rongeurs et la souche qui sont les plus sensibles à l'inoculation infectieuse de sporozoite, le nombre de sporozoites nécessaires pour l'inoculation dans une souche sensible de rongeur, le types de cellules de mammifères nécessaires pour les essais in vitro de développement de stade de foie, et le temps de terminer le développement de stade de foie5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Malgré ces variations, les parasites du paludisme des rongeurs étaient les modèles favorables dès le début pour l'application d'approches génétiques inversées, parce qu'ils consommaient moins de temps et de ressources avec une forte probabilité de succès31. En fait, les modèles de paludisme des rongeurs étaient les meilleurs modèles, et dans de nombreux cas les seuls modèles, disponibles pendant de nombreuses années pour caractériser fonctionnellement les gènes exprimés dans les stades des moustiques et du foie.
À la lumière de la popularité et de l'agréabilité des approches génétiques inversées dans les modèles de paludisme des rongeurs, un certain nombre de méthodologies différentes ont été utilisées pour analyser les phénotypes des stades transgéniques du cycle de vie des parasites, en particulier les stades sanguins. Cependant, certaines de ces méthodes sont incohérentes; par exemple, comparer les infections de parasites au stade sanguin à la suite d'une injection ip (qui sont peut-être drainées aux ganglions lymphatiques péritonéaux et, à partir de là, peuvent entrer dans la circulation sanguine; par conséquent, les parasites injectés ne finissent pas également dans la circulation sanguine) , en comparant la transmission de moustiques de clones avec un nombre différent de transferts en série de stade sanguin ou de nombre G (qui pourrait affecter la gamcytogenèse32,33), ou en comparant les parasites transgéniques directement à la naïve de type sauvage (WT) parasites qui n'ont jamais été soumis à l'électroporation et à la sélection positive de drogue et aux diverses évaluations non normalisées de l'exflagellation masculine de gamète. Par conséquent, il est crucial de normaliser les protocoles qui sont simples à suivre pour l'analyse phénotypique de tout type de parasites transgéniques ou WT rongeur paludisme dans le sang et dans le moustique pour accueillir les variations biologiques du paludisme rongeur espèces parasites.
Ici, nous rendons compte d'un protocole expérimental normalisé et détaillé pour l'analyse phénotypique des stades du cycle de vie du sang et des moustiques des parasites transgéniques ou sauvages de Type P. yoelii et P. berghei. Ces protocoles s'appliquent également aux parasites P. chabaudi et P. vinckei.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

Les progrès récents des technologies de la génétique et de la biologie des systèmes ont favorisé notre compréhension de la biologie des parasites du paludisme au niveau moléculaire. Cependant, les cibles efficaces des parasites du paludisme pour le développement de vaccins et de chimiothérapies sont encore limitées. Cela est dû en grande partie à l'indisponibilité de modèles d'infection in vivo pertinents et pratiques pour les espèces humaines de Plasmodium, notamment pour P. falciparum et P. vivax. Par conséquent, les espèces de paludisme de rongeur ont été intensivement employées comme modèles in vivo pratiques d'alternative pour le vaccin antipaludique, le ciblage de drogue, la réponse immunitaire, et les études fonctionnelles de caractérisation des gènes conservés de Plasmodiumspp. En effet, les modèles de paludisme des rongeurs se sont avérés inestimables, en particulier pour l'exploration de la transmission des moustiques et de la biologie du stade du foie, et étaient indispensables pour les études immunologiques. Cependant, il existe des divergences dans les méthodes utilisées pour évaluer les phénotypes des parasites transgéniques et sauvages de type asexué et sexuel au stade du sang. Des exemples de ces écarts sont le choix d'une infection intraveineuse contre intrapéritonéal des rongeurs avec des parasites de stade sanguin et l'évaluation de l'exflagellation masculine de gamète. Ici, nous détaillons les méthodes expérimentales normalisées pour évaluer les phénotypes des stades du sang asexué et sexuel chez les parasites transgéniques exprimant des espèces de parasites du paludisme de type journaliste ou sauvage. Nous détaillons également les méthodes d'évaluation des phénotypes des stades des moustiques parasites du paludisme (gamètes, ookinetes, oocystes et sporozoites) à l'intérieur des moustiques vecteurs d'anophèles. Ces méthodes sont détaillées et simplifiées ici pour les souches létales et non létales de P. berghei et P. yoelii, mais peuvent également être appliquées avec quelques ajustements aux espèces de paludisme p. chabaudi et P. vinckei rongeur.

