Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Questo lavoro è stato supportato da NIH DK092408 e DK100227 al fabbricante AJR è stata sostenuta da T32-DK007013. Gli autori desiderano ringraziare Dr. Julian A.T. Dow per la carosso-GAL4 e c724-GAL4 scorte di Drosophila . Ringraziamo anche Jacob B. Anderson per assistenza mantenendo sperimentale croci volare.

Tutti i punti in questo protocollo conformi alle linee guida uso animale Mayo Clinic (Rochester, MN).
1. allevamento di volare
<ol><li>Vola di rilancio e insieme traverse secondo standard allevamento29. Nota: Espressione di reporter fluorescente dal sistema GAL4/UAS è proporzionale alla temperatura e quindi allevamento temperatura può essere regolata per modificare il livello di espressione. Mentre i livelli di espressione alta conducono spesso ad un migliore rap...

Il successo di quantificazione del pHsono in Drosophila MTs dipende interamente sulla salute degli estratti MTs e la qualità del montaggio e la dissezione (Figura A – C). Così, la gestione attenta del tessuto come descritto è imperativa. Diapositive appena rivestiti in PLL sostanzialmente aiuti MT di montaggio, come essi tendono ad essere molto più adesivo di diapositive che precedentemente sono stati esposti alla soluzione. Montaggio attenzio...

