Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Dette arbejde blev støttet af NIH DK092408 og DK100227 til MFR. AJR blev støttet af T32-DK007013. Forfatterne vil gerne takke Dr. Julian A.T. Dow for CapaR-GAL4 og c724-GAL4 Drosophila bestande. Vi takker også Jacob B. Anderson for assistance opretholde eksperimentelle flyve Kors.

Alle trin i denne protokol i overensstemmelse med Mayo Clinic (Rochester, MN) retningslinjerne for brug af dyr.
1. flyve dyrehold
<ol><li>Raise flyver og sæt krydser ifølge standard dyrehold29. Bemærk: Fluorescerende reporter udtryk af GAL4/UAS system er proportional med temperatur og dermed opdræt temperaturen kan justeres for at ændre udtryk niveau. Mens høje udtryk niveauer ofte føre til et bedre signal-støj-forholdet er denne betingelse også forbundet ...

Kvantificering af pH,jeg succes i Drosophila MTs afhænger helt af sundhed udpakkede MTs og kvaliteten af montering og dissektion (Fig. A - C). Omhyggelig håndtering af væv som således beskrevet bydende nødvendigt. Dias frisk belagt med PLL væsentligt støtte MT montering som de har tendens til at være meget mere lim end dias der har tidligere været udsat til løsning. Omhyggelig montering vil også støtte i identifikationen af særskilte MT...

Målet med denne protokol er at beskrive kvantificering af intracellulære pH (pHi) ved hjælp af en genetisk kodet pH-indikator (GEpHI) og vise, hvordan denne metode kan anvendes til at vurdere basolateral H+ transport i en model insekt (D. melanogaster) renale struktur, Malpighian tubulus (MT). MTs tjene som ekskretionsorganerne af frugtflue og svarer funktionelt til de pattedyr nephron i flere vigtige henseender1. MTs arrangeres som 2 par af tubuli (anterior og posterior) i thorax og abdomen af fluen. Encellede epitelial røret af hver MT er sammensat af metabolisk aktive principal celler med særskilte apikale (luminale) og basolateral (hemocoel) polaritet som indtrængere Stjernehus celler. Forreste MTs består af 3 morfologisk, funktionelt, og udviklingshæmmede adskilte segmenter, navnlig oprindelige forstørrede segment, overgangsbestemmelser segment, og sekretoriske største segment, der slutter sig til ureter2. På det cellulære skala trans-epitelial ion transport i lumen opnås ved en apikale plasmamembran V-ATPase3 samt en alkali-metal/H+ varmeveksler og en basolateral Na+-K+-ATPase4, indad-ensretter K+ kanaler5, Na+-drevet Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6, og Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mens Stjernehus celler mægle Cl- og vand transportere8,9. Denne komplekse men tilgængelige fysiologisk system giver fremragende muligheder for undersøgelse af endogene ion transportmekanismer når det kombineres med de forskellige genetiske og adfærdsmæssige toolsets i Drosophila.
Begrundelsen for denne protokol var at beskrive en genetisk plastisk system for at studere epitelial ion transport med potentiale for integration fra celle til adfærd og eksport af værktøjer til andre modelsystemer. Udtryk for pHerry10, en GEpHI, der er afledt af en fusion af grønne pH-følsom super-ekliptika pHluorin11,12 (SEpH) og rød pH-ufølsom mCherry13, i MTs tillader kvantificering af H+ transport i enkelt MT celler gennem høj K+/nigericin kalibrering teknik14. Som mange ion transportvirksomheder flytte H+ ækvivalenter, tjener kvantificering af intracellulære pH,jeg som en funktionel repræsentation af ion bevægelse via en lang række transportvirksomheder. Drosophila MT modelsystem tilbyder også stærke genetiske værktøjer i væv-specifikke transgen15 og RNA interferens (RNAi)16 udtryk, som kan kombineres med cellulære imaging og hele-orgel assays17 , 18 , 19 i tubulus funktion til at skabe en robust værktøjskasse med vertikal integration fra molekyler til adfærd. Dette står i kontrast til mange andre protokoller for at vurdere epithelial biology, som historisk set sådanne målinger har stolet på indviklede og skræmmende mikro-dissektion, sofistikeret ion-selektiv elektroder20,21, og dyre pH-følsom farvestoffer22 med restriktive lastning krav og fattige cellulære specificitet i heterogen væv. GEpHIs har været brugt flittigt måle pHjeg i en lang række celle typer23. Tidlige arbejde udnyttes den iboende pH-følsomhed af grøn fluorescerende proteiner (NGL) at overvåge pHjeg i kulturperler epitelceller24 men de seneste to årtier har set GEpHIs anvendt i neuroner25, glia26, svampe27 , og anlægget celler28. Kombinationen af potentialet for cellulære målretning af genetiske konstruktioner gennem GAL4/UAS udtryk system15 og fysiologisk tilgængeligheden af Drosophila MT gøre dette til en ideel forberedelse til undersøgelser af pHjeg forordning og epitelial ion transport.
pHjeg forordning er blevet undersøgt i årtier og er afgørende for liv. MT forberedelse tilbyder en robust model at undervise fysiologi af pHjeg forordning men også udføre sofistikerede undersøgelser af pHi forordning ex vivo og in vivo. Denne protokol beskriver kvantificering af H+ bevægelighed på tværs af basolateral membranen af epitelceller af Drosophila MT ved hjælp af NH4Cl puls syre loading teknik21, men som pH-indikator er genetisk kodet, kan disse metoder og deres teoretiske ramme anvendes på enhver tilberedning medgørlige til transgenese og live imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Epitelial ion transport er afgørende for systemisk ion homøostase samt vedligeholdelse af væsentlige cellulære elektrokemiske gradienter. Regulering af intracellulært pH (pHjeg) er påvirket af mange ion transportvirksomheder og dermed overvågning pH,jeg er et nyttigt redskab til vurdering af transporter aktivitet. Moderne genetisk kodet pH-indikatorer (GEpHIs) giver optisk kvantificering af pHjeg i intakt celler på cellulært og subcellulært niveau. Denne protokol beskriver real-time kvantificering af cellulære pHjeg regulering i Malpighian tubuli (MTs) af Drosophila melanogaster gennem ex vivo live-billedbehandling af pHerry, en pseudo-ratiometric GEpHI med en pKet velegnet til at spore pH-ændringer i cytosol. Udtrukne voksen flue MTs er sammensat af morfologisk og funktionelt adskilte sektioner af encellede lag epitheler, og kan tjene som en tilgængelig og genetisk tractable model for efterforskning af epithelial transport. GEpHIs tilbyder flere fordele i forhold til konventionelle pH-følsom fluorescerende farvestoffer og ion-selektiv elektroder. GEpHIs kan mærke forskellige cellepopulationer, forudsat at passende promotor elementer er tilgængelige. Denne mærkning er især nyttig i ex vivo i vivoog i situ præparater, som er i sagens natur heterogene. GEpHIs også tillade kvantificering af pHi i intakt væv over tid uden behov for gentagne farvestof behandling eller væv udlægning. Den primære ulempe ved nuværende GEpHIs er tendensen til at aggregere i cytosole optagelser i reaktion på vævsskade og konstruere overdrevne udtryk. Disse mangler, deres løsninger og de iboende fordele af GEpHIs er vist i denne protokol gennem vurdering af basolateral proton (H+) transport i funktionelt adskilte principal og Stjernehus celler af uddraget flyve MTs. De teknikker og beskrevne referenceanalysemetode er let at tilpasse til en bred vifte af hvirveldyr og hvirvelløse præparater, og raffinement af analysen kan skaleres fra undervisning labs indviklede fastsættelse af ion flux via specifikke transportvirksomheder.

