Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

इस काम को NIH DK092408 और DK100227 ने MFR को सपोर्ट किया. AJR ने T32-DK007013 का समर्थन किया था. लेखक CapaR-GAL4 और c724-GAL4 Drosophila स्टॉक्स के लिए डॉ जूलियन A.T. डो शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम भी प्रयोगात्मक मक्खी पार बनाए रखने के लिए सहायता के लिए याकूब बी एंडरसन धंयवाद ।

इस प्रोटोकॉल में सभी कदम मेयो क्लिनिक (रोचेस्टर, MN) पशु उपयोग दिशानिर्देश के साथ अनुपालन ।
1. पशुपालन उड़ना
<ol><li>मक्खियों बढ़ाएं और निर्धारित मानक पशुपालन के अनुसार पार कर29। नोट: GAL4/यू?...

मैं Drosophila mts में पीएच के ठहराव की सफलता निकाले mts के स्वास्थ्य पर पूरी तरह से निर्भर करता है और बढ़ते और विच्छेदन की गुणवत्ता (चित्र A - C) । इस प्रकार, वर्णित के रूप में ऊतक के सावधान ?...

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य ठहराव का वर्णन करने के लिए है intracellular पीएच (phi) का उपयोग कर एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक (GEpHI) और प्रदर्शन कैसे इस विधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है basolateral H+ परिवहन में एक मॉडल कीट (डी । melanogaster) गुर्दे की संरचना, Malpighian tubule (मीट्रिक टन) । टन फल मक्खी के निकालनेवाला अंगों के रूप में सेवा और कार्यात्मक स्तनधारी nephron में कई प्रमुख संमान के समान है1। MTs छाती और मक्खी के पेट में नलिकाओं के 2 जोड़े (पूर्वकाल और पीछे) के रूप में व्यवस्थित कर रहे हैं । प्रत्येक मीट्रिक टन के एकल-कोशिका उपकला ट्यूब विशिष्ट शिखर (चमकदार) और basolateral (hemocoel) के साथ ही intercalated stellate कोशिकाओं के साथ चयापचयी सक्रिय प्रिंसिपल कोशिकाओं से बना है. पूर्वकाल MTs 3 आकृति से बना रहे हैं, कार्यात्मक, और विकास के विशिष्ट क्षेत्रों, विशेष रूप से प्रारंभिक फैली खंड, संक्रमणकालीन खंड, और स्रावी मुख्य खंड है, जो यूरेटर2करने के लिए मिलती है । सेलुलर पैमाने पर ट्रांस-लुमेन में उपकला आयन परिवहन एक शिखर प्लाज्मा झिल्ली वी-ATPase3 और एक क्षार धातु/एच+ एक्सचेंजर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक basolateral ना+-K+-ATPase4से पूरा हो गया है, आवक-दिष्टकारी K+ channels5, na+चालित सीएल−/HCO3− एक्सचेंजर (NDAE1)6, और ना+-k+-2Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, जबकि stellate कोशिकाओं की मध्यस्थता सीएल- और जल परिवहन8,9. इस जटिल लेकिन सुलभ शारीरिक प्रणाली अंतर्जात आयन परिवहन तंत्र की जांच के लिए उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है जब Drosophilaके विविध आनुवंशिक और व्यवहार toolsets के साथ संयुक्त ।
इस प्रोटोकॉल के लिए तर्क को सेल से व्यवहार और अंय मॉडल प्रणालियों के लिए उपकरणों के निर्यात के एकीकरण के लिए क्षमता के साथ उपकला आयन परिवहन का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से निंदनीय प्रणाली का वर्णन था । pHerry की अभिव्यक्ति10, एक GEpHI ग्रीन पीएच के एक संलयन से व्युत्पंन-संवेदनशील सुपर-क्रांतिवृत्त pHluorin11,12 (SEpH) और लाल पीएच असंवेदनशील mCherry13, में MTs परमिट ठहराव के एच+ परिवहन में उच्च K+/nigericin अंशांकन तकनीक के माध्यम से एकल मीट्रिक टन कोशिकाओं14. के रूप में कई आयन ट्रांसपोर्टरों कदम एच+ समकक्ष, intracellular पीएच के ठहरावमैं ट्रांसपोर्टरों की एक किस्म के माध्यम से आयन आंदोलन के एक कार्यात्मक प्रतिनिधित्व के रूप में कार्य करता है । Drosophila मीट्रिक टन मॉडल प्रणाली भी ऊतक विशिष्ट transgene15 और आरएनए हस्तक्षेप (RNAi)16 अभिव्यक्ति है, जो सेलुलर इमेजिंग और पूरे अंग परख के साथ संयुक्त किया जा सकता है में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण प्रदान करता है17 , 18 , 19 tubule समारोह के अणुओं से व्यवहार करने के लिए ऊर्ध्वाधर एकीकरण के साथ एक मजबूत toolset बनाने के लिए । यह उपकला जीव विज्ञान के आकलन के लिए कई अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत में खड़ा है, ऐतिहासिक रूप से इस तरह के माप जटिल और चुनौतीपूर्ण सूक्ष्म-विच्छेदन पर भरोसा किया है, परिष्कृत आयन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड20,21, और महंगी पीएच संवेदनशील रंजक सीमित आवश्यकताओं और विषम ऊतकों में गरीब सेलुलर विशिष्टता के साथ22 रंग । GEpHIs बड़े पैमाने पर माप के लिए इस्तेमाल किया गया हैमैं सेल प्रकार23की एक किस्म में पीएच । जल्दी काम अंतर्निहित पीएच-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की संवेदनशीलता (GFP) का दोहनमैं प्रसंस्कृत उपकला कोशिकाओं24 में पीएच पर नजर रखने के लिए, लेकिन पिछले दो दशकों GEpHIs में प्रयुक्त देखा है ंयूरॉंस25, glia26, कवक27 , और संयंत्र28कोशिकाओं । GAL4/यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली15 और Drosophila मीट्रिक टन के शारीरिक पहुंच के माध्यम से आनुवंशिक निर्माण के सेलुलर लक्ष्यीकरण के लिए क्षमता का संयोजन यह पीएचमैं की जांच के लिए एक आदर्श तैयारी कर विनियमन और उपकला आयन परिवहन.
पीएचमैं विनियमन दशकों के लिए अध्ययन किया गया है और जीवन के लिए महत्वपूर्ण है । मीट्रिक टन तैयारी एक मजबूत मॉडल के लिए पीएच के फिजियोलॉजी सिखानेमैं विनियमन प्रदान करता है, लेकिन यह भी पीएचमैं विनियमन पूर्व vivo और vivo मेंकी परिष्कृत जांच प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल का वर्णन ठहराव एच+ Drosophila मीट्रिक टन की उपकला कोशिकाओं के basolateral झिल्ली में आंदोलन एनएच4सीएल पल्स एसिड लोडिंग तकनीक21का उपयोग कर, लेकिन के रूप में पीएच संकेतक आनुवंशिक रूप से है इनकोडिंग, इन तरीकों और उनके सैद्धांतिक रूपरेखा किसी भी तैयारी transgenesis और जीने के लिए उत्तरदाई-इमेजिंग करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

