Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
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アーメド・アリーは、トルコ開発省補助金2015BSV036のベズミアレム・ヴァキフ大学への資金提供、トゥレーン大学公衆衛生熱帯医学部からの資金提供、およびR21GrantのNIH-NIAIDからの資金提供によって支援されています。1R21AI111058-01A1。

ここに記載されているすべての動物実験は、トゥレーン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)とベズミアレム・ヴァキフ大学の動物倫理委員会の承認されたプロトコルに従って行われました。他のすべての実験プロトコルと組換えDNAの使用は、トゥレーン大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)の承認されたプロトコルに従って行われました。
1. 寄生虫分析と蚊感染?...

ヒトマラリア原虫のライフサイクルの一般的な生物学の類似性にもかかわらず、マウスマラリアモデルは、生体内モデルで信頼性の高い使用を制限するヒトプラスモジウム種と多くの相違点を持っています。例えば、ワクチンとしての生減衰寄生虫を除き、サブユニットとDNAおよび他のワクチンを用いたすべてのワクチン研究は、マウスモデルにおいて優れた結果を与えたが、?...

マラリア原虫は世界中のヒトで数億人のマラリア感染を引き起こし、毎年60万人以上が死亡しています。ヒト感染は、5つのマラリア原虫種、すなわちP.ファルシパラム、P.ビバックス、P.楕円形、P.マラリア、およびP.ノレシによって引き起こされる。ほとんどの臨床マラリアの死亡率は、サハラ以南のアフリカ1のP.ファルシパルムによって引き起こされる。サハラ以南のアフリカ以外で広範な世界的罹患率を引き起こすもう一つのヒトマラリア寄生虫種はP.vivax2である。他の3種は、すべて地理的に制限されており、致死性P.ノウレシ3を除いて、良性マラリア感染を引き起こす。感染症の生体内モデルにおける関連的で実用的な非ヒトの利用不能は、常に存在し、依然としてマラリアワクチンと薬剤開発の障害となっている。以前のマラリア薬の標的化と代謝研究は、P.ガリナセウムおよびP.lophuraeのような鳥のマラリアモデルに広く依存しており、それぞれ4.その後、げっ歯類のマラリア種は、生体内モデルのように様々なワクチンや薬物標的研究に徐々に導入された。長年にわたり、げっ歯類マラリアモデルとヒトマラリア種のライフサイクル段階の生物学と宿主寄生虫相互作用の類似性の証拠が蓄積されてきました。
特に、げっ歯類マラリアモデルは、蚊および前赤血球期5の生物学を探索し、特徴付けるために非常に重要であった。しかし、4つのげっ歯類マラリア種(P.ベルヘイ、P.ヨーエリ、P.シャバウディ、P.ヴィンケイ)が異なる生物学的特徴を有し、その中で最も顕著なのは血液段階6である。げっ歯類マラリア種は、P.チャバウディとP.ビンケイ株の血液段階がほとんど同期しているが、P.ベルゲヘイとP.ヨエリの血液段階は6ではない血液段階の同期性が異なる。,7.もう一つの顕著な違いは、いくつかの株で発生する血液段階の自己クリアランス(例えば、P.ヨーエリ17X-NL、P.ベルギーNK65、およびP.ヴィンケイレンタム)、他の血液感染である。 同じ種の株は、未処理のまま放置すると致死する可能性がある(P.ヨーエリ17X-L、P.ベルグヘイANKA、およびP.チャバウディAS)。また、P.ヨエリ17X-NL株およびP.ベルゲイANKA株は、Pのこれらの特徴であるが、網状細胞8、9、10、11を優先的に侵入する。ヨエリとP.ベルゲイ株は、厳格な成長要件12、13、14ではありません。したがって、マウスは、P.ベルグヘイANKA株およびP.ヨーエリのために蚊の感染に必要な寄生虫血症とゲームトサイト血症を増加させるために、それらの寄生虫の血液段階に感染する前にフェニルヒドラジンで治療される17X-NL15、16、17、18、19.
蚊の段階の発達の違いはまた、異なるげっ歯類マラリア種の間に存在し、最も顕著なのは、最適な蚊の段階の発達とスポロゾイテ長さ5、6に必要な温度と時間である、 20.げっ歯類マラリア種の前赤血球期段階では、感染性スポロゾイト接種の影響を最も受けやすいげっ歯類種と菌株、感受性の高いげっ歯類株の接種に必要なスポロゾイトの数、およびインビトロ肝期発達アッセイに必要な哺乳動物細胞型、および肝臓期発達を完了する時間 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
これらの変動にもかかわらず、げっ歯類マラリア寄生虫は、逆遺伝的アプローチの適用のために早い段階で有利なモデルであった。実際、げっ歯類マラリアモデルは最良のモデルであり、多くの場合、蚊や肝臓の段階で発現した遺伝子を機能的に特徴付けるために何年も利用できる唯一のモデルであった。
げっ歯類マラリアモデルにおける逆遺伝的アプローチの人気とアメニティに照らして、トランスジェニック寄生虫ライフサイクル段階、特に血液段階の現象型を分析するために、多くの異なる方法論が利用されている。ただし、これらの方法論の一部は矛盾しています。例えば、IP注射後の血液期寄生虫の感染を比較する(おそらく両腸リンパ節に排出され、そこから血流に入り込むことができる)。、クローンの蚊の伝染を異なる数の連続血液段階の伝達またはG数(ゲームトサイト形成32、33に影響を与える可能性がある)と比較するか、またはトランスジェニック寄生虫をナイーブ野生型(WT)に直接比較するエレクトロポレーションおよび陽性薬物選択および男性のガメテの駆除の様々な標準化されていない評価を受けたことがない寄生虫。したがって、げっ歯類マラリアの生物学的変動に対応するために、血液中および蚊内のトランスジェニックまたはWTげっ歯類マラリア寄生虫の表現型分析に従うのが簡単なプロトコルを標準化することが重要です。寄生虫種。
本明細書では、トランスジェニックまたは野生型P.ヨーエリおよびP.ベルゲイ寄生虫の血液および蚊のライフサイクル段階の表現型分析のための標準化された詳細な実験プロトコルについて報告する。これらのプロトコルは、P.チャバウディおよびP.ヴィンケイ寄生虫にも適用可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

