Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Ahmed ALY er støttet av midler til Bezmialem Vakif University fra den tyrkiske departementet for utvikling stipend 2015BSV036, og ved finansiering gitt av Tulane University School of Public Health og Tropical Medicine, og ved finansiering fra NIH-NIAID for R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Alle dyr eksperimenter beskrevet her ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Tulane University og dyrene etikk komiteen Bezmialem Vakif University. Alle andre eksperimentelle protokoller og bruk av rekombinant DNA ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle biosafety Committee (IBC) av Tulane University.
1. infeksjon av mus med blod-Stage parasitter for Parasitemia analyse og Mosquito infeksjon an...

Til tross for likheten i den generelle biologi av deres liv sykluser til at av menneskelig malariaparasitter, mus malaria modeller har også mange dissimilarities til menneskelige Plasmodium arter som ville begrense bruken som pålitelig in vivo -modeller. For eksempel, med unntak av Live-dempes parasitter som vaksiner, alle vaksine studier med delenhet og DNA og andre vaksiner ga gode resultater i muse modellen, men hos mennesker som bor i endemiske områder, resultatene var langt fra tilfredsstillende...

Malaria parasitter forårsake hundrevis av millioner av malaria infeksjoner hos mennesker over hele verden, med mer enn 600 000 dødsfall hvert år1. Menneskelige infeksjoner er forårsaket av fem malaria parasitt arter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, og p. knowlesi. De fleste kliniske malaria dødelighet er forårsaket av P. falciparum i Afrika sør for Sahara1. En annen menneskelig malaria parasitt arter som forårsaker omfattende verdensomspennende morbidities utenfor Afrika sør for Sahara er P. vivax2. De tre andre artene er mer geografisk begrenset og forårsake godartet malaria infeksjoner, bortsett fra den dødelige P. knowlesi3. Utilgjengelighet av relevante og praktiske ikke-menneskelige in vivo modeller av infeksjoner har alltid vært og er fortsatt et hinder for malaria vaksine og narkotika utvikling. Tidligere malaria narkotika målretting og metabolske studier har støttet seg mye på avian malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, infiserer kyllinger og ender, henholdsvis4. Deretter ble gnagere malaria arter gradvis innført i ulike vaksiner og narkotika målretting studier som in vivo-modeller. Gjennom årene, bevis på likheter av biologi og Host-parasitt interaksjoner av livssyklus stadier av gnager malaria modeller for menneskelig malaria arter har akkumulert.
Spesielt gnager malaria modeller var svært viktig å utforske og karakterisere biologi av mygg og pre-erythrocytisk etapper5. Men det er fire gnager malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei) som har ulike biologiske egenskaper, den mest bemerkelsesverdige av dem er i blodprøvene6. Gnagere malaria arter varierer i synkron av blod stadier, der blod stadier av p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkron, mens blodprøvene av p. berghei og p. yoelii er ikke6 , 7. en annen merkbar forskjell er selv-clearance av blod stadier som oppstår i enkelte stammer (f. eks, p. Yoelii 17X-nl, P. berghei NK65, og P. vinckei lentum), mens blod smitte av andre stammer av samme art kan være dødelig hvis venstre ubehandlet (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, og P. chabaudi AS). Dess, p. yoelii 17X-nl belastning og P. berghei ANKA stamme fortrinnsvis invadere retikulocytter8,9,10,11, selv om disse funksjonene i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vekst krav12,13,14. Derfor er mus behandlet med phenylhydrazine før en infeksjon med blod stadier av disse parasitter for å øke parasitemia og gametocytemia nødvendig for en mygg infeksjon for p. berghei ANKA belastning og for p. yoelii 17X-nl15,16, 17,18,19.
Forskjeller i mygg stadier utvikling finnes også blant ulike gnager malaria arter, den mest bemerkelsesverdige er temperaturen og tiden som kreves for optimal mygg stadier utvikling og sporozoite lengde5,6, og 20. I pre-erythrocytisk stadier av gnager malaria arter, forskjellene inkluderer gnagerarter og belastning som er mest utsatt for smittsomme sporozoite inoculation, antall sporozoitter nødvendig for inoculation i en utsatt gnager belastning, pattedyr celletyper som trengs for in vitro Liver stadium utvikling analyser, og tid til å fullføre leveren stadium utvikling5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Til tross for disse variabilitet, gnager malariaparasitter var de gunstige modellene tidlig for anvendelsen av omvendte genetiske tilnærminger, fordi de var mindre tid-og ressurskrevende med en høy sannsynlighet for å lykkes31. Faktisk gnager malaria modeller var de beste modellene, og i mange tilfeller de eneste modellene, tilgjengelig for mange år til funksjonelt karakterisere gener uttrykt i mygg og lever etapper.
I lys av populariteten og amenability av omvendte genetiske tilnærminger i gnagere malaria modeller, har en rekke ulike metoder blitt benyttet for å analysere fenotyper av transgene parasitten livssyklus stadier, spesielt blod stadier. Noen av disse metodene er imidlertid inkonsekvente. for eksempel, sammenligne infeksjoner av blod-scenen parasitter etter en IP-injeksjon (som er muligens drenert til bukhulen, og derfra kan gå inn i blodet; derfor er injisert parasitter ikke ende opp like i blodet) , sammenligner mygg overføring av kloner med et annet antall serie blod-scene overføringer eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naiv vill-type (WT) parasitter som aldri ble utsatt for electroporation og positivt legemiddel valg og de ulike unstandardized evalueringer av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Derfor er det avgjørende å standardisere protokoller som er enkle å følge for fenotypiske analyse av enhver type transgene eller WT gnager malariaparasitter i blodet og i myggen å imøtekomme for biologisk variabilitet av gnager malaria parasitten arter.
Heri, rapporterer vi om en standardisert, detaljert eksperimentell protokoll for fenotypiske analyse av blod og mygg livssyklus stadier av transgene eller vill-type P. yoelii og P. berghei parasitter. Disse protokollene gjelder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

