Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

MFR. AJR を DK100227 は、T32 DK007013 によって支えられ、この仕事は、NIH の DK092408 によって支えられました。著者は、CapaR GAL4 と c724 GAL4 博士ジュリアン A.T. ダウを感謝したいショウジョウバエ株。我々 はまた実験飛ぶ十字架を維持支援のためヤコブ B のアンダーソン氏を感謝します。

このプロトコルのすべてのステップはメイヨー クリニック (ロチェスター、ミネソタ) の動物の使用に関するガイドラインを遵守します。
1. 飼育をフライします。
<ol><li>昇給が飛んできて、標準飼育29によると交差するセット。 注: GAL4/UAS システムによって蛍光レポーター式は温度に比例して、発現レベルを変更するため飼育温度を調整できます。?...

ショウジョウバエMTs で pH は私の定量化の成功は健康抽出された MTs と取り付けと郭清 (図 A - C) の質によってまったく異なります。したがって、組織としての慎重な取り扱いは説明が不可欠です。新鮮な PLL でコーティング スライド大幅にソリューションにさらされて以前のスライド援助 MT マウントよりもはるかに多くの接着剤をする傾...

このプロトコルの目的は、遺伝子にコードされた pH インジケーター (GEpHI) を用いた細胞内 pH (pHi) の定量化と基底モデル昆虫 (+ H+輸送を評価するためのこのメソッドの使用方法を示すキイロショウジョウバエ) 腎構造のマルピギー氏管 (MT)。MTs は、ショウジョウバエの排泄器官として、いくつかのキーの点1に哺乳類のネフロンに機能的に似ています。MTs は、胸郭、ハエの腹部の (前部と後部) の尿細管の 2 組として配置されます。各 MT の単一細胞上皮管が根尖を明確なの代謝活性の主細胞から成る (内腔) 介在の星状細胞と同様、基底 (hemocoel) 極性と。発達個別のセグメント、特に初期拡張尿管2に結合分泌の主要なセグメント、経過セグメントは、セグメントおよび形態学的、機能的には、3 前方 MTs が構成されます。携帯電話のスケールで内腔の上皮細胞のイオン輸送、頂端膜 V-atpase3アルカリ金属/H+交換と基底 Na+K+で実現-atp アーゼの4、チャンネル5、Na+は、内向き整流性 K+ -Cl−/HCO3−交換 (NDAE1)6、および Na+K+を駆動-2 Cl−共輸送 (NKCC;Ncc69)7、星状細胞仲介 Cl- 、水輸送8,9。この複雑なアクセス可能な生理学的システムは、ショウジョウバエの遺伝学的および行動の多様なツールセットと組み合わせた場合の内因性イオン伝導機構の調査のための優秀な機会を提供します。
このプロトコルのための理論的根拠は動作し、他のモデルのシステム ツールのエクスポートの統合セルからの潜在性の上皮膜イオン輸送を研究するため遺伝子組み換え可鍛性システムを記述します。PHerry10の式、グリーンの pH に敏感な超黄道 pHluorin11,12 (セフ) と赤の pH に依存しない mCherry13MTs での融合から派生した GEpHI を許可の H+輸送の定量化高 K+/nigericin 校正テクニック14を介して単一の mt 野細胞。多くのイオン輸送体は、H+同等を移動、細胞内 pH は私の定量化はさまざまなトランスポーターを介してイオン移動の関数表現として機能します。ショウジョウバエMT モデル システムはまた組織特異遺伝子15と細胞イメージング全体オルガン試金17と組み合わせて使用することができますが、RNA 干渉 (RNAi)16式の強力な遺伝的ツールを提供しています,18,分子から行動への垂直統合の堅牢なツールセットを作成する尿細管機能の19 。これは対照的に他の多くのプロトコルに歴史的にそのような測定が複雑に依存している、上皮の生物学の評価とマイクロ郭清、洗練されたイオン選択性電極20,21, を大変なの略します。高価な pH 感受性色素を22制限荷重要件と異種組織の細胞特異性悪い。GEpHIs は、広く pH私携帯型23の様々 な測定に使用されています。初期の作品は固有 pH 感受性の緑色蛍光タンパク質 (GFP) pH私培養上皮細胞24を監視するを悪用されるが、過去 20 年を見た使用ニューロンで25、グリア26、菌類27 GEpHIs、植物細胞28。GAL4/UA 式システム15とショウジョウバエMT の生理ユーザー補助の遺伝的構造の細胞ターゲットの可能性の組み合わせはこの pHの調査のための理想的な準備をする私規制と上皮膜イオン輸送。
pH私規制は何十年も研究されている、生活に不可欠です。MT の準備では、pH私の調節の生理学を教えるが、また実行する堅牢なモデル洗練された pHi規制前のヴィヴォとin vivoの調査を提供しています。このプロトコルはショウジョウバエNH4Cl パルス酸法21の読み込みを使用して MT の上皮細胞の基底膜で H+運動の定量化をについて説明しますが、pH 指示薬としては遺伝子エンコードすると、任意の影響を受けやすい遺伝子導入とライブ イメージングの準備にこれらのメソッドとその理論的枠組みを適用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

