Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Ахмед Али поддерживается финансированием Университета Безмиалема Вакифа из гранта Министерства развития Турции 2015BSV036, а также финансированием, предоставленным Школой общественного здравоохранения и тропической медицины Тулейнского университета, а также финансированием NIH-NIAID для R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Все описанные здесь эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Тулейнского университета и комитета по этике животных Университета Безмиалем аклиф. Все остальные экспериментальн...

Несмотря на сходство в общей биологии их жизненных циклов с моделями малярии человека, модели малярии мыши также имеют много разнородности к видам плазмодия человека, которые ограничили бы их использование в качестве надежных моделей in vivo. Например, за исключением живых пара?...

Малярийные паразиты вызывают сотни миллионов случаев инфицирования малярией среди людей вовсем мире, при этом ежегодно происходит более 600 000 случаев смерти. Инфекции человека вызваны пятью видами малярийных паразитов, а именно: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeи P. knowlesi. Большинство клинических случаев смерти от малярии вызваны P. falciparum в странах Африки к югу от Сахары1. Другой вид паразитов малярии человека, который вызывает обширные заболевания во всем мире за пределами Африки к югу от Сахары является P. vivax2. Остальные три вида все более географически ограничены и вызывают доброкачественные инфекции малярии, за исключением смертельных P. knowlesi3. Отсутствие соответствующих и практических нечеловеческих моделей инфекций всегда было и остается препятствием для разработки вакцины против малярии и разработки лекарственных средств. Ранее малярийных наркотиков ориентации и метаболических исследований широко опирались на модели птичьей малярии, как P. gallinaceum и P. lophurae, заражая кур и уток, соответственно4. После этого виды малярии грызунов постепенно внедрялись в различные вакцины и исследования по таргетированию лекарственных средств в качестве моделей in vivo. На протяжении многих лет, доказательства сходства биологии и принимающей паразитов взаимодействия жизненного цикла этапов моделей малярии грызунов с человеческими видами малярии накопились.
В частности, модели малярии грызунов были чрезвычайно важны для изучения и характеристики биологии комаров и доэритроцитных стадий5. Тем не менее, Есть четыре вида малярии грызунов(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, и P. vinckei), которые имеют различные биологические особенности, наиболее заметные из которых находятся в стадии крови6. Виды малярии грызунов отличаются синхронностью стадий крови, где стадии крови штаммов P. chabaudi и P. vinckei в основном синхронны, в то время как стадии крови P. berghei и P. yoelii не6 , 7. Еще одним заметным отличием является самоочистка стадий крови, которая происходит в некоторых штаммов (например, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, и P. vinckei lentum), в то время как инфекция крови других штаммы одного и того же вида могут быть смертельными, если не лечить(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, и P. chabaudi AS). Кроме того, P. yoelii 17X-NL штамм и P. berghei ANKA штамм преимущественно вторгнуться ретикулоцитов8,9,10,11, хотя эти особенности П. yoelii и P. berghei штаммы не являются строгим требованием роста12,13,14. Таким образом, мышей лечат фенилгидразином до заражения с стадиями крови этих паразитов для увеличения паразитмии и гаметоцитемии, необходимой для инфекции комаров для штамма P. berghei ANKA и для P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.
Различия в развитии комаров этапов также существуют среди различных видов малярии грызунов, наиболее заметными являются температура и время, необходимое для оптимального развития комаров этапов и sporozoite длина5,6, 20. В доэрроцитических стадиях видов малярии грызунов, различия включают грызунов видов и штаммов, которые наиболее восприимчивы к инфекционным прививка сопорозоита, количество sporozoites, необходимых для прививки в восприимчивый штамм грызунов, типы клеток млекопитающих, необходимые для анализа стадии развития печени in vitro, и время для завершения развития стадии печени5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Несмотря на эти изменчивости, грызуны малярии паразитов были благоприятными моделями на раннем этапе для применения обратных генетических подходов, потому что они были менее времени и ресурсоемких с высокой вероятностью успеха31. В самом деле, модели малярии грызунов были лучшими моделями, и во многих случаях только модели, доступные в течение многих лет, чтобы функционально охарактеризовать гены, выраженные в комаров и печени этапов.
В свете популярности и удобства обратных генетических подходов в моделях малярии грызунов, для анализа фенотипов трансгенного цикла жизни паразитов, особенно стадий крови, был использован ряд различных методологий. Однако некоторые из этих методологий несовместимы; например, сравнение инфекций паразитов на стадии крови после инъекции ИС (которые, возможно, осушаются в перитонеальные лимфатические узлы и, оттуда, могут попасть в кровоток; следовательно, инъекционные паразиты не попадают в равной степени в кровоток) , сравнение передачи комаров клонов с различным числом серийных передач крови стадии или G номер (который может повлиять на gametocytogenesis32,33), или сравнение трансгенных паразитов непосредственно наивный дикий тип (WT) паразитов, которые никогда не подвергались электропорации и положительного отбора наркотиков и различных нестандартизированных оценок мужского гамета exflagellation. Поэтому крайне важно стандартизировать протоколы, которые просто следовать для фенотипического анализа любого типа трансгенных или WT грызунов малярии паразитов в крови и в комаров для размещения для биологической изменчивости грызунов малярии видов паразитов.
При этом мы сообщаем о стандартизированном, детальном экспериментальном протоколе для фенотипического анализа стадий жизненного цикла крови и комаров трансгенных или диких паразитов P. yoelii и P. berghei. Эти протоколы также применимы к паразитам P. chabaudi и P. vinckei.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

