Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور مارك بيشانسكي (I-ستيم، إيفري، فرنسا)، لتقديمه IMR90-هبسس؛ الدكتور جيوفانا لازاري والدكتورة سيلفيا كوليوني (أفانتي سرل، كريمونا، إيطاليا)؛ الدكتور سيمون هوبت (جامعة بون، ألمانيا)؛ الدكتور تيزيانا سانتيني (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا، روما)، لتقديم المشورة بشأن تقييم تلطيخ المناعي. الدكتور بينيدتا أكوردي، د. إيلينا رامبازو، والدكتور لوكا بيرسانو (جامعة بادوا، إيطاليا)، لمساهماتهم في تحليل ربا والتحقق من الأجسام المضادة. التمويل: تم دعم هذا العمل من قبل المشروع الممول من الاتحاد الأوروبي &quot;سر &amp; توكس&quot; (اتفاق منحة رقم 266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا العمل بروتوكول قوي وسريع نسبيا للتمييز بين IMR90-هبسس في الخلايا العصبية ما بعد الانقسامية والخلايا الدبقية. نشرت سابقا بروتوكولات التمايز الخلايا العصبية على أساس هيسس و هيبسس عادة ما تسفر عن نسب عالية من السلائف العصبية 25 و 26 وعدد كبير من الخلايا المستهدفة الخلايا العصبية 27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 . على نحو مماثل، بروتوكول التمايز الموصوفة هنا هو مناسبة لتوليد الثقافات غير المتجانسة من غابايرجيك، غلوتاماترجيك، والخلايا العصبية الدوبامين، جنبا إلى جنب مع الدبقية ونسبة منفصلة من نستين + الخلايا. ويشير وجود غلوتاماترجيك (~ 35-42٪) و غابايرجيك (~ 15-20٪) الخلايا العصبية أنهذه الثقافة تمتلك الدماغ الأمامي، والميزات القشرية مثل، ووجود عدد منفصل من الخلايا العصبية الدوبامين (~ 13-20٪) قد تشير أيضا إلى خصوصية الدماغ المتوسط. بالإضافة إلى ذلك، فإن استمرار نسبة متواضعة من نستين + الخلايا قد تكون مناسبة لدراسة تكوين الخلايا العصبية والآثار المحتملة للمواد الكيميائية على نسس، التي تقتصر أساسا على كل من الحصين والمنطقة تحت البطين (سفز) من الدماغ الأمامي 34 . المزيد من التحليلات إمونوسيتوشيميكال والتعبير الجيني من شأنه أن يساعد على تحديد أفضل خصوصية إقليمية للمشتقات الخلية متباينة. أهم خطوتين في بروتوكول التمايز الموصوفة في هذه الوثيقة هي: (1) قطع مستعمرات هيبسك إلى شظايا متجانسة (وهو أمر حاسم لتوليد إبس مع أحجام متجانسة) و (إي) قطع الهياكل العصبية السرطانية (الورود ) ل نسك التمايز، الأمر الذي يتطلب مهارة يدوية كبيرةوالدقة لتجنب جمع الأديم المتوسط ​​وخلايا الأديم التي قد تقلل من نسب الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها على التمايز. فمن الأهمية بمكان لوصف المظاهر من الخلايا أثناء التوسع (كمستعمرات غير متمايزة أو نسس) وخلال جميع خطوات التمايز. على وجه الخصوص، يجب أن تظهر ملامح التعبير الجيني والبروتين من مشتقات الخلايا العصبية / الدبقية أوبريغولاتيون وتنشيط مسارات الإشارات العصبية ذات الصلة، في حين أن التعبير عن علامات تعدد القدرات يجب أن تنخفض. يمكن أن يكون توليد إبس والمشتقات نيوروكتوديرمال (وريدات) تحديا يدويا وعرضة للتغير. لهذا السبب، وضعنا بروتوكول لتوسيع نسس المستمدة من روزي ومزيد من التمايز في الخلايا العصبية / الدبقية. القيود المحتملة لهذا البروتوكول التمايز هي أساسا (1) نسبة منخفضة نسبيا من د(2) عدم وجود وظائف الشبكة العصبية الناضجة (كما يتضح من عدم وجود رشقات نارية). وعلاوة على ذلك، يمكن أن مجموعات فرعية فرعية محددة من الخلايا النجمية تعمل أسلاف الأولية أو نسس 35 . في حين لم يتم ملاحظة نستين / غفاب خلايا إيجابية مزدوجة في هذه الخلية الخلوية متباينة (لا تظهر البيانات)، فمن المفترض أن الخلايا + غفاب في هذه الثقافات المختلطة هي الأسلاف نجمي والنجمية. ومن المعقول أنه من خلال تمديد وقت التمايز، قد يزيد عدد الخلايا النجمية، ويمكن مورفولوجيا تصبح أكثر نضجا، كما أشير من قبل الأعمال السابقة من مجموعة تشانغ 36 ، 37 . وفي النموذج الجديد لاختبار السمية، تكتسب المعارف المتعلقة بالاضطرابات الناجمة عن المواد الكيميائية في المسارات البيولوجية أهمية قصوى عند تقييم الشدائد الكيميائية. ولذلك، ينبغي أن تكون أنظمة الاختبار في المختبر قادرة علىتربط الآثار الضارة باضطرابات مسارات التشوير، وفقا لمفهوم مسار النتائج المعاكسة (أوب). كدليل على مفهوم، روتنون يمكن استخدامها لتقييم تفعيل مسار Nrf2، التي تشارك في الدفاع الخلوي ضد الأكسدة أو الإجهاد الكهربي 38 ، والإجهاد التأكسدي هو الحدث الرئيسي المهم والمشترك في مختلف العمليات التشغيلية ذات الصلة ل السمية العصبية التنموية والكبار 39 . يجب أن يستحث روتينون تفعيل مسار Nrf2، والذي يمكن أن يبرهن عليه البروتين النووي Nrf2، وزيادة التعبير عن الانزيمات Nrf2 المستهدفة، بما في ذلك NQO1 و SRXN1. وقد وجد أن روتنون يدفع زيادة تعتمد على الجرعة من مستويات البروتين غفاب، مما يدل على تفعيل الخلايا النجمية 40 ، 41 . روتينون أيضا يقلل من عدد من الدوبامين (ث + ) الخلايا، وهو ما يتفق مع بريفيأوس في المختبر وفي الجسم الحي الدراسات التي تبين روتينون تعتمد على موت الخلايا الدوبامين، لأن هذا النوع من الخلايا العصبية حساسة بشكل خاص للإجهاد التأكسدي 21 ، 22 ، 23 . في الختام، هذه هيبسك المستمدة الخلايا العصبية و الدبقية نموذج زراعة الخلايا هو أداة قيمة لتقييم الآثار السمية العصبية للمواد الكيميائية التي تثير الإجهاد التأكسدي مما أدى إلى تنشيط مسار Nrf2. كما يسمح هذا البروتوكول التمايز لتوليد الثقافات المختلطة للخلايا العصبية (غابايرجيك، الدوبامين، والخلايا العصبية غلوتاماترجيك) والنجمية، فإنه قد يثبت مناسبة لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية والدبقية في الظروف الفسيولوجية والمرضية، كما هو الحال في الأمراض العصبية التنكسية ( على سبيل المثال، مرض باركنسون). وعلاوة على ذلك، فإن وجود نسبة كبيرة من نسس قد تساعد على تقييم الآثار المحتملة للمواد الكيميائية على بروغ العصبيالتي يعرف أنها الهدف الرئيسي للطفرات التي يسببها كيميائيا أو الالتهابات الفيروسية 42 .

