Name: whole-cell patch-clamp recordings of isolated primary epithelial cells from the epididymis
Uploaded: 2017-08-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis at JoVE.com

본문에 대한 도움이되는 의견을 보내 주신 크리스토퍼 안토 스 박사님 께 감사드립니다. 이 작품은 위니 award에게 수여 된 상하이 테크 대학교 (ShanghaiTech University)로부터의 창업 자금과 중국 국립 자연 과학 재단 (NNSFC no. 31471370)의 자금 지원을 받았다.

모든 동물 실험은 지역 및 국제 요구 사항을 충족하는 ShanghaiTech University 기관 동물 사용 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됩니다. 1. 실험 동물 <ol><li> 8-12 주 사이에 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (~ 300-450 g)를 사용하십시오. 쥐의이 나이에, 정자는 cauda epididymides에 도착했습니다. </li></ol> 2. 쥐 Cauda Epididymides에서 상피 세포의 분리 참고 : 달?...

<ol>
	<li>Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Cell-Cell+Cross+Talk+in+the+Epididymis:+Control+of+Luminal+Acidification.">Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification.</a> J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).</li><li>Robaire, B., Hinton, B. T., Plant, T. M., Zeleznik, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+membrane+potentials+of+the+epididymis+in+rats+[proceedings].">Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings].</a> J Physiol. 263 (2), 280 (1976).</li><li>Lybaert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KATP+channel+subunits+are+expressed+in+the+epididymal+epithelium+in+several+mammalian+species.">KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species.</a> Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).</li></ol>

이 프로토콜에서, 쥐 cauda epididymides의 효소 분산 일관되게 건강한 상피 세포를 생산. 패치 - 클램프 실험을위한 부고환 상피 세포의 품질은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려있다. 예를 들어, 낮은 원심력 (30 xg)에서 세포 혼합물의 원심 분리는 정자 및 부고환 내강을 제거하는 데 중요합니다. 부고환 상피 세포는 세포 배양에서 정자가 있으면 건강하지 못하게된다. 또한, 해리 된 세포 혼합물...

