Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Эта работа была поддержана низ DK092408 и DK100227 для производителя Айр был поддержан T32-DK007013. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Джулиан а.т. Доу за CapaR-GAL4 и c724-GAL4 дрозофила запасов. Мы также благодарим Джейкоб Андерсон для помощи в поддержании экспериментальный полет кресты.

Все шаги в этом протоколе соответствует руководящим принципам использования животных клиники Майо (Рочестер, MN).
1. летать животноводства
<ol><li>Поднять мух и набор пересекает согласно стандартным животноводства29. Примечание: Флуоресцентные репортер выраж?...

Успех количественного определения рН,я в МТС дрозофилы полностью зависит от здоровья извлеченные МТС и качество монтажа и вскрытие (Рисунок – C). Таким образом тщательной обработке ткани как описано абсолютно необходимо. Слайды, свежезаваренным ?...

Цель настоящего Протокола заключается в описания квантификации внутриклеточный pH (pHi) с использованием генетически закодированный pH индикатор (GEpHI) и продемонстрировать, как этот метод может использоваться для оценки базолатеральной H+ транспорта в модели насекомых (D. melanogaster) почечной структура, Malpighian трубочку (MT). МТС служат выделительной органов плодовой мухи и функционально похожи на млекопитающих нефрон в нескольких ключевых отношениях1. МТС аранжированы как 2 пары трубочки (передняя и задняя) в грудной клетки и живота летать. Одноклеточных эпителиальных трубка каждого MT состоит из метаболически активные главных клеток с собственный верхушечный (люминал) и базолатеральной (гемоцель) полярности, а также вставными севрюга клетки. Передняя МТС состоят из 3 морфологически, функционально, и развивающих разных сегментов, особенно первоначальных расширены сегмента, переходного этапа и секреторную основной сегмент, который присоединяется к Мочеточник2. На клеточном уровне транс эпителиальных ионного транспорта в Люмене осуществляется путем апикальной плазматической мембраны V-АТФазы3 и теплообменник щелочно металл/Ч+ , а также базолатеральной Na+-K+-АТФазы4, внутрь выпрямительные K+ каналы5, Na+-Cl−/HCO3− теплообменника (NDAE1)6, и++Na -K-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, в то время как клетки Ито посредником Cl– и водный транспорт в8,9. Этот сложный, но доступным Физиологическая система обеспечивает отличные возможности для расследования эндогенного Ион транспортных механизмов в сочетании с различных генетических и поведенческих toolsets дрозофилы.
Обоснование для этого протокола был для описания генетически ковкого системы для изучения эпителиальных ионного транспорта с потенциалом для интеграции от ячейки поведение и экспорта средств в другие модели системы. Выражение pHerry10, GEpHI, производного от сочетание зеленого супер-эклиптики рН чувствительных pHluorin11,12 (SEpH) и красный рН регистра mCherry13, в МТС позволяет количественная оценка транспорта H+ отдельные ячейки MT через высокий K+/nigericin калибровки технику14. Как много ионных транспортеров двигаются H+ эквивалентов, количественная оценка внутриклеточного рН,я служит функционального представительства движения ионов через различные транспортеры. Система модель дрозофилы MT также предлагает мощные инструменты для генетических ткани конкретных трансген15 и РНК интерференции (RNAi)16 выражение, которое может сочетаться с сотовой изображений и анализы состава органа17 , 18 , 19 трубочку функции для создания надежных инструментов с вертикальной интеграции от молекул поведение. Это стоит в отличие от многих других протоколов для оценки эпителиальных биологии, как исторически такие измерения полагались на сложной и сложной микро рассечение, сложные ионоселективные электроды20,21, и дорогой рН чувствительных красители22 с ограничительной загрузки требования и бедных сотовой специфичность в разнородных тканей. GEpHIs были использованы обширно измерения рНя в различные типы клеток23. Ранние работы эксплуатируется присущие рН чувствительность от Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) для мониторинга рНя культивировали эпителиальные клетки24 , но в последние два десятилетия видели GEpHIs, используемые в нейроны25,26глии, грибов27 , и завод клетки28. Сочетание потенциал для сотовых ориентации генетической конструкции через GAL4/Уан выражение системы15 и физиологического доступности дрозофилы MT делают это идеальная подготовка для исследования рНя регулирование и транспорт ионов эпителия.
pHя регулирования была изучена на протяжении десятилетий и имеет жизненно важное значение для жизни. Подготовка MT предлагает надежную модель учить физиологии рНя регулирования, но также выполнять сложные расследования рНi регулирование ex vivo и в естественных условиях. Этот протокол описывает количественная оценка H+ движения через мембрану базолатеральной эпителиальных клеток дрозофилы MT с помощью NH4Cl пульс кислоты Погрузка техники21, но как рН показатель является генетически закодированы, эти методы и их теоретические основы могут применяться к любой подготовки поддаются трансгенез и жить изображений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Эпителиальных ионный транспорт имеет жизненно важное значение для системного ионного гомеостаза, а также поддержание основных клеточных электрохимических градиентов. Внутриклеточный pH (pHя) находится под влиянием многих ионных транспортеров и таким образом мониторинг pH,я является полезным инструментом для оценки деятельности перевозчика. Современные генетически закодированный рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественного определения рНя нетронутым клеток на клеточном и субклеточном уровне. Этот протокол описывает в реальном времени количественная оценка клеточного рНя регулирования в Malpighian трубочки (МТС) Drosophila melanogaster через ex vivo жить изображения pHerry, псевдо ratiometric GEpHI с pK хорошо подходит для отслеживания изменения рН в цитозоль. Извлеченный взрослых летать МТС состоят из морфологически и функционально различных разделов одноклеточного слоя эпителия и может служить в качестве доступной и генетически шансов справиться с возникающими модель для исследования эпителиальных транспорта. GEpHIs предлагают ряд преимуществ перед обычными рН чувствительных флуоресцентных красителей и ионоселективные электроды. GEpHIs можно пометить различных клеточных популяций, предоставлены соответствующие промоутер элементы доступны. Эта маркировка особенно полезен в ex vivo, в естественных условияхи на месте препараты, которые по своей сути неоднородных. GEpHIs также количественной рНi в неповрежденной ткани с течением времени без необходимости повторного окрашивания лечения или ткани экстернализации. Основной недостаток текущей GEpHIs является тенденция агрегирования в цитозольной включений в ответ на повреждение тканей и построить гиперэкспрессия. Эти недостатки, их решения и преимущества GEpHIs продемонстрировал в этом протоколе путем оценки базолатеральной Протон (H+) транспорта в функционально различных главных и севрюга клеток извлеченных покупать МТС. Методы и анализ описанных легко адаптируется к широкий выбор препаратов, позвоночных и беспозвоночных, и изысканность Пробирной может масштабироваться от преподавания labs сложные определения ионного потока через конкретные перевозчиков.