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere la quantificazione del pH intracellulare (pHi) utilizzando un geneticamente codificato-indicatore di pH (GEpHI) e dimostrare come questo metodo può essere utilizzato per valutare basolaterale trasporto di H+ in un insetto di modello (D. melanogaster) struttura renale, l'anatomista (MT). MTs servire come gli organi escretori del moscerino della frutta e sono simili ai mammiferi nefrone in diversi aspetti chiave1. MTs sono disposti come 2 paia di tubuli (anteriori e posteriori) nel torace e l'addome della Mosca. Il tubo epiteliale unicellulare di ogni MT è composto di cellule principali metabolicamente attive con la clausola distinct apicale (luminal) e basolaterale (emocele) polarità come pure intercalate cellule stellate. MTs anteriore sono composti da 3 morfologicamente, funzionalmente, ed inerente allo sviluppo distinti segmenti, in particolare l'iniziale dilatati segmento e segmento di transizione secretiva segmento principale, che si unisce all' uretere2. A livello cellulare trasporto trans-epiteliale ionico nel lumen è compiuto da una membrana plasmatica apicale del V-ATPasi3 e uno scambiatore di alcali-metallo/H+ , nonché un basolateral Na+-K+-ATPasi4, verso l'interno-raddrizzatore K+ canali5, Na+-driven Cl−/HCO3− scambiatore (NDAE1)6e Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69),7, mentre le cellule stellate mediano Cl– e acqua di trasporto8,9. Questo sistema fisiologico complesso ma accessibile offre eccellenti opportunità per indagine dei meccanismi di trasporto di ioni endogeni quando combinato con i diversi set di strumenti genetici e comportamentali di Drosophila.
La spiegazione razionale per questo protocollo era di descrivere un sistema geneticamente malleabile per studiare il trasporto ionico epiteliale con un potenziale di integrazione da cella a comportamento e l'esportazione di strumenti ad altri sistemi di modello. Espressione di Bud10, un GEpHI derivato da una fusione di verde pH sensibili Super-eclittica pHluorin11,12 (SEpH) e rosso mCherry pH-insensibile13, in MTs permette quantificazione di trasporto H+ in celluli MT attraverso la tecnica di calibrazione /nigericin alta K+14. Come molti trasportatori di ioni spostano equivalenti di H+ , quantificazione del pH intracellulare funge da rappresentazione funzionale del movimento di ioni attraverso una varietà di trasportatori. Il sistema di modello di Drosophila MT offre anche potenti strumenti genetici in tessuto-specifico transgene15 ed espressione di RNA interferenza (RNAi)16 , che può essere combinato con imaging cellulare e intero-organo saggi17 , 18 , 19 della funzione del tubulo per creare un robusto set di strumenti con integrazione verticale da molecole di comportamento. Questo è in contrasto con molti altri protocolli per la valutazione biologia epiteliale, come storicamente tali misure hanno contato su intricati e scoraggiante micro-dissezione, sofisticato elettrodi iono-selettivi20,21, e costosi pH sensibili coloranti22 con richieste di caricamento restrittive e scarsa specificità cellulare nei tessuti eterogenei. GEpHIs sono stati utilizzati estesamente misurare pHsono in una varietà di tipi di cella23. Primi lavori sfruttati la pH-sensibilità intrinseca di verde fluorescente Protein (GFP) per monitorare il pH in cellule epiteliali coltivate24 , ma negli ultimi due decenni hanno visto GEpHIs utilizzato in neuroni25, glia26, funghi27 , e pianta cellule28. La combinazione del potenziale per il targeting cellulari di costrutti genetici attraverso il sistema di espressione GAL4/UAS15 e l'accessibilità al fisiologico della drosofila MT rendono questo una preparazione ideale per indagini di pHho regolamento e trasporto ionico epiteliale.
regolazione del pH è stato studiato per decenni ed è vitale alla vita. La preparazione di MT offre un modello affidabile per insegnare la fisiologia della regolazione del pHho ma anche eseguire sofisticate indagini di pHi regolamento ex vivo e in vivo. Questo protocollo descrive la quantificazione del movimento H+ attraverso la membrana basolaterale delle cellule epiteliali di Drosophila MT utilizzando il NH4caricamento tecnica21acido di impulso di Cl, ma come l'indicatore di pH è geneticamente codificato, questi metodi e loro quadro teorico può essere applicati a qualsiasi preparazione suscettibili di transgenesi e live-imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Trasporto ionico epiteliale è vitale per omeostasi ionica sistemica così come manutenzione dei gradienti elettrochimici cellulari essenziali. PH intracellulare (pHio) è influenzato da molti trasportatori di ioni e quindi monitoraggio pHmi è uno strumento utile per la valutazione dell'attività di trasportatore. Moderno geneticamente codificato-indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH in cellule intatte su scala cellulare e subcellulare. Questo protocollo descrive la quantificazione in tempo reale del pH cellulareho regolamento in tubuli malpighiani (MTs) di Drosophila melanogaster attraverso ex vivo live-immagini di Bud, una pseudo-raziometrici GEpHI con un pKun adatto per tenere traccia di variazioni di pH nel citosol. Estratto Mosca adulta MTs sono composte da sezioni morfologicamente e funzionalmente distinte del epithelia strato unicellulare e può servire come un modello accessibile e geneticamente trattabile per indagine di trasporto epiteliale. GEpHIs offrono parecchi vantaggi sopra le tinture fluorescenti convenzionali pH sensibili ed elettrodi iono-selettivi. GEpHIs possibile etichettare popolazioni distinte delle cellule, purché gli elementi appropriati promotore sono disponibili. Questa marcatura è particolarmente utile nelle ex vivo, in vivoe in situ preparati, che sono intrinsecamente eterogenei. GEpHIs consentono anche la quantificazione del pHi nei tessuti intatti nel tempo senza necessità di esternalizzazione di trattamento o tessuto di tintura ripetute. Lo svantaggio principale del GEpHIs corrente è la tendenza ad aggregare nelle inclusioni citosoliche in risposta al danno tissutale e costruire la sovra-espressione. Queste carenze, loro soluzioni e vantaggi che essi GEpHIs vengono illustrati nel presente protocollo attraverso la valutazione del trasporto di protoni (H+) basolateral nelle cellule principali e stellari funzionalmente distinte di estratti fly MTs. Le tecniche e l'analisi descritta sono facilmente adattabile ad un'ampia varietà di preparazioni di vertebrati e invertebrati, e la raffinatezza del dosaggio può essere scalata da laboratori intricato determinazione del flusso ionico attraverso specifici trasportatori didattici.

Tessuti sani e un'adeguata identificazione del MTs anteriore sono vitali per il successo del presente protocollo. Durante la dissezione, dovrebbe prestare attenzione a non direttamente tocco il MTs e maniglia unica loro dall'uretere come la MTs di presa direttamente porterà alla rottura (Figura 4A– B). Quando MTs sono spazzate piatta sulla diapositiva, i tubuli devono essere toccati il meno possibile e movimento in eccess...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Trasporto ionico cellulare spesso può essere valutata attraverso il monitoraggio pH intracellulare (pHho). Geneticamente codificato indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH intracellulare in cellule intatte. Questo protocollo dettaglia la quantificazione del pH intracellulare attraverso cellulare ex vivo live-immagini di tubuli malpighiani di Drosophila melanogaster con Bud, un pseudo-raziometrici geneticamente codificato indicatore di pH.

Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissezione del sistema nervoso centrale larvali in Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Ricerca

Biologia

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Lievito Cell Sospensioni

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

L&#39;utilizzo del Ramsay Assay misurare la secrezione di fluidi e Ion Flux Prezzi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubulo Malpighi

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Determinazione di zona ottico della sezione trasversale del muscolo dei muscoli adulto volo indiretto di Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...