近年の遺伝学・システム生物学技術の進歩により、マラリア原虫の生物学に対する理解が分子レベルで進められています。しかし、ワクチンや化学療法の開発に有効なマラリア原虫標的は依然として限られている。これは主に、ヒトプラスモジウム種の生体内感染モデルの関連性と実用的性の欠如によるもので、特にP.ファルシパラムおよびP.vivaxに対して特に。従って、げっ歯類マラリア種は、マラリアワクチン、薬物標的化、免疫応答、および保存されたプラスモジウムスップ遺伝子の機能特性特性研究の生体内モデルにおいて実用的な代替手段として広く使用されている。実際、げっ歯類のマラリアモデルは、特に蚊の伝染や肝臓期生物学の探索に非常に貴重であることが証明されており、免疫学的研究に欠かせない存在でした。しかし、トランスジェニックおよび野生型の無性および性的血液段階寄生虫の表現型を評価するために使用される方法には矛盾がある。これらの不一致の例は、血液段階寄生虫を伴うげっ歯類の静脈内感染と腹腔内感染の選択およびオスのガメテ外発性の評価である。ここでは、レポーター遺伝子または野生型げっ歯類マラリア原虫種を発現するトランスジェニック寄生虫における無性および性的血液段階の表現型を評価するための標準化された実験方法を詳細に説明する。また、アノフェレス蚊ベクター内のマラリア寄生虫の蚊の段階(ガメテス、オキネテス、卵胞、スポロゾイテス)の現象型を評価する方法についても詳しく述べる。これらの方法は、P.ベルゲヘイとP.ヨーエリの致死株と非致死株のためにここで詳細かつ簡素化されていますが、P.チャバウディとP.ヴィンケイげっ歯類マラリア種にいくつかの調整を適用することもできます。

マラリア原虫に逆遺伝的ツールと技術を適用する成功は、いくつかのプラスモジウム種39の特定のゲノムセグメントを追加、削除、または変更する能力を持つマラリア研究の分野に革命を起こしました。重要なことは、調剤可能なゲノム遺伝子座が同定され、二重相同組換えによってげっ歯類およびヒトマラリア寄生虫に蛍光タンパク質マー?...

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Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

