Name: rewiring neuronal circuits: a new method for fast neurite extension and functional neuronal connection
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Yoichi Miyahara per molte discussioni e approfondimenti utili. MA e PG riconoscono il finanziamento da NSERC.

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate dalla McGill University Animal Care Committee e sono conformi alle linee guida del Consiglio canadese di Animal Care. 1. Standardizzazione delle culture neuronali usando dispositivi microfluidici: Assemblaggio di apparecchiature <ol><li> Selezionare un dispositivo microfluidico adatto per l&#39;esperimento desiderato. Per collegare i neuroni all&#39;interno della stessa popolazione, utilizzare i Neuro Devices ( <strong class="xfi...

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).</li><li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+made+by+axons+regenerating+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals.">Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals.</a> J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).</li><li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li><li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+mechanically+controlled+rewiring+of+neuronal+circuits.">Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits.</a> J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).</li><li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+of+functional+presynaptic+boutons+triggered+by+adhesive+contacts.">Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts.</a> J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li><li>Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+presynaptic+protein+recruitment+induced+by+local+presentation+of+artificial+adhesive+contacts.">Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts.</a> Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).</li><li>General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood">https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood</a> (2016)</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+growth.">Monitoring cell growth.</a> Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+outgrowth+of+cultured+neurons+is+not+limited+by+growth+cone+competition.">Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition.</a> J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).</li><li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sketch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals.">Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li><li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+reveals+important+differences+in+axonal+resistance+to+injury.">Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury.</a> Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).</li><li>Polleux, F., Snider, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+and+growing+an+axon.">Initiating and growing an axon.</a> CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).</li><li>Debanne, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired-recordings+from+synaptically+coupled+corticol+and+hippocampal+neurons+in+acute+and+cultured+brain+slices.">Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices.</a> Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).</li><li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+Morphological+Characterization+of+Neuronal+Microcircuits+in+Acute+Brain+Slices+Using+Paired+Patch-Clamp+Recordings.">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+and+development+of+the+nervous+system+studied+by+the+methods+of+experimental+embryology.">On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+patterns:+the+mechanics+of+nerve+growth.">Nerve patterns: the mechanics of nerve growth.</a> Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).</li><li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neural+growth:+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler.">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).</li><li>Heidemann, S. R., Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension-driven+axon+assembly:+a+possible+mechanism.">Tension-driven axon assembly: a possible mechanism.</a> Front. Cell Neurosci. 9, (2015).</li><li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+tension.">Axonal growth in response to experimentally applied tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li><li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development.">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li><li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytomechanics+of+axonal+development.">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).</li><li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons.">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).</li><li>Waxman, S. G., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The axon: structure, function and pathophysiology. , (1995).</li><li>Cho, E. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+regrowth+of+damaged+retinal+ganglion+cell+axons+regenerating+in+a+peripheral+nerve+graft+in+adult+hamsters.">Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters.</a> Brain Res. 419, 369-374 (1987).</li><li>Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+the+growth+rate+of+early+nerve+fibres+related+to+target+distance.">Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance.</a> Nature. 337, 553-555 (1989).</li></ol>

Grazie alla micromanipolazione standard e ai dispositivi innovativi microfluidici, è stata sviluppata una nuova tecnica per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a grandi distanze. La micromanipolazione della pipetta è uno strumento comune nella maggior parte dei laboratori neuroscienze 4 , 13 . La vera sfida per ottenere risultati riproducibili e affidabili è stata la standardizzazione di culture neuronali sane e posi...

