Name: phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Ahmed Aly stöds av finansiering till Bezmialem Vakif universitet från det turkiska ministeriet för utveckling Grant 2015BSV036, och genom finansiering från Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, och genom finansiering från NIH-NIAID för R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Alla djurförsök som beskrivs här genomfördes enligt de godkända protokollen från den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Tulane University och djur etikkommittén för Bezmialem Vakif University. Alla andra experimentella protokoll och användningen av rekombinant DNA utfördes enligt de godkända protokollen från den institutionella Biosäkerhetskommittén (IBC) vid Tulane University.
1. infektion av möss med blod-skede parasiter för Parasitemia analys och ...

Trots likheten i den allmänna biologin av deras livscykler till att mänskliga malariaparasiter, mus malaria modeller har också många olikheter till mänskliga Plasmodium arter som skulle begränsa deras användning som tillförlitlig in vivo modeller. Till exempel, med undantag för levande försvagade parasiter som vacciner, gav alla vaccin studier med subenhet och DNA och andra vacciner utmärkta resultat i musmodellen, men hos människor som lever i endemiska områden var resultaten långt ifrån...

Malariaparasiter orsaka hundratals miljoner malaria infektioner i människor över hela världen, med mer än 600 000 dödsfall varje år1. Mänskliga infektioner orsakas av fem malaria parasitarter, nämligen p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaeoch p. knowlesi. De flesta kliniska malaria mortalitet orsakas av P. falciparum i Afrika söder om Sahara1. En annan mänsklig malaria parasitarter som orsakar omfattande globala komorbiditeter utanför Afrika söder om Sahara är P. vivax2. De andra tre arterna är alla mer geografiskt begränsade och orsakar godartade malaria infektioner, utom den dödliga P. knowlesi3. Otillgängligheten av relevanta och praktiska icke-humana in vivo-modeller av infektioner har alltid varit och är fortfarande ett hinder för malariavaccin och läkemedelsutveckling. Tidigare malaria drog inriktning och metaboliska studier har åberopats i stor utsträckning på aviär malaria modeller som p. gallinaceum och p. lophurae, infekterar kycklingar och änder, respektive4. Därefter infördes gnagare malaria arter successivt i olika vacciner och drog inriktning studier som in vivo-modeller. Under årens lopp har bevis för likheter av biologi och värd-parasit interaktioner av livscykelstadier av gnagare malaria modeller till mänskliga malaria arter ackumuleras.
I synnerhet, gnagare malaria modeller var oerhört viktigt att utforska och karakterisera biologi av mygga och pre-erytrocytiska stadier5. Det finns dock fyra gnagare malaria arter (p.berghei, p. yoelii, p. chabaudi, och p. vinckei) som har olika biologiska egenskaper, den mest anmärkningsvärda av dessa är i blodet stadier6. Gnagare malaria arter skiljer sig i Synchronicity av blod stadier, där blod stadier av p. chabaudi och p. vinckei stammar är mestadels synkrona, medan blod stadierna av p. berghei och p. yoelii är inte6 , 7. en annan anmärkningsvärd skillnad är själv klarering av blod stadier som förekommer i vissa stammar(t. ex., p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65, och p. vinckei lentum), medan blod infektionen av andra stammar av samma art kan vara dödliga om de lämnas obehandlade (p. yoelii 17x-L, p. berghei anka, och P. chabaudi as). Dessutom, p. yoelii 17x-nl stam och p. berghei anka stam företrädesvis invadera retikulocyter8,9,10,11, även om dessa funktioner i p. yoelii och P. berghei stammar är inte en strikt tillväxt krav12,13,14. Därför, möss behandlas med Fenylhydrazin före en infektion med blod stadier av dessa parasiter för att öka parasitemia och gametocytemia behövs för en mygga infektion för p. berghei anka stam och för p. yoelii 17x-nl15,16,17,18,19.
Skillnader i Mosquito stadier utveckling finns också bland olika gnagare malaria arter, den mest anmärkningsvärda är den temperatur och tid som krävs för optimal Mosquito stadier utveckling och sporozoite längd5,6, 20. I pre-erytrocytiska stadier av gnagare malaria arter, skillnader inkluderar gnagare arter och stam som är mest mottagliga för infektiös sporozoit Inympning, antalet sporozoiter som behövs för inympning i en mottaglig gnagare stam, däggdjursceller som behövs för in vitro-utvecklingstester för lever stadiet, och tiden för att slutföra utvecklingen av lever stadiet5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Trots dessa variabilities var gnagare malariaparasiter gynnsamma modeller tidigt för tillämpningen av omvänd genetiska metoder, eftersom de var mindre tid-och resurskrävande med en hög sannolikhet för framgång31. I själva verket, gnagare malaria modeller var de bästa modellerna, och i många fall de enda modellerna, tillgängliga för många år att funktionellt karakterisera gener uttrycks i mygga och lever stadier.
Mot bakgrund av populariteten och möjligheten att omvända genetiska metoder i gnagare malaria modeller, har ett antal olika metoder utnyttjats för att analysera fenotyper av transgena parasiter livscykelstadier, särskilt blod stadier. Vissa av dessa metoder är dock inkonsekvent. till exempel, jämföra infektioner i blod-skede parasiter efter en IP-injektion (som möjligen dräneras till peritoneala lymfkörtlar och, därifrån, kan komma in i blodomloppet; därför, de injicerade parasiter inte hamna lika i blodet) , jämföra mygga överföring av kloner med olika antal seriella blod-steg överföringar eller G-nummer (som kan påverka gametocytogenesis32,33), eller jämföra transgena parasiter direkt till naiva vildtyp (WT) parasiter som aldrig utsattes för elektroporation och positivt val av läkemedel och de olika ostandardiserade utvärderingar av manliga könscell exflagellation. Därför är det viktigt att standardisera protokoll som är enkla att följa för fenotypisk analys av någon typ av transgena eller WT gnagare malariaparasiter i blodet och i mygga för att tillgodose de biologiska variabiliteterna av gnagare malaria parasitarter.
Häri, Vi rapporterar om ett standardiserat, detaljerat experimentprotokoll för fenotypisk analys av blod och myggor livscykelstadier av transgena eller vildtyp p. yoelii och p. berghei parasiter. Dessa protokoll är också tillämpliga på p. chabaudi och p. vinckei parasiter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:735px;" width="735">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Heparin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">375095-100KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Xanthurenic acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D120804-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hypoxanthine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Alsever&#39;s solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3551-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylhydrazine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P26252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Giemsa</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">GS1L-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">26G x 3/8 Precision Glide Needle,&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1 ml TB Syringe, 26G x 3/8</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">1 cc Insulin Syringe, U-100 27G</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">329412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Isoflurane, USB</td>
			<td style="width:143px;">Piramal</td>
			<td style="width:119px;">2667- 46- 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>22400105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Pencillin/ Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Fiber Glass Wool</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic analysis of rodent malaria parasite asexual and sexual blood stages and mosquito stages