Le succès de l'application d'outils et de techniques génétiques inversés aux parasites du paludisme a révolutionné le domaine de la recherche sur le paludisme, avec la possibilité d'ajouter, de supprimer ou de modifier des segments génomiques spécifiques de plusieurs espèces de Plasmodium 39. Fait important, des loci génomiques dispensables ont été identifiés et utilisés avec succès pour introduire des marqueurs de protéines de fluorescenc...

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Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Analyse phénotypique des stades du sang asexué et sexuel du parasite du paludisme des rongeurs et des stades des moustiques

En raison des similitudes frappantes entre le cycle de vie et la biologie des parasites du paludisme des rongeurs et les parasites du paludisme chez l'homme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ici, nous avons normalisé certaines des techniques les plus importantes utilisées dans l'analyse phénotypique des espèces de paludisme de rongeurs de type sauvage et transgénique.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

En raison des similitudes frappantes du cycle de vie et de la biologie des parasites du paludisme chez les rongeurs, les parasites humains du paludisme, les modèles de paludisme des rongeurs sont devenus indispensables à la recherche sur le paludisme. Ces méthodes standard peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur le paludisme sur la façon d’effectuer une analyse phénotypique des espèces sauvages de type sauvage et de paludisme transgénique des rongeurs. Les étudiants diplômés Gozde Deveci et Ilknur Yilmaz de mon laboratoire feront la démonstration des procédures.Commencez par décongeler rapidement les stocks de parasites congelés préservés cryo et immédiatement à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 26 pour injecter au moins deux souris donneurs par génotype intraperitoneally avec environ 200 microlitres de stock. Vingt-quatre heures après l’injection, utilisez une aiguille de calibre 24 ou 26 pour piquer la queue de la première souris et recueillir la gouttelette de sang sur une lame de microscope. Utilisez le bord court d’une autre glissière pour salir rapidement le sang à travers la première diapositive.Lorsque le sang a complètement séché, fixer les diapositives dans 100% méthanol pendant au moins une minute. Tacher les échantillons fixes à Giemsa pendant 10 à 15 minutes, suivis d’un lavage à l’eau distillé simple ou double. Lorsque les diapositives ont séché, visualisez les échantillons sous un objectif 100X et l’immersion d’huile sur un microscope léger pour compter le nombre total d’érythrocytes infectés par grille.Deux à trois jours après l’infection, fixer une souris anesthésiée dans laquelle la parasitemia a atteint entre 0,1 à 1% dans la position supine et utiliser des forceps pour soulever la peau près de la base du sternum pour faciliter la création d’une incision cutanée. Séparez la peau à l’emplacement de l’incision pour exposer le diaphragme et le haut de la cavité abdominale et utilisez les forceps pour tenir la base de la cage thoracique tout en coupant à travers le diaphragme pour entrer dans la cavité thoracique. Épinglez la cage thoracique pour exposer le cœur et utilisez une seringue d’un millilitre contenant au moins 20 microlitres d’héparine et équipée d’une aiguille de calibre 26 pour percer doucement le tissu cardiaque.Rétractez lentement le piston pour recueillir environ un millilitre de sang et distribuer le sang dans un tube de microcentrifugeuse. Lorsque tout le sang a été récolté, réchauffez les souris receveurs sous une lampe à chaleur rouge et chargez une seringue à insuline munie d’une aiguille de calibre 27 par receveur avec la dose appropriée de parasite. Placez ensuite le premier receveur dans un restrainer et injectez une dose complète d’érythrocytes infectés dans une veine de la queue dilatée.Pour l’alimentation des moustiques, permettre aux moustiques anopheles stephensi ou A.gambiae femelles adultes de quatre à sept jours affamés pendant huit à 12 heures de se nourrir d’au moins 15 minutes sur des souris infectées anesthésiées ayant le taux d’exflagellation le plus élevé. Pour déterminer le nombre de sporozoites oocystes par moustique, euthanasiez de 20 à 30 moustiques dans le congélateur pendant au moins 10 minutes et utilisez une portée de dissection binoculaire et deux aiguilles de calibre 26 ou 27 pour disséquer les mi-espèces de moustiques sur une toboggan en verre contenant la solution de dissection appropriée. Pour disséquer le midgut, tenez d’abord la partie inférieure de l’abdomen en place avec une aiguille et poussez soigneusement le thorax très légèrement à la jonction entre l’abdomen et le thorax