Le lesioni al sistema nervoso centrale adulto (CNS) possono portare a disabilità permanente a causa di meccanismi multipli che limitano la ricrescita assonale 1 . Dopo l&#39;infortunio, molti assoni CNS non formano un nuovo cono di crescita e non riescono a montare una risposta efficace rigenerativa 2 . Inoltre, i danni e il tessuto delle cicatrici che circondano lesioni del CNS inibiscono significativamente la crescita axonica 1 , 2 , 3 . Le terapie correnti per promuovere la rigenerazione del SNC dopo lesioni sono state focalizzate sul miglioramento del potenziale di crescita intrinseco del neurone danneggiato e sulla mascheratura degli inibitori dell&#39;estensione assonica associata a detriti di mielina e la cicatrice gliale 1 , 3 . Nonostante ciò la capacità di rigenerare gli assi lunghi a obiettivi lontani e di formare appropriate sinapsi funzionali rimane gravemente limitata 4 , </suP&gt; 5 , 6 , 7 . Nell&#39;attuale lavoro, microbeads, micromanipolazione pipettata e dispositivi microfluidici vengono utilizzati per avviare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. Precedenti lavori hanno dimostrato che le perline ricoperte da poli-D-lisina inducono l&#39;adesione della membrana seguita dal clustering dei complessi di vescicole sinaptici e la formazione di bouton presinaptici funzionali 8 . È stato inoltre dimostrato che quando il PDL-bead viene tirato meccanicamente dopo la differenziazione presinaptica, il cluster proteico sinaptico segue il branco, innescando un nuovo neurite 9 . La seguente procedura sfrutta questo fatto insieme alla capacità di coltivare i neuroni ippocampali embrionali di ratti in regioni organizzate su una copertura con dispositivi microfluidici polidimetilsilossano (PDMS) per ricreare con precisione un neuronecircuito. Questi dispositivi microfluidici PDMS sono non tossici, otticamente trasparenti e sono costituiti da due camere collegate da un sistema di microchannel. Una volta assemblati su una copertura, ogni apparecchio serve come uno stampo per guidare la crescita neuronale e mantenere sani le culture neuronali su modelli precisi per più di 4 settimane in vitro . Qui viene presentato un quadro per studiare i limiti di estensione e funzionalità del nuovo neurite. Nuove funzionalità neurite vengono create e posizionate per controllare (re) le reti neuronali. I tassi di estensione raggiunti sono più veloci di 20 μm / min su distanze di millimetro e sono stabilite le connessioni funzionali. Questi risultati mostrano inaspettatamente che la capacità intrinseca di queste neuriti per allungamento è molto più veloce di quanto precedentemente pensato. Questo approccio meccanico proposto supera strategie chimiche lente e consente la connessione controllata ad un target specifico. thÈ la tecnica apre nuove vie per lo studio in vitro di nuove terapie per ripristinare la connettività neuronale dopo il danno. Permette inoltre la manipolazione e il riavvolgimento delle reti neuronali per indagare aspetti fondamentali dell&#39;elaborazione dei segnali neuronali e della funzione neuronale in vitro .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="836">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Co-culture devices</td>
			<td style="width:104px;">Ananda Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:397px;">Commercially available at http://www.anandadevices.com</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Neuro devices</td>
			<td style="width:104px;">Ananda Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Commercially available at http://www.anandadevices.com</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round</td>
			<td style="width:104px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;">64-0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">35mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated</td>
			<td style="width:104px;">MatTex Incorporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">35mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile</td>
			<td style="width:104px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">95mmx15mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene</td>
			<td style="width:104px;">Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">50mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps</td>
			<td style="width:104px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89039-656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Polypropylene Conical Tube, 17x120mm style, Non Pyrogenic, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:104px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td style="width:104px;">B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td style="width:119px;">17504044</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">200uL Pipettors</td>
			<td style="width:104px;">VWR</td>
			<td>89079-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2-20uL Pipettors</td>
			<td style="width:104px;">Aerosol Resistant Tips</td>
			<td style="width:119px;">2149P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile]</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15023-021</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7365-45-9</td>
			<td>Extracellular solution/Beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7447-40-7</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-52-4</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td>Extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">#5 Dumont Dumostar Tweezers 11cm</td>
			<td style="width:104px;">World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td>Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micro particles based on polystyrene, 10 um</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">72986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate tubes</td>
			<td style="width:104px;">King Precision Glass, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">14696-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Horizontal Pipette Puller</td>
			<td style="width:104px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Micromanipulators, PCS-5000 Series</td>
			<td style="width:104px;">SD Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MC7600R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:104px;">BD Luer-Lok</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:104px;">Olympus&#160;</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Objective</td>
			<td style="width:104px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">UIS2, LUCPLFLN 40X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:104px;">Photometrics</td>
			<td style="width:119px;">Cascade II: 512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s (1x) L-15 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Rat Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Rat Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (1x) Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Rat Dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS (1x) Hank&#39;s Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate]</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>Rat Dissection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rewiring neuronal circuits: a new method for fast neurite extension and functional neuronal connection

