Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Dette arbeidet ble støttet av NIH DK092408 og DK100227 å MFR. AJR ble støttet av T32-DK007013. Forfatterne vil takke Dr. Julian A.T. Dow for CapaR-GAL4 og c724-GAL4 Drosophila aksjer. Vi takker også Jacob B. Anderson for hjelp opprettholde eksperimentelle fly kors.

Alle trinn i denne protokollen overholde Mayo Clinic (Rochester, MN) dyr bruk retningslinjene.
1. fly dyrehold
<ol><li>Raise fluer og sett krysser etter standard dyrehold29. Merk: Fluorescerende reporter uttrykket av GAL4/UAS systemet er proporsjonal med temperaturen og dermed oppdrett temperatur kan justeres for å endre uttrykket nivå. Mens høy uttrykk nivåer ofte føre til en bedre signal-til-støy-forhold er denne tilstanden også forbundet med økt cytosoli...

Suksessen til kvantifisering av pHjeg i Drosophila MTs avhenger helt helse utdraget MTs og kvaliteten på montering og disseksjon (Figur A - C). Således, forsiktig håndtering av vev som beskrevet er viktig. Lysbilder fersk belagt i PLL vesentlig hjelpemiddel MT montering som de pleier å være mye mer lim enn lysbilder som tidligere har vært utsatt til løsning. Forsiktig montering vil også hjelpe i identifikasjon av forskjellige MT segmenter (<...

Målet med denne protokollen er å beskrive kvantifisering av intracellulær pH (pHi) bruker en genetisk kodet pH-indikator (GEpHI) og demonstrere hvordan denne metoden kan brukes til å vurdere basolateral H+ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nyre struktur, Malpighian tubule (MT). MTs tjene som frukt fly excretory organer og ligner funksjonelt på pattedyr nyre i flere viktige henseender1. MTs er arrangert som 2 par av tubules (fremre og bakre) i thorax og buk fly. Encellede epithelial tube hver MT består av metabolsk aktive viktigste celler med forskjellige apikale (luminal) og basolateral (hemocoel) polaritet samt under Sommer stellate celler. Fremre MTs består av 3 morphologically, funksjonelt, og developmentally forskjellige segmenter, spesielt første dilated segmentet, overgangsreglene segmentet og sekretoriske hovedavdeling avsnitt, som kobles til ureter2. I cellular skala trans-epitelial ion transport i lumen oppnås ved en apikale plasma membran V-ATPase3 og en alkali-metall/H+ exchanger, samt en basolateral Na+-K+-ATPase4, innover-likeretter K+ kanaler5, Na+-drevet Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6og Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mens stellate celler megle Cl- og vann transport8,9. Dette komplekse, men tilgjengelig fysiologiske systemet gir gode muligheter for undersøkelse av endogene ion transportmekanismer kombinert med de ulike genetiske og atferdsmessige verktøysett av Drosophila.
Begrunnelsen for denne protokollen var å beskrive et genetisk formbare system for å studere epithelial ion transport med potensial for integrasjon fra cellen til oppførsel og eksport av verktøy for andre modellsystemer. Uttrykk for pHerry10, en GEpHI avledet fra en blanding av grønn pH-sensitive super ekliptikken pHluorin11,12 (SEpH) og røde pH-ufølsom mCherry13, i MTs tillater kvantifisering av H+ transport i MT enkeltceller gjennom de høye K+/nigericin kalibrering teknikk14. Som mange ion transportører flytte H+ -ekvivalenter, serverer kvantifisering av intracellulær pHjeg som en funksjonell representasjon av ion bevegelse via en rekke transportører. Drosophila MT modell systemet tilbyr også kraftig genetisk verktøy i vev-spesifikke transgene15 og RNA forstyrrelser (RNAi)16 uttrykk som kan kombineres med mobil bildebehandling og hele-orgel analyser17 , 18 , 19 av tubule-funksjonen til å opprette et solid verktøysett med vertikal integrasjon fra molekyler virkemåten. Dette står i kontrast til mange andre protokoller for å vurdere epithelial biologi, som historisk slike målinger har stolt på intrikate og skremmende mikro-disseksjon, sofistikerte ion-selektiv elektroder20,21, og dyre pH-sensitive fargestoffer22 med restriktiv lasting krav og dårlig mobilnettet spesifisitet heterogen vev. GEpHIs har blitt brukt mye måle pHjeg i en rekke cellen typer23. Tidlige arbeid utnyttet iboende pH-følsomheten av Green fluorescerende Protein (GFP) å overvåke pHjeg kulturperler epitelceller24 men de siste to tiårene har sett GEpHIs brukes i neurons25, glia26, sopp27 , og plant celler28. Kombinasjonen av potensialet for mobilnettet målretting av genetisk konstruksjoner gjennom GAL4/UAS uttrykk systemet15 og fysiologiske tilgjengelighet av Drosophila MT gjør dette til en ideell forberedelse til undersøkelser av pHjeg regulering og epithelial ion transport.
pHjeg regulering har vært studert i flere tiår og er avgjørende for liv. MT utarbeidelse tilbyr en robust modell å lære fysiologi av pHjeg regulering, men også utføre avanserte undersøkelser av pHi regulering ex vivo og i vivo. Denne protokollen beskriver kvantifisering av H+ bevegelse over basolateral membran av epitelceller av Drosophila MT bruker NH4Cl puls syre lasting teknikk21, men som pH-indikatoren er genetisk kodet, kan disse metodene og teoretisk struktur brukes på noen forberedelser mottakelig for transgenesis og live-imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Epitel ion transport er avgjørende for systemisk ion homeostase samt vedlikehold av avgjørende mobilnettet elektrokjemiske graderinger. Intracellulær pH (pHjeg) er påvirket av mange ion transportører og dermed overvåking pHjeg er et nyttig verktøy for å vurdere transporter aktivitet. Moderne genetisk kodet pH-indikatorer (GEpHIs) gir optisk kvantifisering av pHjeg i intakt celler i mobilnettet og subcellular skala. Denne protokollen beskriver sanntid kvantifisering av mobilnettet pHjeg regulering i Malpighian Tubules (MTs) av Drosophila melanogaster gjennom ex vivo live-avbildning av pHerry, en pseudo-ratiometric GEpHI med en pKen velegnet spore pH endringer i stoffer. Utdraget voksen fly MTs består av morphologically og funksjonelt forskjellige deler av encellede lag epithelia, og kan fungere som en tilgjengelig og genetisk medgjørlig modell for undersøkelse av epitelial transport. GEpHIs tilbyr flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle pH-sensitive fluorescerende fargestoffer og ion-selektiv elektroder. GEpHIs kan merke ulike celle populasjoner forutsatt riktig promoter elementer finnes. Denne merking er spesielt nyttig i ex vivo, vivoog i situ preparater, som er iboende heterogene. GEpHIs også tillater kvantifisering av pHi intakt vev over tid uten behovet for gjentatt fargestoff behandling eller vev eksternalisering. Den viktigste ulempen av gjeldende GEpHIs er tendensen å samle i cytosolic Inneslutninger svar vevsskade og konstruere over uttrykk. Disse svakhetene, sine løsninger og de iboende fordelene med GEpHIs er vist i denne protokollen gjennom vurdering av basolateral proton (H+) transport i funksjonelt forskjellige rektor og stellate celler av utdraget fly MTs. Teknikker og analyse beskrevet er lett tilpasses en rekke vertebrate og invertebrate forberedelser, og raffinementet til analysen kan skaleres fra undervisningen labs til intrikate fastsettelse av ion flux via bestemte transportører.