Nylige fremskritt innen genetikk og systemer biologi teknologi har fremmet vår forståelse av biologi av malariaparasitter på molekylnivå. Imidlertid er effektiv malaria parasitt mål for vaksine og kjemoterapi utvikling fortsatt begrenset. Dette skyldes i stor grad utilgjengelighet av relevante og praktiske in vivo infeksjon modeller for menneskelig Plasmodium arter, særlig for p. falciparum og p. vivax. Derfor gnager malaria arter har blitt mye brukt som praktisk alternativ in vivo-modeller for malaria vaksine, narkotika målretting, immunrespons, og funksjonell karakterisering studier av bevarte Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnager malaria modeller har vist seg å være uvurderlig, spesielt for å utforske mygg overføring og lever scenen biologi, og var uunnværlig for immunologiske studier. Det er imidlertid avvik i metodene som brukes til å evaluere fenotyper av transgene og vill-type aseksuell og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse avvikene er valget av en intravenøs vs. intraperitoneal infeksjon av gnagere med blod-scene parasitter og evalueringen av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Heri, vi detalj standardiserte eksperimentelle metoder for å evaluere fenotyper av aseksuell og seksuelle blod stadier i transgene parasitter uttrykker reporter-genet eller vill-type gnager malaria parasitt arter. Vi har også detalj metodene for å evaluere fenotyper av malaria parasitten mygg stadier (kjønnscellene, ookinetes, oocyster, og sporozoitter) inni Anopheles Mosquito vektorer. Disse metodene er detaljert og forenklet her for dødelige og ikke-dødelige stammer av p. berghei og p. yoelii men kan også brukes med noen justeringer til p. chabaudi og p. vinckei gnager malaria arter.

Suksessen med å anvende omvendt genetiske verktøy og teknikker for å malariaparasitter har revolusjonert feltet av malaria forskning, med mulighet til å legge til, slette eller endre bestemte genomisk segmenter av flere Plasmodium arter39. Viktigere, unnværlig genomisk Loci har blitt identifisert og brukt med hell å innføre fluorescens protein markører i gnager og menneskelig malariaparasitter ved dobbel homologe rekombinasjon, for å sikre et stab...