Здоровые ткани и надлежащей идентификации передней МТС жизненно важное значение для успеха этого протокола. Во время вскрытия следует позаботиться не непосредственно ощупь МТС и только ручка их мочеточника как захвата МТС непосредственно приведет к поломке (<strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Клеточного ионного транспорта часто может оцениваться путем мониторинга внутриклеточного рН (рН,я). Генетически Encoded рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественная оценка внутриклеточного рН в клетках нетронутыми. Этот протокол подробности количественная оценка внутриклеточного рН через сотовый ex vivo жить изображений Malpighian трубочки Drosophila melanogaster с pHerry, псевдо ratiometric генетически закодированный рН показатель.

Оптических количественная оценка внутриклеточный pH в Drosophila melanogaster Malpighian трубочку эпителия с флуоресцентные генетически закодированный pH индикатор

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Мониторинг функции сердца в личинок Дрозофилы Для физиологических исследований

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Измерение и вакуолярных Цитозольные рН<em&gt; In Vivo</em&gt; В суспензиях Дрожжи клеточной

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Использование Рамсей анализе измерить жидкости секреции и поток ионов ставки в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Мальпигиев канальцев

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Поддержание<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Население Кейдж

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Применение Генетически кодируемые Флуоресцентные окиси азота (NO •) зондов geNOps, в режиме реального времени изображений NO • Сигналы в одиночных камерах

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Определение области оптических поперечных мышц Drosophila Melanogaster взрослых косвенные рейса мышц

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...