Sunde væv og korrekt identifikation af anterior MTs er afgørende for succes i denne protokol. Under dissektion, pleje bør tages ikke direkte berøring til MTs og til kun at håndtere dem af ureter som gribende MTs direkte vil føre til brud (figur 4A- B). Når MTs er fejet fladt i diaset, tubuli skal røres så lidt som muligt og overskydende bevægelse undgås, da dette vil skade encellede epitel lag (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellulære ion transport kan ofte vurderes ved at overvåge intracellulære pH (pH,jeg). Genetisk giver kodet pH-indikatorer (GEpHIs) optisk kvantificering af intracellulære pH i intakt celler. Denne protokol detaljer kvantificering af intracellulære pH via cellular ex vivo live-billeddannelse af Malpighian tubuli af Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-ratiometric kodet genetisk pH-indikator.

Optisk kvantificering af intracellulære pH i Drosophila melanogaster Malpighian tubulus epitheler med en fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Måling af Levetid i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Måling af vacuolær og cytosoliske pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I Gær cellesuspensioner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodede Molecular Probes at studere G-protein-koblede receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Anvendelse af Ramsay-analysen til at måle Fluid sekretion og Ion Flux priser i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian tubulus

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedligeholdelse af en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende nitrogenoxid (NO •) Probes, de geNOps, for Real-time Imaging af NO • Signaler i enkeltceller

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optisk tværsnit muskel område bestemmelse af Drosophila Melanogaster voksen indirekte flyvning muskler

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...