Name: optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Detta arbete stöds av NIH DK092408 och DK100227 till MFR. AJR stöddes av T32-DK007013. Författarna vill tacka Dr Julian A.T. Dow för CapaR-GAL4 och c724-GAL4 Drosophila bestånd. Vi tackar också Jacob B. Anderson för hjälp att upprätthålla experimentella flyga kors.

Alla steg i detta protokoll överensstämmer med riktlinjerna Mayo Clinic (Rochester, MN) användning av djur.
1. flyga djurhållning
<ol><li>Höja flugor och uppsättning korsar enligt standard djurhållning29. Obs: Fluorescerande reporter uttryck av GAL4/UAS systemet är proportionell mot temperaturen och således uppfödning temperaturen kan justeras för att förändra uttrycket nivå. Medan hög uttrycksnivåerna ofta leda till en bättre signal-brus-förhåll...

Framgången för kvantifiering av pHjag i Drosophila MTs beror helt på extraherade MTs och kvaliteten på montering och dissektion (Figur A – C) hälsa. Således är beskrivs noggrann hantering av vävnad som absolut nödvändigt. Bilder nyligen målade i PLL väsentligt stöd MT montering eftersom de tenderar att vara mycket mer lim än glider som tidigare har exponerats lösning. Noggrann montering kommer också stöd i att identifiera distinkt...