げっ歯類マラリア原虫、ヒトマラリア原虫、げっ歯類マラリアモデルのライフサイクルと生物学の顕著な類似点により、マラリア研究には必須となっています。これらの標準的な方法は、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析を行う方法に関するマラリア研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。手順を実証することは、私の研究室の大学院生ゴズデ・デヴェチとイルクヌール・イルマズです。凍結保存された凍結寄生虫ストックを迅速に解凍し、すぐに26ゲージ針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、約200マイクロリットルの在庫を有する腹腔内に少なくとも2匹のドナーマウスを腹腔内に注入する。注射の24時間後、24または26ゲージ針を使用して、最初のマウスの尾部を刺し、顕微鏡スライド上の血滴を採取する。別のスライドの短い端を使用して、最初のスライドに素早く血液を塗りつぶします。血液が完全に乾燥したら、100%メタノールで少なくとも1分間スライドを固定する。10〜15分間ギムサで固定サンプルを染色し、その後、単一または二重蒸留水洗浄を行います。スライドが乾燥したら、1グリッドあたりの感染赤血球の総数を数える光顕微鏡上で100X目的と油浸漬下のサンプルを見る。感染の2~3日後、寄生虫症がsupine位置で0.1〜1%に達した麻酔マウスを固定し、皮膚切開の作成を容易にするために胸骨の基部付近の皮膚を持ち上げるために鉗子を使用する。切開部位で皮膚を引き離して腹腔の上部と横隔膜を露出させ、胸部の底部を切断しながら胸部の底部を保持するために鉗子を使用して胸腔に入ります。胸部をピンバックして心臓を露出させ、少なくとも20マイクロリットルのヘパリンを含む1ミリリットルの注射器を使用し、26ゲージ針を装備して心臓組織を穏やかに穿刺する。約1ミリリットルの血液を採取し、血液をマイクロ遠心分離チューブに分配するために、プランジャーをゆっくりと引き込む。すべての血液が採取されたら、赤いヒートランプの下でレシピエントマウスを温め、適切な用量の寄生虫を受け取る1人あたり27ゲージ針を装備した1つのインスリン注射器をロードする。その後、最初のレシピエントを抑制剤に入れ、感染した赤血球の1回の完全用量を拡張した尾静脈に注入する。蚊の餌付けのために、成人4〜7日齢の女性アノフェレス・ステナシまたはA.ガンビア蚊が8〜12時間飢えさせ、麻酔を受けた感染したマウスに少なくとも15分以上餌を与えることを許可する。蚊1匹当たりの黄卵胞子の数を決定するには、冷凍庫内の20〜30匹の蚊を10分以上安楽死させ、双眼解剖スコープと2つの26または27ゲージ針を使用して、適切な解剖液を含むガラススライド上の蚊の中腸を解剖する。中腸を解剖するには、まず1本の針で腹部の下部を所定の位置に保持し、胸郭を分離し、白い色のミッドガットが胸郭からぶら下がって露出するまで、腹部と胸郭の間の接合部で胸郭を慎重に軽く押します。今度は、胸郭を上方に押し上げるために使用したのと同じ針を使用して食道端から中腸を切り取り、ミッドガットを分離して広げます。解剖したミドグを針を使って解剖媒体から上げ、200マイクロリットルのRPMIで満たされたチューブに移します。すべての中腸が解剖され、収穫されたら、700倍gで1分間遠心分離機に中腸を含むチューブを置きます。その後、収穫した組織を害虫で2回粉砕します。希釈した組織溶液の12マイクロリットルをマシトメーターに移し、室温で5分間マカチメーターをインキュベートして内容物を落ち着かせる。次に、位相コントラストと40倍倍率の光顕微鏡上のオージスト胞子類の平均数を決定します。蚊当たりの唾液腺スポロゾアイトの数を決定するために、適切な時点でのポスト給餌で、示されているように50〜100匹の雌の蚊を凍結し、解剖顕微鏡と26または27ゲージ針の側面を使用して唾液腺を単離する。唾液腺を解剖するには、まず、1本の針のベベ面側で上部腹部または胸郭を所定の位置に保持し、頭と胸部の接合部で頭を非常に軽く、非常に短く押し上げます。頭がガラス張りの唾液腺を引き裂くことなく胸郭から慎重に分離されるまで押します。短いガラスパスツールピペットを使用して、解剖培地から解剖唾液腺を上げ、1.5ミリリットルのチューブに入れます。すべての唾液腺を解剖して収穫したら、700倍のgで1分間遠心分離機に腺を含むチューブを置きます。収穫した組織を害虫で2回粉砕する。次に、唾液腺スポロゾイトの平均数を以前に行ったように決定する。強力で構成的なプロモーターの制御下でEGFPを発現するように設計されたトランスジェニックレポーターマラリア原虫は、血液段階で蛍光シグナルを発現するように設計され、ookinetes、アノフェレス・ステファシ・ミダッツの若い卵巣嚢胞、およびアノフェレス・ステファニ女性の唾液腺から分離されたスポロゾイトで。フローサイトメトリー寄生虫血症パーセンテージ値は、後者の定量法の妥当性を確認する実証したように、ギームサ染色薄血汚れをモニタリングして得られた推定寄生虫血症率に直接対応する。さらに、異なる無性および性的段階の各々の割合の推定は、フローサイトメトリーでは評価できない赤血球の形態学的評価に依存する。感染の腹腔内経路と静脈内経路の比較は、感染の最初の4日間のIV感染群寄生虫症率と比較して、感染したIP感染群寄生虫血症率の統計的有意な減少を明らかにし、感染のIV経路がマラリア寄生虫血液段階のアッセイのためのより定量的に正確な経路であることを示している。注意すべきは、フェニルヒドラジン治療は、男性のホテ生成速度を増加させる食塩細胞の数を大幅に増加させ、その結果、受精率および後続のすべての蚊段階の数を増加させる。げっ歯類マラリア血液段階寄生虫の現象性分析と蚊ベクターへの伝染のための標準化された方法の不足があります。これらの方法は、これらの病原体とそのライフサイクル段階を研究するための標準化された単純化されたプロトコルを提供するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

げっ歯類のマラリア原虫の遺伝的交雑の生産のためのプロトコル

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

マウス胎児肝臓培養システムは、ターミナル赤血球の初期および後期段階での標的遺伝子の機能を分析する

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...