وقد توخى تقرير مجلس البحوث الوطني الأمريكي ( 1) نموذجا جديدا لاختبار السمية يتم فيه نقل اختبار السمية التنظيمية من نهج يعتمد على التغيرات المظهرية التي لوحظت في الحيوانات إلى نهج يركز على المقايسات الآلية في المختبر باستخدام الخلايا البشرية. وقد تمثل مشتقات الخلايا الجذعية المحفزة (بسك) بدائل لنماذج الخلايا السرطانية، حيث أن الخلايا التي تم الحصول عليها قد تشبه بشكل وثيق الظروف الفسيولوجية للأنسجة البشرية وتوفر أدوات أكثر صلة لدراسة التأثيرات الضارة الناجمة عن المواد الكيميائية. إن النوعين الرئيسيين من ثقافات ال بسك التي تعد أكثر واعدة لاختبار السمية هي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسس) والخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس)، والتي تستخدم حاليا على نطاق واسع في مجالات البحوث الأساسية والطب التجديدي 2 ، 3 . ويمكن الآن الاستفادة من هذه الخبرة لتطوير فئة جديدة من السميةجيكال في المختبر الاختبارات التي تهدف إلى تحديد مسارات الفسيولوجية المضطربة المعنية مع تطور الآثار السلبية في الجسم الحي . ومع ذلك، من غير المرجح أن تقبل جميع الدول الأعضاء في الاتحاد الأوروبي والبلدان من جميع أنحاء العالم طرق الاختبار لتقييمات السلامة التنظيمية على أساس هيسس بسبب الشواغل الأخلاقية المحتملة والسياسات التشريعية الوطنية المتنوعة التي تنظم استخدام الخلايا المستمدة من الجنين. هبسس خصائص حصة مماثلة ل هيسس 4 ، 5 وعقد إمكانات كبيرة لطرق في المختبر ، سواء لتحديد الأهداف العلاجية، فضلا عن تقييمات السلامة. وبالإضافة إلى ذلك، التكنولوجيا هيبسك يخفف من القيود من تجمع المانحين محدود والشواغل الأخلاقية المرتبطة الخلايا المستمدة من الجنين. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية ل هبسس في الدليل على أن هذه الخلايا يمكن أن تولد بشكل متكرر مجموعة كبيرة من مشتقات الخلايا ذات الصلة السمية،مع الخصائص والاستجابات نموذجية من الأنسجة البشرية. وتستخدم عادة مستويات محددة مسبقا من علامات مختارة لتوصيف السكان الخلية بعد عملية التمايز وتقديم رؤى في استقرار عملية التمايز. قيمت الأعمال السابقة مدى ملاءمة هيبس لتوليد ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والدبقية ولتقييم آثار روتينون، وهو مثبط للميتوكوندريا الجهاز التنفسي معقدة I، على تفعيل مسار Nrf2، منظم رئيسي للآليات الدفاع المضادة للأكسدة في العديد من أنواع الخلايا 6 ، 7 . يصف هذا العمل بروتوكول يستخدم للتمايز من هبسس إلى الثقافات العصبية وبلقية مختلطة، وتوفير تفاصيل عن مسارات الإشارات (الجينات ومستوى البروتين) التي يتم تفعيلها على التمايز العصبية / الدبقية. بالإضافة إلى ذلك، يظهر العمل نتائج تمثيلية توضح كيفية ذلكيمكن استخدام نموذج الخلايا العصبية و الدبقية المستمدة من هيبسك لتقييم تنشيط الإشارات Nrf2 الناجم عن العلاج الحاد (24 ساعة) مع روتينون، مما يسمح بتقييم تحريض الإجهاد التأكسدي. وقد أعيد برمجة الخلايا الليفية IMR90 في هبسس في I-ستيم (فرنسا) عن طريق التنبيغ الفيروسي من 2 عوامل النسخ (Oct4 و Sox2) باستخدام ناقلات بميغ 6 . ويمكن أيضا تطبيق نماذج هيبسك مماثلة. البروتوكولات الموصوفة أدناه تلخص جميع مراحل تمايز هبسس في الخلايا الجذعية العصبية (نسس) وكذلك إلى الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية ما بعد الانقسامية والخلايا الدبقية (الخطوات 1 و 2، انظر أيضا موقع إورل إكفام دبالم على وصف مفصل ل البروتوكول) 8 . يتم تفصيل بروتوكول إضافي للعزل، والتوسع، الحفظ بالتبريد، ومزيد من التمايز نسس في الخلايا العصبية مختلطة والخلايا الدبقية في الخطوات 3 و 4 (راجع أيضا إلى إورل إكفام دبالم نحنبسيت للحصول على وصف مفصل لهذا البروتوكول) 9 . وتصف الخطوة 5 التحليلات التي يمكن القيام بها لتقييم الهوية المظهرية للخلايا خلال مراحل عديدة من الالتزام والتمايز.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

