Name: analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fondi di avvio, BB).

1. Preparazione delle soluzioni <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni fresche per ogni esperimento. <ol><li> Per la soluzione di fissazione , preparare la formaldeide al 37% e conservarla a RT. Diluire in 1x salina fosfata-bufferizzata (PBS) ad una concentrazione finale di 1,42%. ATTENZIONE: La formaldeide è classificata come irritante, corrosiva, mutagena, teratogena e cancerogena. Non ingerire. Non respirare gas / fumo / vapore / spray. In caso di ventilazione insufficien...

<ol>
	<li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+DNase+footprint+titration:+a+method+for+studying+protein-DNA+interactions.">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. 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G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites,+differential+gene+regulation+mechanism,+epigenetic+marks+and+beyond.">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li><li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation.">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li><li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol:chloroform.">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene.">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA:+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling.">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li><li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+(signal+transducers+and+activators+of+transcription)+DNA+binding+and+transcriptional+activity.">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li><li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+method.">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li><li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions.">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li><li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+native+chromatin:+NChIP.">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li><li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease.">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li><li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data.">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754 (2010).</li></ol>

In questo rapporto dimostriamo il legame di SMAD2 indotto da TGF-β1 a un SBE all&#39;interno del promotore di ligandi del c-KIT e del legame di STAT3 indotto da TGF-β1 alla sua sequenza di riconoscimento all&#39;interno del gene ligand TGF-β1. Abbiamo dimostrato la legame di entrambi i fattori di trascrizione con citocina indotta da immunoprecipitazione cromatina. L&#39;immunoprecipitazione di cromatina è un potente strumento per dimostrare il legame diretto di una proteina di interesse ...

Nel nucleo degli eucarioti, il DNA interagisce con proteine ​​dell&#39;istone e proteine ​​non-istone ed è condensato in cromatina. Nel contesto fisiologico, patofisiologico e biologico delle cellule, le funzioni cellulari sono controllate spazialmente e temporaneamente dall&#39;espressione genica coordinata con cromatina. Le interazioni tra proteine ​​del DNA hanno un ruolo essenziale nella regolazione dei processi cellulari, come la replicazione del DNA, la ricombinazione e la riparazione, così come l&#39;espressione di proteine. Pertanto, l&#39;analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è uno strumento indispensabile nella valutazione dell&#39;espressione genica e della funzione cellulare. Esistono diverse tecniche per valutare le interazioni proteiche del DNA in vitro , come l&#39;EMPE (Electrophoresis (Gel)) e DNase I footprinting 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche non analizzano l&#39;interazione proteina-DNA all&#39;interno del contesto cromatina e cellulare. ChIP iTecnica che cattura le proteine ​​legate ai loro specifici siti di legame del DNA e quindi facilita l&#39;identificazione delle interazioni tra proteine ​​del DNA all&#39;interno del contesto cromatico. La tecnica è stata originariamente sviluppata da Gimour e Lis per la valutazione della RNA polimerasi II legata a geni specifici in Escherichia coli e Drosophila melanogaster 3 , 4 . Viene effettuata mediante la fissazione dei complessi proteici del DNA, seguita dall&#39;estrazione di cromatina e tagliando il DNA in frammenti di 200 paia di base (bp). Successivamente, la proteina di interesse legata al DNA viene isolata mediante immunoprecipitazione. Dopo l&#39;inversione del DNA-protein crosslink, il DNA viene purificato e analizzato. Diversi metodi possono essere utilizzati per l&#39;analisi dei siti di legame delle proteine ​​e dipendono dalla sequenza di acido nucleico del sito di legame della proteina all&#39;interno del gene bersaglio 5 . Nei casi in cui è nota la sequenza del DNA, standard PolPossono essere applicate reazioni a catena ymerase (PCR), utilizzando coppie di primer specifiche che fiancheggiano il noto sito di legame. È possibile utilizzare anche il PCR quantitativo in tempo reale (qRT-PCR) 6 . Nei casi in cui la sequenza è sconosciuta, ChIP può essere combinato con microarray di DNA (ChIP-on-chip), sequenza di DNA (ChIP-seq) o tecniche di clonazione 7 , 8 , 9 . Il percorso TGF-β ha potenti funzioni di soppressione del tumore ed è un percorso chiave nella differenziazione cellulare. Viene attivato attraverso il legame del legante TGF-β1 al suo complesso recettore cognato, con conseguente fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3. Dopo la loro associazione con il mediatore comune, SMAD4, il complesso SMAD trasloca al nucleo e si lega all&#39;SBE all&#39;interno della regione promotore dei geni bersaglio, dove regola i geni che controllano il ciclo cellulare, l&#39;apoptosi e le cellule differenziatesopra. La risposta trascrizionale alla stimolazione TGF-β è tipologia di cellule e contesto-specifico 10 . Recentemente abbiamo descritto un ciclo di feedback positivo tra TGF-β e il percorso c-KIT 11 . In questo modello, SMAD2 attivato da TGF-β1 si lega al promotore di ligandi del c-KIT e induce la sua espressione e secrezione. Successivamente, il ligando c-KIT attiva il recettore c-KIT in modo auto- e para-crinico. L&#39;attivazione del recettore del c-KIT determina la presenza di STAT3 Tyr 705- fosforilazione tramite JAK1 / 2. A seguito dell&#39;attivazione STAT3 e della traslocazione nucleare, STAT3 si lega al gene ligand TGF-β1 e regola la sua espressione. Qui dimostriamo il ruolo essenziale dell&#39;analisi ChIP per l&#39;identificazione della legame SMAD2 al promotore del ligando del recettore c-KIT e per l&#39;identificazione del trasduttore del segnale (e) attivatore (di) della trascrizione 3 (legame STAT3 al TGF-β1- gene).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="907">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">HepG2 cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Hep3B cells</td>
			<td style="width:193px;">ATCC</td>
			<td>HB-8064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">TGF-&#946;1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>101-B1</td>
			<td>Used at a concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-SMAD2 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">5339</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Anti-STAT3 antibody</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">4904</td>
			<td>Amount used per IP: 3 &#181;g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">53033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:193px;">Active Motif</td>
			<td style="width:119px;">37490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Micrococcal Nuclease</td>
			<td style="width:193px;">Cell Signalling Technology</td>
			<td style="width:119px;">10011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: PAI-1</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR forward primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">PCR reverse primer: SCF</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-1)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR forward primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">PCR reverse primer: TGF-&#946;1 (STB-2)</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence: 5&#8217;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&#8217;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

