Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Dit werk werd gesteund door de NIH DK092408 en DK100227 naar MFR. AJR werd gesteund door T32-DK007013. De auteurs bedank Dr. Julian A.T. Dow voor de CapaR-GAL4 en c724-GAL4 Drosophila voorraden. Wij danken ook Jacob B. Anderson voor bijstand behoud van experimentele vliegen kruisen.

Alle stappen in dit protocol voldoen aan de richtsnoeren voor het gebruik van de dieren van de Mayo Clinic (Rochester, MN).
1. vliegen veehouderij
<ol><li>Raise vliegt en set kruist volgens standaard veehouderij29. Opmerking: TL verslaggever expressie door het systeem GAL4/UAS is evenredig met de temperatuur en dus fokken temperatuur kan worden aangepast om te veranderen van expressie niveau. Terwijl hoge expressie niveaus vaak tot een betere signaal-/ ruisverhoudi...

Het succes van kwantificering van pHik in Drosophila MTs hangt volledig af van de gezondheid van uitgepakte MTs en de kwaliteit van de montage en dissectie (Figuur A - C). De zorgvuldige behandeling van weefsel als is beschreven dus noodzakelijk. Dia's vers gecoat in PLL aanzienlijk steun MT montage als ze de neiging om veel meer lijm dan dia's die eerder zijn blootgesteld aan oplossing. Zorgvuldige montage zal ook helpen bij de identificatie van de...