Senaste framstegen inom genetik och systembiologi teknik har främjat vår förståelse av biologi malariaparasiter på molekylär nivå. Emellertid, effektiva malariaparasiten mål för vaccin och kemoterapi utveckling är fortfarande begränsade. Detta beror till stor del på otillgängligheten av relevanta och praktiska in vivo -infektionsmodeller för humana plasmodiumarter , framför allt för p. falciparum och p. vivax. Därför har gnagare malaria arter använts i stor utsträckning som praktiskt alternativ in vivo modeller för malariavaccin, drog inriktning, immunsvar, och funktionella karakteriseringsstudier av bevarade Plasmodiumspp. gener. Faktum är att gnagare malaria modeller har visat sig vara ovärderliga, särskilt för att utforska myggnät och lever scen biologi, och var oumbärliga för immunologiska studier. Det finns dock avvikelser i de metoder som används för att utvärdera fenotyper av transgena och vildtyp asexuella och sexuella blod-scenen parasiter. Exempel på dessa avvikelser är valet av en intravenös kontra intraperitoneal infektion av gnagare med blod-Stadium parasiter och utvärderingen av manliga könscell exflagellation. Häri, vi detalj standardiserade experimentella metoder för att utvärdera fenotyper av asexuella och sexuella blod stadier i transgena parasiter som uttrycker reporter-gen eller vild-typ gnagare malaria parasitarter. Vi detalj också metoder för att utvärdera fenotyper av malaria parasit mygga stadier (könsceller, ookinetes, oocyster, och sporozoiter) inuti Anopheles mygga vektorer. Dessa metoder är detaljerade och förenklade här för dödliga och icke-dödliga stammar av p. berghei och p. yoelii men kan också tillämpas med vissa justeringar av p. chabaudi och p. vinckei gnagare malaria arter.