Molti processi cellulari, compresa la replicazione e la riparazione del DNA, la ricombinazione del DNA e l&#39;espressione genica, richiedono interazioni tra proteine ​​e DNA. Pertanto, le interazioni proteine ​​del DNA regolano molteplici funzioni fisiologiche, patofisiologiche e biologiche, come la differenziazione cellulare, la proliferazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la stabilità del cromosoma, la regolazione epigenetica dei geni e la trasformazione cellulare. Nelle cellule eucariotiche, il DNA interagisce con proteine ​​istone e non-istone e viene condensato in cromatina. Diversi strumenti tecnici possono essere utilizzati per analizzare le interazioni tra proteine ​​del DNA, come l&#39;EMSS (Electrophoresis (Gel)) e DNase I (footprinting). Tuttavia, queste tecniche analizzano l&#39;interazione proteina-DNA in vitro , non all&#39;interno del contesto cellulare. L&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è una tecnica che cattura le proteine ​​nei loro siti specifici di legame del DNA, consentendo così l&#39;identificazione dell&#39;interazione tra proteine ​​del DNAAll&#39;interno del loro contesto cromatico. Viene fatta con la fissazione dell&#39;interazione tra proteine ​​del DNA, seguita da immunoprecipitazione della proteina di interesse. Successivamente, si caratterizza il sito genomico cui è legata la proteina. Qui descriviamo e discutiamo il ChIP e dimostriamo il suo valore analitico per l&#39;identificazione del legame di trasformazione Factor-β (TGF-β) del fattore di trascrizione SMAD2 a SMAD Binding Elements (SBE) all&#39;interno della regione promotore della tirosina- Proteina chinasi Kit (c-KIT) del recettore del fattore cellule staminali (SCF).

Il legame del TGF-β1 ligando al suo complesso recettore cognato determina la fosforilazione della serina dei fattori di trascrizione SMAD2 / 3, seguita dalla loro associazione con il mediatore comune, SMAD4. Il complesso SMAD trasloca al nucleo. TGF-β può regolare la trascrizione genica, direttamente tramite SMAD, legame a SBE all&#39;interno di regioni di regolazione dei geni bersaglio, oppure indirettamente attraverso l&#39;espressione regolata da SMAD di attivatori o repressori tra...

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Le interazioni tra proteine ​​del DNA sono essenziali per processi biologici multipli. Durante la valutazione delle funzioni cellulari, l&#39;analisi delle interazioni tra proteine ​​del DNA è indispensabile per comprendere la regolazione del gene. L&#39;immunoprecipitazione cromatina (ChIP) è un potente strumento per analizzare in vivo tali interazioni .

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

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