dans une direction ascendante jusqu’à ce qu’il sépare le thorax et qu’un midgut de couleur blanche soit exposé en balançant vers le bas du thorax.Maintenant, couper le midgut de l’extrémité de l’œsophage en utilisant la même aiguille qui a été utilisé pour pousser le thorax vers le haut, séparant ainsi et étalant le midgut. Soulevez le midgut disséqué du milieu de dissection à l’aide d’une aiguille et transférez-le dans un tube rempli de 200 microlitres de RPMI. Lorsque tous les midguts ont été disséqués et récoltés, placez le tube contenant les midguts dans la centrifugeuse pendant une minute à 700 fois g.Puis moudre les tissus récoltés avec un pilon deux fois. Transférer 12 microlitres de la solution tissulaire diluée sur un hemacytomètre et incuber l’hemacytomètre à température ambiante pendant cinq minutes pour permettre au contenu de se déposer. Déterminez ensuite le nombre moyen de sporozoites oocystes sur un microscope léger en contraste de phase et un grossissement de 40 X.Pour déterminer le nombre de sporozoites salivaires par moustique, au moment opportun après l’alimentation, congeler euthanasié 50 à 100 moustiques femelles comme démontré et utiliser un microscope disséquant et le côté d’une aiguille de calibre 26 ou 27 pour isoler les glandes salivaires. Pour disséquer les glandes salivaires, tenez d’abord le haut de l’abdomen ou le thorax en place avec le côté biseauté d’une aiguille et poussez soigneusement la tête très légèrement et très courte pousse à la jonction entre la tête et le thorax dans une direction ascendante. Poussez jusqu’à ce que la tête soit soigneusement séparée du thorax sans déchirer la glande salivaire vitride.Utilisez une pipette pasteur en verre court pour soulever la glande salivaire disséquée du milieu de dissection et placez-la dans un tube de 1,5 millilitre. Lorsque toutes les glandes salivaires ont été disséquées et récoltées, placez le tube contenant les glandes dans la centrifugeuse pendant une minute à 700 fois g. Moudre les tissus récoltés avec un pilon deux fois.Déterminez ensuite le nombre moyen de sporozoites salivaires de glande comme précédemment fait. Les parasites transgéniques de paludisme de reporter conçus pour exprimer EGFP sous le contrôle d’un promoteur fort et constitutif montrent le signal de fluorescence dans les étapes de sang, les ookinetes, les jeunes oocystes sur les midguts d’Anopheles stephensi, et dans les sporozoites isolées des glandes salivaires des femelles d’Anopheles stephensi. Les valeurs de pourcentage de parasitemia de cytométrie de flux correspondent directement aux pourcentages estimés de parasitemia obtenus en surveillant les frottis minces tachés de sang de Giemsa comme démontré confirmant la validité de cette dernière méthode de quantification.En outre, l’estimation des pourcentages de chacune des différentes étapes asexuelles et sexuelles dépend de l’évaluation morphologique des érythrocytes qui ne peuvent pas être évalués par cytométrie de flux. La comparaison des voies intraperitoneal contre intraveineuses de l’infection indique une diminution statistiquement significative du pourcentage de parasitemia de groupe infecté par IP comparé au pourcentage infecté iv de parasitemia de groupe pendant les quatre premiers jours de l’infection démontrant que la voie IV de l’infection est une voie plus quantitativement précise pour des essais avec les étapes de sang de parasite de paludisme. Il convient de noter que le traitement à la phényléhydrazine augmente considérablement le nombre de gametocytes, ce qui augmente le taux de formation masculine de gamete, ce qui augmente à son tour le taux de fécondation et le nombre de tous les stades ultérieurs des moustiques.Il existe une pénurie de méthodes normalisées pour l’analyse phénotypique des parasites du stade sanguin du paludisme chez les rongeurs et leur transmission au moustique vecteur. Ces méthodes aideront à fournir des protocoles normalisés et simplifiés pour l’étude de ces agents pathogènes et de leurs stades du cycle de vie.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

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Purification de population cellulaire spécifique par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

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Souris foie fœtal Système de culture à disséquer les fonctions du gène cible dans les stades précoces et tardifs de l&#39;aérogare de l&#39;érythropoïèse

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Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Développement d&#39;un système de virus de l&#39;hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

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Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...