Недавние достижения в области генетики и технологий системной биологии способствовали нашему пониманию биологии малярийных паразитов на молекулярном уровне. Однако эффективные цели малярийного паразита для вакцинации и развития химиотерапии по-прежнему ограничены. Это в значительной степени связано с отсутствием соответствующих и практических моделей инфекции in vivo для человека Plasmodium видов, в первую очередь для P. falciparum и P. vivax. Таким образом, виды малярии грызунов широко используются в качестве практической альтернативы in vivo моделям вакцины против малярии, таргетинга лекарств, иммунного ответа и функциональных исследований характеристик сохраненных Plasmodiumspp. Действительно, модели малярии грызунов оказались бесценными, особенно для изучения биологии передачи комаров и печеночной стадии, и были незаменимы для иммунологических исследований. Однако существуют расхождения в методах, используемых для оценки фенотипов трансгенных и диких асексуальных и сексуальных паразитов на стадии крови. Примерами таких расхождений являются выбор внутривенной против интраперитонеальной инфекции грызунов с паразитами на стадии крови и оценка мужского гаметного раздражения. В этом материале мы подробно описываем стандартизированные экспериментальные методы оценки фенотипов асексуальных и половых стадий крови у трансгенных паразитов, выражающих характер репортера-гена или диких видов малярийных паразитов типа. Мы также подробно методы оценки фенотипов малярийных паразитов комаров этапов (гаметы, ookinetes, ооцисты, и sporozoites) внутри Anopheles комаров переносчиков. Эти методы подробно и упрощены здесь для смертоносных и нелетальных штаммов P. berghei и P. yoelii, но также могут быть применены с некоторыми корректировками на P. chabaudi и P. vinckei грызунов видов малярии.

Успех применения обратных генетических инструментов и методов для малярии паразитов произвел революцию в области исследований малярии, с возможностью добавить, удалить или изменить конкретные геномные сегменты нескольких видов Plasmodium 39. Важно отме?...

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Фенотипический анализ грызунов малярии паразита асексуальных и сексуальной крови этапов и комаров этапов