Målet med detta protokoll är att beskriva kvantifieringen av intracellulära pH (pHi) använda en genetiskt-kodade pH-indikator (GEpHI) och visar hur denna metod kan användas för att bedöma basolateral H+ transport i en modell insekt (D. melanogaster) nedsatt struktur, den Malpighian tubuli (MT). MTs fungera som bananflugan utsöndrings organ och är funktionellt liknar den hos däggdjur nefronet i flera viktiga avseenden1. MTs arrangeras som 2 par av tubuli (främre och bakre) i bröstkorg och mage av i farten. Encelliga epitelial röret för varje MT består av metaboliskt aktiva huvudsakliga celler med distinkta apikala (luminala) och basolateral (hemocoel) polaritet samt ortodoxas stjärnformade celler. Främre MTs består av 3 morfologiskt, funktionellt, och utvecklingsmässigt distinkta segment, särskilt inledande vidgade segment, övergångsbestämmelser segment och sekretoriska viktigaste segmentet, som ansluter sig till urinledaren2. På cellulär nivå trans-epitelial ion transport till lumen åstadkoms genom en apikal plasmamembranet V-ATPas3 samt en alkali-metall/H+ -växlare och en basolateral Na+-K+-ATPas4, inåt-likriktaren K+ kanaler5, Na+-driven Cl−/HCO3− värmeväxlare (NDAE1)6och Na+-K+-2 Cl− hämmare (NKCC; Ncc69)7, medan stjärnformade celler medla Cl– och vatten transport8,9. Detta komplex men tillgänglig fysiologiska system ger utmärkta möjligheter för utredning av endogena ion transportmekanismer i kombination med olika genetiska och beteendemässiga toolsets av Drosophila.
Motivet för detta protokoll var att beskriva ett genetiskt formbart system för att studera epitelial ion transport med potential för integration från cell till beteende och export av verktyg till andra modellsystem. Uttryck för pHerry10, en GEpHI som härrör från en fusion av gröna pH-känsliga Super ekliptikan pHluorin11,12 (SEpH) och röd pH-okänsliga mCherry13, i MTs möjliggör kvantifiering av H+ transport i enstaka MT celler genom den höga K+/nigericin kalibrering teknik14. Många ion transportörer flyttar H+ medel, fungerar kvantifiering av intracellulära pHjag som en funktionell representation av ion rörelse via en mängd olika transportörer. Drosophila MT modell systemet erbjuder även kraftfulla genetiska verktyg vävnadsspecifika transgenens15 och RNA interferens (RNAi)16 uttryck, som kan kombineras med cellular imaging och hela-orgel analyser17 , 18 , 19 i tubuli-funktionen för att skapa en robust verktygslåda med vertikal integration från molekyler till beteende. Detta står i kontrast till många andra protokoll för att bedöma epitelial biologi, som historiskt sett sådana mätningar har förlitat sig på intrikata och skrämmande mikro-dissektion, sofistikerad jonselektiva elektroder20,21, och dyra pH-känsliga färgämnen22 med restriktiva lastning krav och dålig cellulära specificitet i heterogena vävnader. GEpHIs har använts i stor utsträckning mäta pHjag i en mängd cell typer23. Tidiga verk utnyttjas den inneboende pH-känsligheten av grönt fluorescerande Protein (GFP) att övervaka pHjag i odlade epitelceller24 men de senaste två decennierna har sett GEpHIs som används i nervceller25, glia26, svampar27 , och växten celler28. Kombinationen av potentialen för cellulära inriktning genetisk konstruktioner genom de GAL4/UAS uttryck system15 och den Drosophila MT fysiologiska tillgänglighet gör detta till en idealisk förberedelse för utredningar av pHjag förordning och epitelial ion transport.
pHi förordning har studerats i årtionden och är avgörande för liv. MT preparatet erbjuder en robust modell att lära fysiologi av pHi förordning men också utföra sofistikerade utredningar av pHi förordning ex vivo och in vivo. Detta protokoll beskriver kvantifiering av H+ rörelse över basolateral membranet i epitelcellerna i Drosophila MT använder NH4Cl puls syra lastning teknik21, men som den pH-indikatorn är genetiskt kodade, kan dessa metoder och deras teoretiska ram tillämpas på någon beredning mottagliga för genmodifiering och live-imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td>Store at 4 &#176;C, can be reused.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter &#215; thickness 9 mm &#215; 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL622105</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Stands</td>
			<td>Harbor Freight Tools</td>
			<td>60501</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>PS-8S</td>
			<td>Any comparable perfusion system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Regulator</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0221</td>
			<td>Can be substituted as needed to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in sterile aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Inox Steel Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Can be substituted based on experimenter comfort.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>Fisher Scientific 08-757-100A</td>
			<td>Exact brand and size are unimportant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 x 25 mm Microscope Slides</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>2949-75X25</td>
			<td>Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0796</td>
			<td>Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td>Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Silicone Grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Flow Control Clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-869</td>
			<td>Available from multiple vendors, sterility not required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass rods, 5 mm diameter</td>
			<td>delphiglass.com</td>
			<td>9198</td>
			<td>Exact size is personal preference, multiple vendors available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Hydrophobic Pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7668</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5130</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x/0.45 Air Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-139</td>
			<td>Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Discovery.V8</td>
			<td>Any dissecting stereoscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>
			<td>Available from Romero Lab</td>
			<td></td>
			<td>First published: Citation 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromatic High Sensitivity Digital Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam 506 mono</td>
			<td>Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ909</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>CZ915</td>
			<td>Any GFP/FITC filer set can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Epifluoescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer Z.1</td>
			<td>Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Analysis Software</td>
			<td>Microcal</td>
			<td>Origin 6.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ 1.50i</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Zen 1.1.2.0</td>
			<td>Any software with comparable functionality can be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71960</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Slide Folder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-04</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-110-1231</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109BF</td>
			<td>Comparable items can be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 L Laboratory Ice Bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-210-129</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG; N-Methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL barrier pipette tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AV200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL variable volume pipette</td>
			<td>Gilson Incorporated</td>
			<td>PIPETMAN P200</td>
			<td>Available from multiple vendors.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical quantification of intracellular ph in drosophila melanogaster malpighian tubule epithelia with a fluorescent genetically-encoded ph indicator