Framgången med att tillämpa omvänd genetiska verktyg och tekniker för att malariaparasiter har revolutionerat området malaria forskning, med möjlighet att lägga till, ta bort eller ändra specifika genomisk segment av flera Plasmodium arter39. Viktigt, dispensable genomisk loci har identifierats och används framgångsrikt för att införa fluorescens protein markörer i gnagare och mänskliga malariaparasiter genom dubbel homolog rekombination, fö...

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages at JoVE.com

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Fenotypisk analys av gnagare malaria parasit asexuella och sexuella blod stadier och Myggstadier

På grund av de slående likheter av livscykeln och biologi av gnagare malariaparasiter till mänskliga malariaparasiter, gnagare malaria modeller har blivit oumbärlig för malaria forskning. Häri, standardiserade vi några av de viktigaste teknikerna som används i fenotypisk analys av vildtyp och transgena gnagare malaria arter.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

På grund av de slående likheterna i livscykeln och biologin hos gnagare malariaparasiter, har de mänskliga malariaparasiterna, gnagare malariamodeller blivit oumbärliga för malariaforskning. Dessa standardmetoder kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom malariaforskningsområdet om hur man utför en fenotypisk analys av vildtyp och transgena gnagar malariaarter. Demonstrera de förfaranden som kommer att doktorander Gozde Deveci och Ilknur Yilmaz från mitt laboratorium.Börja med att snabbt tina cryo bevarade frysta parasitbestånd och omedelbart med hjälp av en milliliter spruta utrustad med en 26 gauge nål för att injicera minst två givare möss per genotyp intraperitoneally med cirka 200 mikroliter lager. Tjugofyra timmar efter injektionen, använd en 24 eller 26 gauge nål för att sticka svansen på den första musen och samla bloddroppar på ett mikroskop bild. Använd kortsidan på en annan bild för att snabbt smeta ut blodet över den första bilden.När blodet har torkat helt, fixera objektglasen i 100%metanol i minst en minut. Fläcka de fasta proverna i Giemsa i 10 till 15 minuter följt av en enkel eller dubbel destillerad vattentvätt. När objektglasen har torkat, visa proverna under en 100X mål och olja nedsänkning på ett ljus mikroskop för räkning av det totala antalet infekterade erytrocyter per rutnät.Två till tre dagar efter infektionen, säkra en sövd mus där parasitemia har nått mellan 0,1 till 1%i ryggläge och använda forceps för att lyfta huden nära basen av bröstbenet för att underlätta skapandet av ett hudanser. Dra isär huden vid anskärningens ställe för att exponera membranet och bukhålans topp och använd tövärorna för att hålla i ribcagebasen samtidigt som man skär genom membranet för att komma in i brösthålan. Nåla tillbaka bröstkorgen för att exponera hjärtat och använd en milliliterspruta innehållande minst 20 mikroliter heparin och utrustad med en 26 gauge nål för att försiktigt punktera hjärtvävnaden.Dra långsamt tillbaka kolven för att samla in ungefär en milliliter blod och dosera blodet i ett mikrocentrifugrör. När allt blod har skördats, värm mottagarmössen under en röd värmelampa och ladda en insulinspruta utrustad med en 27 gauge nål per mottagare med lämplig dos av parasit. Placera sedan den första mottagaren i en fasthållande och injicera en full dos av infekterade erytrocyter i en dilaterad svans ven.För myggmatning, tillåt vuxna fyra till sju dagar gamla kvinnliga Anopheles stephensi eller A.gambiae myggor svalt i åtta till 12 timmar för att mata mer minst 15 minuter på sövda infekterade möss med högsta exflagellation hastighet. För att bestämma antalet oocyst sporozoiter per mygga, avliva 20 till 30 myggor i frysen i inte mindre än 10 minuter och använd en binokulär dissektion omfattning och två 26 eller 27 gauge nålar att dissekera midguts av myggor på ett glas bild som innehåller lämplig dissektion lösning. För att dissekera midgut, håll först den nedre delen av buken på plats med en nål och tryck försiktigt bröstkorgen mycket lätt i korsningen mellan buken och bröstkorgen i en uppåtgående riktning tills