उपकला आयन परिवहन प्रणालीगत आयन homeostasis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आवश्यक सेलुलर विद्युत ढाल के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है । Intracellular पीएच (phi) कई आयन ट्रांसपोर्टरों से प्रभावित है और इस प्रकार पीएच निगरानीमैं ट्रांसपोर्टर गतिविधि का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । आधुनिक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच संकेतक (GEpHIs) एक सेलुलर और सेलुलर पैमाने पर बरकरार कोशिकाओं मेंमैं पीएच के ऑप्टिकल ठहराव प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन वास्तविक समय ठहराव सेलुलर पीएचमैं विनियमन के Malpighian नलिकाओं (MTs) में Drosophila melanogaster के माध्यम से पूर्व vivo live-इमेजिंग के माध्यम से pHerry, एक छद्म ratiometric GEpHI के साथ एक पीकश्मीर cytosol में पीएच परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल । निकाले गए वयस्क मक्खी MTs आकृति से बना रहे हैं और एकल सेल परत epithelia के कार्यात्मक अलग वर्गों, और उपकला परिवहन की जांच के लिए एक सुलभ और आनुवंशिक रूप से तंत्रीय मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं. GEpHIs पारंपरिक पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक और आयन-चुनिंदा इलेक्ट्रोड पर कई लाभ प्रदान करते हैं । GEpHIs विशिष्ट कोशिका आबादी लेबल कर सकते है प्रदान की उपयुक्त प्रमोटर तत्वों उपलब्ध हैं । इस लेबलिंग पूर्व vivoमें विशेष रूप से उपयोगी है, vivo में, और सीटू की तैयारी में है, जो स्वाभाविक रूप से विषम हैं. GEpHIs भी दोहराया डाई उपचार या ऊतक externalization के लिए आवश्यकता के बिना समय के साथ बरकरार ऊतकों मेंमैं पीएच के ठहराव अनुमति देते हैं । वर्तमान GEpHIs की प्राथमिक खामी ऊतक नुकसान के जवाब में cytosolic समावेशन में कुल करने की प्रवृत्ति है और अधिक से अधिक अभिव्यक्ति का निर्माण । इन कमियों, उनके समाधान, और GEpHIs के निहित लाभ basolateral प्रोटॉन (एच+) के आकलन के माध्यम से इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कर रहे है कार्यात्मक विशिष्ट प्रिंसिपल और निकाले फ्लाई MTs की stellate कोशिकाओं में परिवहन । तकनीक और वर्णित विश्लेषण हड्डीवाला और invertebrate की तैयारी की एक विस्तृत विविधता के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं, और परख के परिष्कार विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से आयन प्रवाह के जटिल निर्धारण के लिए प्रयोगशालाओं शिक्षण से बढ़ाया जा सकता है ।

स्वस्थ ऊतकों और पूर्वकाल MTs की उचित पहचान इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं । विच्छेदन के दौरान, देखभाल के लिए सीधे नहीं mts टच लिया जाना चाहिए और केवल उंहें यूरेटर द्वारा संभाल के र?...

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Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

सेलुलर आयन परिवहन अक्सर निगरानी intracellular पीएच (पीएचमैं)द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक (GEpHIs) बरकरार कोशिकाओं में intracellular पीएच के ऑप्टिकल ठहराव प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल के माध्यम से intracellular पीएच के ठहराव सेलुलर पूर्व vivo live-इमेजिंग Drosophila के Malpighian नलिकाओं के melanogaster, एक छद्म pHerry आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच-संकेतक के माध्यम से विवरण ।

एक फ्लोरोसेंट आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग पीएच संकेतक के साथ Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia में Intracellular पीएच के ऑप्टिकल ठहराव

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

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