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Fenotypiske analyse av gnager malaria parasitt aseksuell og seksuelle blodprøver og Mosquito stadier

På grunn av den slående likheter i livssyklusen og biologi av gnager malariaparasitter til menneskelig malariaparasitter, gnager malaria modeller har blitt uunnværlig for malaria forskning. Her standardiserte vi noen av de viktigste teknikkene som brukes i fenotypiske analyse av vill-type og transgene gnager malaria arter.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

På grunn av de slående likhetene i livssyklusen og biologien til gnager malariaparasitter, har de menneskelige malariaparasittene, gnagermalariamodeller blitt uunnværlige for malariaforskning. Disse standardmetodene kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen malariaforskningsfeltet om hvordan man utfører en fenotypisk analyse av villtype og transgene gnager malariaarter. Demonstrere prosedyrene vil være graduate studenter Gozde Deveci og Ilknur Yilmaz fra laboratoriet mitt.Begynn med raskt tining av kryo bevarte frosne parasittlagre og umiddelbart ved hjelp av en en en milliliter sprøyte utstyrt med en 26 gauge nål for å injisere minst to donormus per genotype intraperitonealt med ca. 200 mikroliter lager. Tjuefire timer etter injeksjonen, bruk en 24 eller 26 gauge nål for å stikke halen av den første musen og samle bloddråpen på et mikroskop lysbilde. Bruk kortsiden av et annet lysbilde for raskt å smøre blodet over det første lysbildet.Når blodet har tørket helt, fikse lysbildene i 100% metanol i minst ett minutt. Beis de faste prøvene i Giemsa i 10 til 15 minutter etterfulgt av en enkelt eller dobbel destillert vannvask. Når lysbildene har tørket, kan du se prøvene under et 100X-mål og oljenedsenking på et lett mikroskop for telling av det totale antallet infiserte erytrocytter per rutenett.To til tre dager etter infeksjonen, sikre en bedøvet mus der parasittemien har nådd mellom 0, 1 til 1% i liggende stilling og bruk tang for å løfte huden nær bunnen av brystbenet for å lette opprettelsen av et hudsnitt. Trekk huden fra hverandre på stedet av snittet for å eksponere membranen og toppen av bukhulen og bruk tangen til å holde bunnen av brystkassen mens du skjærer gjennom membranen for å komme inn i thoraxhulen. Pin tilbake brystkassen for å eksponere hjertet og bruke en en en milliliter sprøyte som inneholder minst 20 mikroliter heparin og utstyrt med en 26 gauge nål for å forsiktig punktere hjertevevet.Trekk stempelet langsomt tilbake for å samle omtrent en milliliter blod og dispensere blodet inn i et mikrocentrifugerør. Når alt blodet er høstet, varm mottakermusene under en rød varmelampe og last en insulinsprøyte utstyrt med en 27 gauge nål per mottaker med riktig dose parasitt. Plasser deretter den første mottakeren i et begrensningsmiddel og injiser en full dose infiserte erytrocytter i en utvidet halevene.For myggfôring, la voksen fire til syv-dagers gamle kvinnelige Anopheles stephensi eller A.gambiae mygg sultet i åtte til 12 timer for å mate mer minst 15 minutter på bedøvet infiserte mus med høyest eksflagellasjonshastighet. For å bestemme antall oocyst sporozoitter per mygg, euthanize 20 til 30 mygg i fryseren i ikke mindre enn 10 minutter og bruk en kikkert disseksjon omfang og to 26 eller 27 gauge nåler for å dissekere midguts av mygg på et glass lysbilde som inneholder riktig disseksjon løsning. For å dissekere midgut, hold først den nedre delen av magen på plass med en nål og skyv forsiktig thoraxen veldig lett i krysset mellom magen og thoraxen i oppoverretning til den skiller thoraxen og en hvit farget midgut blir utsatt dingler ned fra thoraxen.Klipp nå midgut fra spiserøret ved hjelp av samme nål