Het doel van dit protocol is kwantificering van intracellulaire pH (pHi) met behulp van een genetisch-gecodeerde pH-Indicator (GEpHI) beschrijven en demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen basolaterale H+ vervoer in een model insect (overleden melanogaster) renale structuur, de Malpighian zaadvormende (MT). MTs dienen als de uitscheidingsmechanisme organen van de fruitvlieg en functioneel vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nefronen in enkele belangrijke opzichten1. MTs zijn gerangschikt als 2 paar tubuli (anterior en posterior) in de borstkas en de buik van de vlieg. De eencellige epitheliale buis voor elke MT is samengesteld uit metabolisch actief belangrijkste cellen met verschillende apicale (luminal) en basolaterale (hemocoel) polariteit evenals tussenliggende Notti cellen. Anterior MTs zijn samengesteld uit 3 morfologisch, functioneel, en ontwikkelingsachterstand afzonderlijke segmenten, met name de aanvankelijke uitgezet segment, overgangs segment en secretoire belangrijkste segment, die naar de urineleider2. Op de cellulaire schaal trans-epitheliale ion vervoer in het lumen wordt bereikt door een apicaal plasmamembraan V-ATPase-3 , evenals een alkali-metalen/H+ -wisselaar en een basolaterale nb+-K+-ATPase4, actieve veredeling-gelijkrichter K+ kanalen5, nb+-gedreven Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6en nb+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, terwijl Notti cellen Cl- bemiddelen en water transport8,9. Dit complexe maar toegankelijk fysiologische systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor onderzoek van endogene ion vervoer mechanismen in combinatie met de diverse genetische en gedragsmatige toolsets van Drosophila.
De reden voor dit protocol was in het beschrijven van een genetisch smeedbaar systeem voor het bestuderen van epitheliale ion vervoer met potentieel voor de integratie van cel tot gedrag en uitvoer van hulpprogramma's voor andere modelsystemen. Uitdrukking van pHerry10, een GEpHI die zijn afgeleid uit een fusie van groene pH-gevoelige super ecliptica pHluorin11,12 (SEpH) en rode pH-ongevoelig mCherry13, in MTs toelaat kwantificering in vervoermiddelen H+ afzonderlijke MT cellen tot en met de hoge K+/nigericin kalibratie techniek14. Zoals vele ion transporters H+ -equivalenten verplaatsen, dient kwantificering van intracellulaire pHik als een functionele weergave van ion verkeer via diverse transporteurs. Het systeem van Drosophila MT model biedt ook krachtige genetische hulpmiddelen in weefsel-specifieke transgenic15 en RNA interferentie (RNAi)16 expressie, die kan worden gecombineerd met cellulaire beeldvorming en geheel-orgel testen17 , 18 , 19 van zaadvormende functie voor het maken van een robuuste toolset met verticale integratie van moleculen tot gedrag. Dit staat in contrast met veel andere protocollen voor de beoordeling van epitheliale biologie, zoals historisch dergelijke metingen hebben vertrouwd op ingewikkeld en ontmoedigend micro-dissectie, verfijnde ion-Ionselectieve electroden20,21, en dure pH-gevoelige kleurstoffen22 met beperkende laden eisen en arme cellulaire specificiteit in heterogene weefsels. GEpHIs werden gebruikt voor het meten van pHik in een verscheidenheid van cel typen23uitgebreid. Vroege werk benut de inherente pH-gevoeligheid van groen Fluorescent proteïne (GFP) volgen pHik in gekweekte epitheliale cellen24 maar de afgelopen twee decennia heb gezien GEpHIs gebruikt in neuronen25, glia26, schimmels27 , en28van de cellen van de plant. De combinatie van het potentieel voor cellulaire targeting van genetische constructies door middel van de GAL4/UAS expressie systeem15 en de fysiologische toegankelijkheid van de Drosophila MT maken dit een ideale voorbereiding voor onderzoek van de pHik verordening en epitheliale ion vervoer.
pHik verordening decennialang is onderzocht en is essentieel voor leven. De MT-voorbereiding biedt een robuust model om te leren van de Fysiologie van pHik verordening maar ook uitvoeren geavanceerde onderzoeken bij pHi verordening ex vivo en in vivo. Dit protocol beschrijft kwantificering van H+ verkeer over het basolaterale membraan van de epitheliale cellen van de Drosophila MT met behulp van de NH-4Cl pulse zuur laden techniek21, maar als pH-indicator is genetisch gecodeerd, kunnen deze methoden en hun theoretisch kader worden toegepast op elk preparaat vatbaar voor Transgenese en live-imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Epitheliale ion vervoer is essentieel voor systemische ion homeostase evenals onderhoud van essentiële cellulaire elektrochemische verlopen. Intracellulaire pH (pHik) wordt beïnvloed door vele ion vervoerders en dus controle pHik is een nuttig instrument voor de beoordeling van de activiteit van de vervoerder. Moderne genetisch gecodeerd pH-indicatoren (GEpHIs) een optische kwantificering pHik in onbeschadigde cellen op een cellulaire en subcellular schaal. Dit protocol beschrijft real-time kwantificering van cellulaire pHik regulering in Malpighian tubuli (MTs) van Drosophila melanogaster via ex vivo wonen-imaging van pHerry, een pseudo-ratiometric-GEpHI met een pKeen geschikt voor pH wijzigingen bijhouden in het cytosol. Uitgepakte volwassen vliegen MTs zijn samengesteld uit morfologisch en functioneel verschillende secties van eencellige laag epitheel, en kunnen dienen als een model voor toegankelijk en genetisch hanteerbare voor onderzoek van epitheliale vervoer. GEpHIs bieden verschillende voordelen ten opzichte conventionele pH-gevoelige fluorescente kleurstoffen en ion-Ionselectieve electroden. GEpHIs kan verschillende cel populaties label mits passende promotor elementen beschikbaar zijn. Deze etikettering is vooral handig in ex vivo, in vivoen in situ preparaten, die intrinsiek heterogeen. GEpHIs ook de kwantificering van pHi in intact weefsels na verloop van tijd zonder de behoefte aan herhaalde kleurstof behandeling of weefsel externalization toestaan. Het primaire nadeel van de huidige GEpHIs is de neiging om aggregaat in cytosolische inclusies in reactie op weefselbeschadiging en overmatige expressie op te bouwen. Deze tekortkomingen, hun oplossingen, en de inherente voordelen van GEpHIs zijn in dit protocol door evaluatie van de basolaterale proton (H+) vervoer in functioneel verschillende hoofd- en Notti cellen van uitgepakte vlieg MTs gedemonstreerd. De technieken en analyse beschreven zijn gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala aan gewervelde en ongewervelde preparaten, en de verfijning van de bepaling van het onderwijs labs voor ingewikkelde bepaling van ion flux via specifieke vervoerders kan worden geschaald.

Gezonde weefsels en correcte identificatie van anterior MTs zijn essentieel voor het succes van dit protocol. Tijdens de dissectie, moet worden gewaakt om niet direct touch de MTs en enige greep zal hen door de ureter als aangrijpend de MTs rechtstreeks leiden tot breuk (figuur 4Avan- B). Bij MTs zijn geveegd plat op de dia, de tubuli moeten zo weinig mogelijk worden aangeraakt en overtollige beweging vermeden als dit zal sc...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Monitoring dynamische veranderingen in het mitochondriaal calciumgehalte Tijdens Apoptosis Met behulp van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Meting van de levensduur in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Meting van vacuolaire pH en Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In de gistcel Schorsingen

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Gebruik van de Ramsay Assay Fluid Afscheiding en Ion Flux tarieven in de Meet<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian buisje

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Handhaving van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevolking Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Toepassing van genetisch gecodeerde Fluorescent stikstofoxide (NO •) Probes, de geNOps, voor real-time beeldvorming van NO • Signalen in afzonderlijke cellen

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optische cross-sectionele spier gebied bepaling van Drosophila Melanogaster volwassen indirecte vlucht spieren

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...