Из-за поразительного сходства жизненного цикла и биологии малярийных паразитов грызунов с малярийными паразитами для человека модели малярии, модели малярии грызунов стали незаменимыми для исследований малярии. В этой области мы стандартизировали некоторые из наиболее важных методов, используемых в фенотипическом анализе видов малярии дикого типа и трансгенного грызунов.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Благодаря поразительному сходств жизненного цикла и биологии паразитов малярии грызунов, паразитов малярии человека, модели малярии грызунов стали незаменимыми для исследований малярии. Эти стандартные методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований малярии о том, как провести фенотипический анализ дикого типа и трансгенных видов малярии грызунов. Демонстрацией процедур будут аспиранты Гозде Девечи и Илькнур Ильмаз из моей лаборатории.Начните с быстрого оттаивания крио сохранились замороженные запасы паразитов и сразу же с помощью одного миллилитров шприца оснащен 26 калибровочных иглы для введения по крайней мере двух мышей-доноров на генотип интреперитонально с примерно 200 микролитров запасов. Двадцать четыре часа после инъекции, использовать 24 или 26 калибровочных иглы колоть хвост первой мыши и собирать капли крови на слайде микроскопа. Используйте короткий край другого слайда, чтобы быстро мазок крови через первый слайд.Когда кровь полностью высохла, исправить слайды в 100% метанол, по крайней мере одну минуту. Пятно фиксированных образцов в Giemsa в течение 10 до 15 минут, а затем один или двойной дистиллированной воды мыть. Когда слайды высохли, просмотрите образцы под целью 100X и погружение масла на световой микроскоп для подсчета общего числа инфицированных эритроцитов на сетку.Через два-три дня после заражения, обеспечить анестезированую мышь, в которой паразитмия достигла от 0,1 до 1% в положении на спине и использовать щипца, чтобы поднять кожу у основания грудины, чтобы облегчить создание разреза кожи. Потяните кожу друг от друга в месте разреза, чтобы разоблачить диафрагму и верхнюю часть брюшной полости и использовать типсы, чтобы удерживать основание грудной клетки при резке через диафрагму, чтобы войти в грудную полость. Прикрепите грудную клетку, чтобы разоблачить сердце и использовать один миллилитровый шприц, содержащий по крайней мере 20 микролитров гепарина и оснащенный иглой 26 калибра, чтобы мягко проколать сердечную ткань.Медленно втягивать поршень, чтобы собрать примерно один миллилитр крови и распределить кровь в микроцентрифуг трубки. Когда вся кровь была собрана, тепло получателя мышей под красной тепловой лампы и загрузить один инсулин шприц оснащен 27 калибровочных иглы на получателя с соответствующей дозой паразита. Затем поместите первого реципиента в устоятель и ввимите одну полную дозу инфицированных эритроцитов в расширенную хвостовую вену.Для кормления комарами, позвольте взрослым от четырех до семи дней самки Anopheles stephensi или A.gambiae комаров голодали в течение восьми до 12 часов, чтобы кормить больше по крайней мере 15 минут на анестезировал инфицированных мышей с самым высоким уровнем эксфлагеляции. Чтобы определить количество споозоитов на комара, усыпить от 20 до 30 комаров в морозильной камере в течение не менее 10 минут и использовать бинокль области вскрытия и два 26 или 27 калибровочных игл для вскрытия midguts комаров на стеклянной слайд, содержащий соответствующее решение вскрытия. Чтобы вскрыть мидгут, сначала удерживайте нижнюю часть живота на месте одной иглой и осторожно толкайте грудную клетку очень легко на стыке живота и грудной клетки в восходящем направлении, пока она не отделит грудную клетку и белый цветной мидгут подвергается свисающие вниз от грудной клетки.Теперь вырезать мидгут из пищевода конца с помощью той же иглы, которая была использована, чтобы подтолкнуть грудную клетку вверх, таким образом, отделяя и распространяя midgut. Поднимите расчлененный мидгут из среды вскрытия с помощью иглы и перенесите его в трубку, наполненную 200 микролитров RPMI. Когда все midguts были вскрыты и собраны, поместите трубку, содержащую midguts в центрифугу в течение одной минуты в 700 раз г.Затем измельчить собранные ткани с пестиком два раза. Перенесите 12 микролитров раствора разбавленной ткани на гемацитометр и инкубировать гемацитометр при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы содержимое улягораться. Затем определите среднее количество спорозоитов oocyst на световом микроскопе под фазовой контрастстью и увеличением на 40X.Чтобы определить количество слюнных желез sporozoites на комара, в нужное время точки после кормления, заморозить усыпленных 50 до 100 самок комаров, как попродемонстрировано, и использовать рассечение микроскопа и стороны 26 или 27 калибровочных игл для изоляции слюнных желез. Чтобы вскрыть слюнные железы, сначала удерживайте верхнюю часть живота или грудную клетку на месте с скошенной стороной одной иглы и осторожно толкайте голову очень легко и очень короткими толчками на стыке головы и грудной клетки в восходящем направлении. Нажмите, пока голова тщательно отделена от грудной клетки, не разрывая стеклянную слюнную железу.Используйте короткую стеклянную пипетку Pasteur, чтобы поднять вскрытую слюнную железу из среды вскрытия и поместить ее в 1,5 миллилитровую трубку. Когда все слюнные железы были вскрыты и собраны, поместите трубку, содержащую железы в центрифугу в течение одной минуты при 700 раз г. Измельчить собранные ткани с пестиком два раза.Затем определите среднее количество спорозоитов слюнной железы, как это было сделано ранее. Трансгенные репортер малярийных паразитов инженерии, чтобы выразить EGFP под контролем сильного и составного промоутера экспонат флуоресценции сигнала в стадиях крови, ookinetes, молодые oocysts на Anopheles stephensi midguts, и в sporozoites изолированы от слюнных желез Anopheles stephensi женщин. Процентные значения цитометрии цитометрии напрямую соответствуют расчетным процентам паразитами, полученным путем мониторинга окрашенных тонкокровных мазков Гимсы, что подтверждает действительность последнего метода количественной оценки.Кроме того, оценка процентной доли каждой из различных бесполых и половых стадий зависит от морфологической оценки эритроцитов, которые не могут быть оценены по цитометрии потока. Сравнение внутриперитонеальных и внутривенных маршрутов инфекции показывает статистически значимое снижение доли инфицированных ИС паразитов по сравнению с IV инфицированным групповым паразитом в течение первых четырех дней инфекции, демонстрируя, что IV маршрут инфекции является более количественно точным маршрутом для анализа стадий крови малярийного паразита. Следует отметить, что лечение фенилгидразином значительно увеличивает количество геготоцитов, что увеличивает скорость образования мужского гигота, что, в свою очередь, увеличивает скорость оплодотворения и количество всех последующих стадий комаров.Существует нехватка стандартизированных методов фенотипического анализа паразитов стадии развития малярии грызунов и их передачи переносчику комаров. Эти методы помогут обеспечить стандартизированные и упрощенные протоколы для изучения этих патогенов и этапов их жизненного цикла.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Мышь фетальной печени Культура Система рассекать гена-мишени Функции на ранних и поздних стадиях терминала эритропоэза

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Разработка системы Вирус Reporter гепатита B для мониторинга на ранних стадиях цикла репликации

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...