上皮膜イオン輸送は本質的な細胞の電気化学勾配の維持と同様、全身のイオンの恒常性に不可欠です。多くのイオン輸送体 (pH私) 細胞内 pH の影響を受けて、トランスポーター活性を評価するための便利なツールは、このように pH は私を監視します。モダンな遺伝子にエンコードされた pH-指標 (GEpHIs) は細胞および細胞内の規模で pH私そのままなセルの光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞 pH私の規制のキイロショウジョウバエのマルピギー氏管 (MTs) で前のヴィヴォライブ イメージングによる pHerry、pKで擬似レシオ メトリック GEpHI リアルタイム定量化をについて説明します、細胞質の pH 変化を追跡に適しています。抽出された大人のフライ MTs は単一細胞層上皮の形態学的、機能的に独立したセクションで構成され、上皮の輸送の調査のためのアクセス可能で、遺伝的に扱いやすいモデルとして利用できます。GEpHIs は、従来の pH に敏感な蛍光染料とイオン選択性電極上のいくつかの利点を提供しています。GEpHIs 適切な促進者の要素が使用異なる細胞集団にラベルを付けることができます。この方、前のヴィヴォ体内、および本質的に不均一であるその場で準備に便利です。GEpHIs もそのままティッシュで繰り返される色素の治療や組織の外部化を必要とせず時間をかけて pHiの定量化を許可します。現在の GEpHIs の主な欠点は、組織の損傷の応答のゾル性細胞質包有物の集約し、過剰発現を構築する傾向です。抽出されたフライ MTs の機能的に異なるプリンシパルと星状細胞に基底プロトン (H+) 輸送の評価を通じて、この議定書では、これらの欠点、彼らのソリューション、および GEpHIs の固有の利点を示した。技術と説明する分析が容易に適応できる幅広い脊椎動物と無脊椎動物の準備と特定のトランスポーターを介してイオン流束の複雑な測定の演習を教えるからアッセイの洗練されたことができます。

健康な組織や前方の MTs を適切に識別、このプロトコルの成功に不可欠です。解剖時に注意が必要なく、直接タッチする MTs とだけハンドルに直接 MTs をグリップとして尿管によってそれらは (図 4 a- B) の破損に 。MTs はスライドにフラットを掃引、細管を可能な限り少し触れられなければならないし、これを回避余分な?...

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Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

細胞のイオン輸送は細胞内 pH モニタリングによってしばしば評価される(pH私)。遺伝子 Encoded pH 指示薬(GEpHIs)は、そのまま細胞内 pH の光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞前のヴィヴォライブ イメージング pHerry とキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の細胞内 pH の定量化の詳細については、擬似レシオ メトリック遺伝子にエンコードされた pH インジケーター。

蛍光遺伝子にコードされた pH インジケーターとキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の上皮細胞で光の定量化の細胞内 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

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液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで&gt;</em&gt;酵母細胞懸濁液に

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

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で液分泌とイオンフラックス速度を測定するためのラムゼイアッセイの使用<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;マルピーギ管

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

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のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

遺伝的にコードされた蛍光一酸化窒素の応用（•NO）シングル細胞におけるNO•信号のリアルタイムイメージングのためのプローブ、geNOps、

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

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キイロショウジョウバエ成虫の間接飛翔筋の光学断面筋決定

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...