La lesione del cervello e del midollo spinale può portare a disabilità permanente e alla morte perché non è ancora possibile rigenerare i neuroni per lunghe distanze e ricollegarle con un bersaglio adeguato. Qui viene descritta una procedura per iniziare, allungare e collegare rapidamente nuovi circuiti neuronali funzionali a lunghe distanze. I tassi di estensione raggiunti raggiungono oltre 1,2 mm / h, 30-60 volte più velocemente rispetto ai tassi in vivo degli assoni in crescita più veloci del sistema nervoso periferico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 volte più veloci di quanto riportato in precedenza per gli stessi Tipo neuronale in una fase precedente dello sviluppo 4 . In primo luogo, le popolazioni isolate di neuroni ippocampali del ratto vengono coltivate per 2-3 settimane in dispositivi microfluidici per posizionare le cellule in modo preciso, consentendo una facile micromanipolazione e una riproducibilità sperimentale. Successivamente, le perle ricoperte di poli-D-lisina (PDL) vengono poste sulle neurite per formare cont. AdesiveGli atti e la micromanipolazione pipettata vengono utilizzati per spostare il complesso bead-neurite risultante. Mentre il tallone viene spostato, estrae un nuovo neurite che può essere esteso su centinaia di micrometri e collegato funzionalmente a una cellula bersaglio in meno di 1 h. Questo processo consente la riproducibilità sperimentale e la facilità di manipolazione, escludendo strategie chimiche più lente per indurre la crescita del neurite. Le misure preliminari presentate qui dimostrano un tasso di crescita neuronale molto superiore a quelle fisiologiche. Combinando queste innovazioni permette la precisa creazione di reti neuronali nella cultura con un grado di controllo senza precedenti. È un metodo nuovo che apre la porta ad una pletora di informazioni e approfondimenti sulla trasmissione del segnale e sulla comunicazione all&#39;interno della rete neuronale, nonché come un parco giochi in cui esplorare i limiti della crescita neuronale. Le potenziali applicazioni e gli esperimenti sono diffusi con implicazioni dirette per terapie che mirano a ricollegare la neuronaL circuiti dopo trauma o in malattie neurodegenerative.

I neuroni ippocampali del ratto embrionale vengono coltivati ​​in dispositivi microfluidici per consentire un posizionamento preciso di cellule, PDL-perle e micromanipulatori. Il primo passo è quello di montare correttamente il dispositivo microfluidico su una copertura o un piatto di vetro. È essenziale che il dispositivo microfluidico sia ben attaccato al substrato per evitare che le cellule esca dalle camere e che si muovano sotto le parti del dispositivo che dovrebbero essere s...

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Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Questa procedura descrive come avviare rapidamente, estendere e collegare neuriti organizzati in camere microfluidiche utilizzando perline poli-D-lisina fissate a micropipette che guidano l&#39;allungamento del neurite.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

Una procedura per l&#39;impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

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Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

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Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Un metodo per la ricostruzione 3D e l'analisi della realtà virtuale delle cellule gliali e neuronali

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...