som ble brukt til å skyve thoraxen oppover og dermed skille og spre ut midgut. Hev den dissekerte midguten fra disseksjonsmediet ved hjelp av en nål og overfør den til et rør fylt med 200 mikroliter RPMI. Når alle midguts har blitt dissekert og høstet, plasser røret som inneholder midguts i sentrifugen i ett minutt på 700 ganger g.Grind deretter det høstede vevet med en pestle to ganger. Overfør 12 mikroliter av den fortynnede vevsløsningen til et hemacytometer og inkuber hemacytometeret ved romtemperatur i fem minutter for å la innholdet bosette seg. Deretter bestemme gjennomsnittlig antall oocyst sporozoites på et lett mikroskop under fase kontrast og en 40X forstørrelse.For å bestemme antall spyttkjertelsporozoitter per mygg, fryser du eutaniserte 50 til 100 kvinnelige mygg på riktig tidspunkt for å isolere spyttkjertlene. For å dissekere spyttkjertlene, hold først overlivet eller thoraxen på plass med skråsiden av en nål og skyv forsiktig hodet veldig lett og svært korte trykk i krysset mellom hodet og thoraxen i oppoverretning. Skyv til hodet er forsiktig skilt fra thoraxen uten å rive opp den glassaktige spyttkjertelen.Bruk en kort pasteurpipette i glass for å heve den dissekerte spyttkjertelen fra disseksjonsmediet og plassere den i et 1,5 milliliter rør. Når alle spyttkjertler har blitt dissekert og høstet, plasser røret som inneholder kjertlene i sentrifugen i ett minutt på 700 ganger g. Grind det høstede vevet med en pestle to ganger.Deretter bestemme gjennomsnittlig antall spyttkjertelsporozoitter som tidligere gjort. Transgene reporter malaria parasitter konstruert for å uttrykke EGFP under kontroll av en sterk og konstitutiv promotor viser fluorescenssignalet i blodstadier, ookinetes, unge oocyster på Anopheles stephensi midguts, og i sporozoites isolert fra spyttkjertlene til Anopheles stephensi kvinner. Flow cytometri parasittemi prosentverdier tilsvarer direkte de estimerte parasittemi prosenter oppnådd ved å overvåke Giemsa farget tynne blodflekker som vist bekrefter gyldigheten av sistnevnte kvantifiseringsmetode.I tillegg avhenger estimering av prosentandelene av hver av de forskjellige aseksuelle og seksuelle stadiene av den morfologiske evalueringen av erytrocytter som ikke kan vurderes ved strømningscytometri. Sammenligning av intraperitoneal versus intravenøse infeksjonsruter avslører en statistisk signifikant reduksjon i IP-infisert gruppeparasittemiprosent sammenlignet med IV-infisert gruppeparasittemiprosent i løpet av de første fire dagene av infeksjon som viser at IV infeksjonsveien er en mer kvantitativt nøyaktig rute for analyser med malariaparasittblodstadier. Merk at fenylhydrazinbehandling øker antall gametocytter betydelig, noe som øker frekvensen av mannlig gameteformasjon som igjen øker befruktningshastigheten og antall alle påfølgende myggstadier.Det er en knapphet på standardiserte metoder for fenotypisk analyse av gnager malaria blodstadium parasitter og deres overføring til myggvektoren. Disse metodene vil bidra til å gi standardiserte og forenklede protokoller for å studere disse patogenene og deres livssyklusstadier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av Spleen: Kvantitativ analyse av Parasite Mobilitet og Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter virus for å kvantifisere Viral funksjon på alle stadier av Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Mus Fetal Liver Kultur System å dissekere Target genfunksjoner på tidlige og sene stadier av Terminal erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk og funksjonell analyse av Aktivert regulatoriske T-celler isolert fra kronisk lymfatisk choriomeningittvirus-infiserte mus

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...