Epitelial ion transport är avgörande för systemisk ion homeostas samt underhåll av viktiga cellulära elektrokemiska gradient. Intracellulära pH (pHjag) påverkas av många ion transportörer och därmed övervakning pHjag är ett användbart verktyg för att bedöma transportör aktivitet. Moderna genetiskt kodade pH-indikatorer-(GEpHIs) ger optiska kvantifiering av pHjag i intakta celler på cellulär och subcellulär nivå. Det här protokollet beskriver realtid kvantifiering av cellulära pHjag reglering i Malpighian tubuli (MTs) i Drosophila melanogaster genom ex vivo live-imaging av pHerry, en pseudo-proportionerlig GEpHI med ett pKen väl lämpad att spåra pH-förändringar i cytosolen. Extraherade vuxen fluga MTs består av morfologiskt och funktionellt distinkta delar av encellig skikt epitel, och kan fungera som en lättillgänglig och genetiskt lätthanterlig modell för utredning av epitelial transport. GEpHIs erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella pH-känsliga fluorescerande färgämnen och jonselektiva elektroder. GEpHIs kan märka olika cellpopulationer förutsatt lämpligt arrangören element är tillgängliga. Denna märkning är särskilt användbart i ex vivo, vivooch i situ preparat, som är till sin natur heterogen. GEpHIs möjliggöra kvantifiering av pHi i intakta vävnader över tiden utan behovet av upprepade dye behandling eller vävnad externalisering. Den främsta nackdelen med nuvarande GEpHIs är tendensen att aggregera i cytosoliskt inneslutningar som svar på vävnadsskada och konstruera över uttryck. Dessa brister, sina lösningar och de inneboende fördelarna med GEpHIs är visat i detta protokoll genom bedömning av basolateral proton (H+) transport i funktionellt distinkta huvudman och stjärnformade celler av extraherade fluga MTs. De tekniker och analys som beskrivs är lätt att anpassa till en mängd olika ryggradsdjur och ryggradslösa preparat och förfining av analysen kan skalas från undervisning labs intrikata fastställandet av ion flux via specifika transportörer.

Friska vävnader och korrekt identifiering av främre MTs är avgörande för framgång i detta protokoll. Under dissektion, bör man inte direkt beröring MTs och endast handtag dem genom urinledaren som gripande MTs direkt kommer att leda till brott (figur 4A– B). När MTs sopas platta in i bilden, tubuli får röras så lite som möjligt och överflödig motion undvikas eftersom detta kommer att skada encelliga epitelsk...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator at JoVE.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellulära ion transport kan ofta bedömas genom att övervaka intracellulära pH (pHjag). Genetiskt ger kodade pH-indikatorer (GEpHIs) optiska kvantifiering av intracellulära pH i intakta celler. Detta protokoll Detaljer kvantifiering av intracellulära pH genom cellulär ex vivo live-imaging av Malpighian tubuli av Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-proportionerlig kodade genetiskt pH-indikator.

Optiska kvantifiering av intracellulära pH i Drosophila melanogaster Malpighian tubuli epitel med ett fluorescerande genetiskt-kodade pH indikatorn

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissekering av Larvernas CNS i Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Övervakning av hjärtfunktion i Larvernas Drosophila melanogaster För fysiologiska studier

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Övervakning dynamiska förändringar i mitokondriernas kalciumnivåer under apoptos Använda en genetiskt kodade Kalcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Mätning av livslängden i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Mätning av vakuolär och cytosolisk pH<em&gt; In Vivo</em&gt; I jästcell Suspensioner

Vacuolar and  cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in  overall pH homeostasis. We describe  protocols for ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetiskt kodade molekylära sonder för att studera G-proteinkopplade receptorer

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Användning av Ramsay analys för att mäta vätskeutsöndringen och Ion Flux priser i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian tubuli

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Underhåll av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NOÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬Ãƒâ€šÃ‚Â¢ Signals in Single Cells

Tillämpning av genetiskt kodade fluorescerande kväveoxid (NO •) sonder, de geNOps, i realtid avbildning av NO • Signaler i enskilda celler

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optiska tvärsnittsdata muskel område bestämning av Drosophila Melanogaster vuxen indirekta flygmuskler

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...