يمكن الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان التفريق في أنواع الخلايا المختلفة التي يمكن تطبيقها على المقايسات سمية في المختبر البشري. ميزة رئيسية هي أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية لإنتاج الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يتجنب القضايا الأخلاقية والتشريعية المتعلقة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسس). يمكن توسيع هبسس وتمييزها بكفاءة في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية والدبقية، بمثابة نظم اختبار لاختبار السمية، وعلى وجه الخصوص، لتقييم مسارات مختلفة تشارك في العصبية. يصف هذا العمل بروتوكول لتمايز هيبس في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والدبقية. يتم تعريف مسارات الإشارات التي يتم تنظيمها و / أو تفعيلها من قبل التمايز العصبية. هذه المعلومات حاسمة لتطبيق نموذج الخلية على النموذج الجديد اختبار السمية، والتي يتم تقييم المواد الكيميائية على أساس قدرتها على بيرترب مسارات بيولوجية. وكدليل على المفهوم، تم استخدام روتنون، وهو مثبط للميتوكوندريا المعقدة الجهاز التنفسي الأول، لتقييم تفعيل مسار الإشارات Nrf2، وهو منظم رئيسي لآلية الدفاع الخلوية المضادة للأكسدة الاستجابة للعنصر (أر) المدفوعة ضد الإجهاد التأكسدي .

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

وتعتبر الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) أداة قوية للكشف عن المخدرات والكيمياء ولتطوير نماذج جديدة في المختبر لاختبار السمية، بما في ذلك السمية العصبية. هنا، ويرد وصف بروتوكول مفصل للتمايز هيبس في الخلايا العصبية والدبقية.

بروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية المحفزة البشرية المستحثة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والجلد للاختبار العصبي

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

السريع العصبية تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لقياس نشاط الشبكة على المصفوفات الدقيقة الكهربائي

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...