den separerar bröstkorgen och en vit färgad midgut exponeras dinglande ner från bröstkorgen.Nu skär midgut från matstrupen slutet med hjälp av samma nål som användes för att driva bröstkorgen uppåt vilket separerar och sprider ut midgut. Höj dissekerade midgut från dissekeringsmediet med hjälp av en nål och överför den till ett rör fyllt med 200 mikroliter av RPMI. När alla midguts har dissekeras och skördas, placera röret som innehåller midguts i centrifugen i en minut på 700 gånger g.Slipa sedan de skördade vävnaderna med en mortelstöt två gånger. Överför 12 mikroliter av den utspädda vävnadslösningen till en hemacytometer och inkubera hemacytometern i rumstemperatur i fem minuter för att låta innehållet sätta sig. Sedan bestämma det genomsnittliga antalet oocyst sporozoiter på ett ljus mikroskop under faskontrast och en 40X förstoring.För att bestämma antalet spottkörtel sporozoiter per mygga, vid lämplig tidpunkt efter utfodring, frysa avlivas 50 till 100 kvinnliga myggor som visats och använda en dissekera mikroskop och sidan av en 26 eller 27 mätare nål för att isolera spottkörtlarna. För att dissekera spottkörtlar, håll först övre delen av buken eller bröstkorgen på plats med den avfasade sidan av en nål och tryck försiktigt huvudet mycket lätt och mycket korta skjuter i korsningen mellan huvudet och bröstkorgen i en uppåtgående riktning. Tryck tills huvudet är noggrant separerat från bröstkorgen utan att riva upp den glasiga spottkörteln.Använd ett kort glas Pasteur pipetten för att höja dissekerade spottkörteln från dissekeringsmediet och placera den i en 1,5 milliliter tub. När alla spottkörtlar har dissekeras och skördas, placera röret som innehåller körtlarna i centrifugen i en minut vid 700 gånger g. Mala de skördade vävnaderna med en mortelstöt två gånger.Sedan bestämma det genomsnittliga antalet spottkörtrickorzoiter som tidigare gjort. Transgena reporter malaria parasiter konstruerad för att uttrycka EGFP under kontroll av en stark och konstituerande promotor uppvisar fluorescens signalen i blod stadier, ookinetes, unga oocysts på Anopheles stephensi midguts, och i sporozoites isolerade från de salivary körtlar av Anopheles stephensi honor. Flow cytometry parasitemia procentvärden motsvarar direkt de uppskattade parasitemia procentsatser som erhållits genom övervakning Giemsa färgas tunna blod utstryk som visat bekräftar giltigheten av den senare kvantifieringsmetoden.Dessutom beror uppskattning av procentandelarna för var och en av de olika asexuella och sexuella stadierna på den morfologiska utvärderingen av erytrocyterna som inte kan bedömas genom flödescytometri. Jämförelse av de intraperitoneal kontra intravenösa infektionsvägarna avslöjar en statistiskt signifikant minskning av ip-infekterade gruppen parasitemia procent jämfört med iv infekterade gruppen parasitemia procent under de första fyra dagarna av infektion visar att IV smittvägen är en mer kvantitativt exakt väg för analyser med de malaria parasit blod stadier. Notera, fenylhydrazin behandling ökar signifikant antalet gametocyter vilket ökar hastigheten av manliga gamete formation som i sin tur ökar befruktningshastigheten och antalet av alla efterföljande mygga stadier.Det finns en brist på standardiserade metoder för den fenotypiska analysen av gnagare malaria blodstads parasiter och deras överföring till myggvektorn. Dessa metoder kommer att bidra till att ge standardiserade och förenklade protokoll för att studera dessa patogener och deras livscykelstadium.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll för produktion av en genetisk kors av parasiterna Gnagare Malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Vaccinia Reporter Virus för kvantifiering Viral funktion i alla skeden av genuttryck

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Musfosterlever Culture System att dissekera målgen funktioner på tidiga och sena stadier av Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Fenotypisk och funktionell analys av aktiverade regulatoriska T-celler isolerade från kronisk lymfatisk koriomeningitvirus-infekterade möss

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...