Sunt vev og korrekt identifisering av fremre MTs er avgjørende for suksessen til denne protokollen. Under disseksjon, bør man være forsiktig å ikke direkte berøring MTs og skal bare dem ved ureter så gripende MTs direkte fører til brudd (figur 4A- B). Når MTs er feid flatt inn i lysbildet, på tubuli må bli rørt mulig og overflødig bevegelse unngått som dette vil skade encellede epiteliale lag (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Mobilnettet ion transport kan ofte vurderes ved å overvåke intracellulær pH (pHjeg). Genetisk gir kodet pH-indikatorer (GEpHIs) optisk kvantifisering av intracellulær pH i intakt celler. Denne protokollen detaljer kvantifisering av intracellulær pH gjennom mobilnettet ex vivo live-avbildning av Malpighian tubules i Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-ratiometric kodet genetisk pH-indikator.

Optisk kvantifisering av intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Måling av levetid i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Måling av vacuolar og cytosolic pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I gjær cellesuspensjoner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisk kodet Molekylær Sonder til Study G protein-koblede reseptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Bruk av Ramsay analysen å måle fluidsekresjon og Ion Flux priser i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian tubule

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedlikehold av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Bruk av genetisk kodet Fluorescent Nitrogenoksid (NO •) sonder, de geNOps, for Real-time Imaging av NO • Signaler i enkeltceller

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optisk Cross-Sectional muskel området fastsettelse av Drosophila Melanogaster voksen indirekte flygingen musklene

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...