남성 생식 기관의 부고환은 모자이크 상피 세포 층이 늘어서있는 기관입니다. 다른 상피 조직에서와 마찬가지로, 주요 세포, 클린 세포, 기저 세포 및 면역계 및 림프계로부터의 세포를 포함하는 부고환 상피의 다양한 세포 유형은 세관 최전선에서 장벽으로서 기능하도록 협조 된 방식으로 작용하며, 정자 성숙 및 생리학을위한 세포 지원 1 , 2 , 3 . 따라서 이러한 상피 세포는 재생산 건강에 필수적인 역할을합니다. 상피 세포는 일반적으로 전위가없는 Na + 또는 Ca 2+ 채널이 없기 때문에 탈분극 자극에 반응하여 모든 또는 전혀 작용하지 않는 전위를 생성 할 수없는 비 흥분성 세포로 간주됩니다 4 , 5 . 그러나, 상피 세포는 유니분비 및 영양소 운반과 같은 전문화 된 생리적 인 역할을 조절하는 이온 채널 및 운반자 세트 6 . 따라서 상이한 상피 세포는 특징적인 전기적 특성을 갖는다. 예를 들어, 주요 세포는 유체 및 염화물 수송을위한 CFTR을 표현하고 칼슘 재 흡수를위한 TRPV6를 발현하지만, 맑은 세포는 내강 산성화 1 , 7 , 8 , 9에 대해 양성자 펌프 V-ATPase를 발현합니다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특징을 조절하는 일부 전달자와 이온 채널이보고되었지만 부고환 상피 세포의 기능적 성질은 아직 많이 밝혀지지 않았다 10 , 11 , 12 , 13 . ㅁㅁ올 셀 패치 - 클램프 기록은 흥분성 및 비 흥분성 세포의 본질 특성을 조사하기위한 잘 확립 된 기술이며 특히 이종 세포 샘플에서 주로 해리 된 세포의 기능을 연구하는데 유용합니다. 전압 클램프는 단일 막 14 및 15 의 수동 막 특성 및 이온 전류를 측정하는 데 사용됩니다. 수동 막 특성에는 입력 저항 및 커패시턴스가 포함됩니다. 전자의 매개 변수는 고유 멤브레인 컨덕턴스를 나타내지 만, 후자는 세포막의 표면적 (이온 채널 및 운반자가있는 인지질 이중층, 세포 외 및 세포 내 매체를 분리하는 얇은 절연체로 사용됨)을 의미합니다. 막 커패시턴스는 세포막의 표면적에 직접적으로 비례합니다. 입력 저항에 의해 반사되는 멤브레인 저항과 함께 멤브레인 시정 수 which는 세포막 전위가 이온 채널 전류의 흐름에 얼마나 빨리 반응 하는지를 나타낼 수 있습니다. 이와 관련하여, 세포에 적용된 일련의 전압 단계로부터의 전류 응답 특성을 조합함으로써, 생물 물리학 적 동력학 및 세포의 특성이 15 , 16 , 17 , 18로 결정된다 . 본 논문에서는 rat cauda epididymis로부터 상피 세포를 분리하는 절차와 whole cell patch-clamp를 사용하여 해리 된 세포 혼합물에서 각기 다른 세포 유형의 막 특성을 측정하는 단계를 설명한다. 우리는 부고환의 주요 세포가 명확한 막 전기 생리학 적 성질을 나타내며 컨덕턴스가 다른 세포 유형으로부터 쉽게 확인 될 수 있음을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Instrument of AXON system</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:149px;">Computer controlled amplifier</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices - Axon</td>
			<td style="width:139px;">Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Digital Acquisition system</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices - Axon</td>
			<td style="width:139px;">Digidata 1550 converter</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">BX-61WI</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:139px;">MPC-325</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Recording chamber and in-line Heater</td>
			<td style="width:129px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:139px;">TC-324C</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Instrument of HEKA system</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:129px;">Harvard Bioscience - HEKA</td>
			<td style="width:139px;">EPC-10 USB double</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Microscope</td>
			<td style="width:129px;">Olympus</td>
			<td style="width:139px;">IX73</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:139px;">MPC-325</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Recording chamber and in-line Heater</td>
			<td style="width:129px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:139px;">TC-324C</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Other Instrument</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:139px;">P-1000</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:149px;">Recording Chamber</td>
			<td style="width:129px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:139px;">RC-26G or homemade chamber</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:149px;">Borosilicate capillary glass with filament</td>
			<td style="width:129px;">Sutter Instrument / Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:139px;">BF150-86-10</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Vibration isolation table</td>
			<td style="width:129px;">TMC&#160;</td>
			<td style="width:139px;">63544</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Digital Camare</td>
			<td style="width:129px;">HAMAMASTU</td>
			<td style="width:139px;">ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Reagents for isolation</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:129px;">Gibco</td>
			<td style="width:139px;">22400089</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:129px;">Gibca</td>
			<td style="width:139px;">15140112</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">IMDM</td>
			<td style="width:129px;">ATCC&#160;</td>
			<td style="width:139px;">30-2005&#160;</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">IMDM</td>
			<td height="22" style="height:22px;width:129px;">Gibco</td>
			<td style="width:139px;">C12440500BT</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">C0130</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:129px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">C6885</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:149px;">5-&#945;-dihydrotestosterone</td>
			<td style="width:129px;">Medchemexpress</td>
			<td style="width:139px;">HY-A0120</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:129px;">capricorn</td>
			<td style="width:139px;">FBS-12A</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:149px;">Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">KCl, 35mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900068</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:149px;">MgCl2 &#183; 6H2O, 2mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">M2393</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">EGTA, 0.1mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">E4378</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">HEPES, 10mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900477</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">K-gluconate, 100mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">P-1847</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Mg-ATP, 3mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/Various</td>
			<td style="width:139px;">A9187</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:149px;">The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">NaCl, 140mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900058</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">KCl, 4.7mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900068</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:149px;">CaCl2, 2.5mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900266</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:149px;">MgCl2 &#183; 6H2O, 1.2mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">M2393</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:149px;">NaH2PO4, 1.2mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900060</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">HEPES, 10mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900477</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">Glucose, 10mM</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900392</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">For pH adjustment</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">NaOH</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">V900797</td>
			<td style="width:207px;">Purity &#62;=97%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:149px;">KOH</td>
			<td style="width:129px;">Sigma/various</td>
			<td style="width:139px;">60371</td>
			<td style="width:207px;">Purity &#62;=99.99%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings of isolated primary epithelial cells from the epididymis

부고환은 정자 성숙과 생식 건강에 필수적인 기관입니다. 부고환 상피 세포는 분자와 형태 학적 특징뿐 아니라 생리 학적 특성에서도 뚜렷한 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 차이점은 부고환 내강에서 사후 정자의 발달에 필요한 미세 환경을 함께 구성하는 다양한 기능을 반영한다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특성에 대한 이해는 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서 정자 및 생식 건강에서의 기능을 밝히는데 중요하다. 그들의 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 부고환 상피 세포는 단일 세포의 세포 성질 및 막 특성을 측정하기위한 도구 인 패치 클램프 기술을 사용하여 연구 할 수있다. 여기서 우리는 세포 분리 및 전체 세포 패치 클램프 기록 방법에 대해 설명합니다쥐 cauda epididymides에서 일차 분리 된 상피 세포의 전기적 특성을 확인하십시오.

래트의 카우 epididymides에서 상피 세포의 분리 기술의 효소 분해 과정은 이전 연구 9, 12에서 수정 된 프로토콜이다. 이 방법은 90 % 이상의 생존력과 표면 수포 나 부어 오름이없는 단일 세포의 혼합물을 생성합니다. 이질적인 세포 혼합물은 이전에 설명한 바와 같이 주로 주요 세포, 맑은 세포 및 기저 세포로 구성됩니다 <sup class="...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

연구

발생학

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Cultivate Primary Nasal Epithelial Cells from Children and Reprogram into Induced Pluripotent Stem Cells

어린이에서 차 비강 상피 세포를 배양 및 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

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체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...