Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Die Autoren danken Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankreich) für die Bereitstellung der IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari und Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italien); Dr. Simone Haupt (Universität Bonn, Deutschland); Dr. Tiziana Santini (Italienisches Institut für Technologie, Rom), für die Beratung bei der Immunfluoreszenzfärbung; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo und Dr. Luca Persano (Universität Padua, Italien) für ihre Beiträge zur RPPA-Analyse und Antikörper-Validierung. Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch das von der EU finanzierte Projekt &quot;SCR &amp; Tox&quot; (Fördervereinbarung Nr. 266753) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Arbeit beschreibt ein robustes und relativ schnelles Protokoll für die Differenzierung von IMR90-hiPSCs in post-mitotische Neuronen und Gliazellen. Bisher veröffentlichte neuronale Differenzierungsprotokolle auf der Basis von hESCs und hiPSCs ergeben in der Regel hohe Prozentsätze der neuronalen Vorläufer 25 , 26 und eine signifikante Anzahl von neuronalen Zielzellen 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analog dazu eignet sich das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll zur Erzeugung heterogener Kulturen von GABAergischen, glutamatergen und dopaminergen Neuronalzellen zusammen mit Glia und einem diskreten Anteil an Nestin + Zellen. Die Anwesenheit von glutamatergen (~ 35-42%) und GABAergischen (~ 15-20%) neuralen Zellen deutet darauf hin, dassDiese Kultur besitzt Vorhirn, kortikale Merkmale und das Vorhandensein einer diskreten Anzahl von dopaminergen Neuronen (~ 13-20%) kann auch auf die Mittelhirnspezifität hindeuten. Darüber hinaus kann sich die Dauer eines bescheidenen Anteils an Nestin + Zellen als geeignet für das Studium der Neurogenese und die möglichen Auswirkungen von Chemikalien auf NSCs erweisen, die in erster Linie sowohl auf den Hippocampus als auch auf die subventrikuläre Zone (SVZ) des Vorderhirns beschränkt sind. Weitere immunzytochemische und Genexpressionsanalysen würden dazu beitragen, die regionale Spezifität der differenzierten Zellderivate besser zu definieren. Die beiden kritischsten Schritte des in diesem Dokument beschriebenen Differenzierungsprotokolls sind: (i) das Schneiden von hiPSC-Kolonien in homogene Fragmente (die für die Erzeugung von EBs mit homogenen Größen kritisch sind) und (ii) das Schneiden von neuroektodermalen Strukturen (Rosetten) ) Für die NSC-Differenzierung, die eine beträchtliche manuelle Fertigkeit erfordertUnd Präzision, um das Sammeln von mesodermalen und endodermalen Zellen zu vermeiden, die die Proportionen von Neuronen und Gliazellen, die bei der Differenzierung erhalten werden, verringern können. Es ist entscheidend, die Phänotypen der Zellen während der Expansion (als undifferenzierte Kolonien oder NSCs) und während aller Differenzierungsschritte zu charakterisieren. Insbesondere sollten die Gen- und Protein-Expressionsprofile der neuronalen / glialen Zellderivate eine Regulierung und Aktivierung von neuronbezogenen Signalwegen aufweisen, während die Expression von Pluripotenzmarkern verringert werden sollte. Die Erzeugung von EBs und neuroektodermalen Derivaten (Rosetten) kann manuell anspruchsvoll und anfällig für Variabilität sein. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll für die Erweiterung von Rosetten-abgeleiteten NSCs und deren weitere Differenzierung in neuronale / gliale Zellen entwickelt. Mögliche Einschränkungen dieses Differenzierungsprotokolls sind hauptsächlich (i) der relativ geringe Prozentsatz von dIfferentiierten Gliaderivaten und (ii) dem Mangel an reifen neuronalen Netzwerkfunktionen (wie durch den Mangel an Bursts gezeigt). Darüber hinaus können spezifische Subpopulationen von Astrozyten als primäre Vorläufer oder NSCs 35 fungieren. Während in dieser differenzierten Zellkultur (Daten nicht gezeigt) Nestin / GFAP-Doppel-Positiv-Zellen beobachtet wurden, wird vermutet, dass die GFAP + -Zellen in diesen Mischkulturen astrozytische Vorläufer und Astrozyten sind. Es ist plausibel, dass durch die Verlängerung der Zeit der Differenzierung die Anzahl der Astrozyten ansteigen kann und ihre Morphologie reifer werden kann, wie bereits in früheren Arbeiten von Zhangs Gruppe 36 , 37 angedeutet. Im neuen Toxizitätstest-Paradigma ist das Wissen über chemisch-induzierte Störungen der biologischen Wege von größter Bedeutung bei der Beurteilung der chemischen Belastbarkeit. Daher sollten in vitro Testsysteme in der Lage sein,Beziehen sich auf Nebenwirkungen auf Störungen der Signalwege, nach dem Konzept des negativen Ausgangspfades (AOP). Als Proof-of-Concept kann Rotenon verwendet werden, um die Aktivierung des Nrf2-Weges zu beurteilen, der an der zellulären Abwehr gegen oxidativen oder elektrophilen Stress 38 beteiligt ist, und oxidativer Stress ist ein wichtiges und gemeinsames Schlüsselereignis in verschiedenen AOPs, Entwicklung und erwachsene Neurotoxizität 39 . Rotenon sollte die Aktivierung des Nrf2-Weges hervorrufen, was durch die nukleare Translokation von Nrf2-Protein und eine erhöhte Expression von Nrf2-Ziel-Enzymen, einschließlich NQO1 und SRXN1, nachgewiesen werden kann. Es wurde gefunden, dass Rotenon eine dosisabhängige Erhöhung der GFAP-Proteinspiegel induziert, was auf die Astrozytenaktivierung 40 , 41 hindeutet. Rotenon verringert auch die Anzahl der dopaminergen (TH + ) - Zellen, die mit der Prävention übereinstimmtIn vitro und in vivo Studien, die den Rotenon-abhängigen dopaminergen Zelltod zeigen, da diese Art von Neuron besonders empfindlich gegenüber oxidativem Stress ist 21 , 22 , 23 . Abschließend ist dieses hiPSC-abgeleitete neuronale und gliale Zellkulturmodell ein wertvolles Instrument, um die neurotoxischen Effekte von Chemikalien zu beurteilen, die oxidativen Stress hervorrufen, was zu einer Aktivierung von Nrf2 führt. Da dieses Differenzierungsprotokoll die Erzeugung von gemischten Kulturen von neuronalen Zellen (GABAergische, dopaminerge und glutamaterge Neuronen) und Astrozyten ermöglicht, kann es sich als geeignet erweisen, das Übersprechen zwischen Neuronen und Glia in physiologischen und pathologischen Zuständen zu untersuchen, wie bei neurodegenerativen Erkrankungen ( ZB Parkinson-Krankheit). Darüber hinaus kann die Anwesenheit eines signifikanten Anteils an NSCs dazu beitragen, die möglichen Auswirkungen von Chemikalien auf neuronales Prog zu bewertenEnitoren, von denen bekannt ist, dass sie das Hauptziel von chemisch induzierten Mutationen oder Virusinfektionen sind 42 .

Der US-National Research Council Report 1 stellte ein neues Toxizitätstest-Paradigma vor, in dem die regulatorische Toxizitätstests von einem Ansatz verlagert würden, der sich auf phänotypische Veränderungen bezieht, die bei Tieren beobachtet wurden, auf einen Ansatz, der sich auf mechanistische in vitro- Assays unter Verwendung menschlicher Zellen konzentriert. Pluripotenten Stammzellen (PSC) -Derivate können Alternativen zu Krebszellmodellen darstellen, da die erhaltenen Zellen den physiologischen Zuständen menschlicher Gewebe genauer ähneln und relevantere Instrumente liefern können, um chemisch induzierte Nebenwirkungen zu untersuchen. Die beiden wichtigsten Arten von PSC-Kulturen, die für Toxizitätstests am häufigsten sind, sind menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), die derzeit in den Bereichen Grundlagenforschung und regenerative Medizin weit verbreitet sind 2 , 3 . Diese Expertise kann nun für die Entwicklung einer neuen Klasse von Toxicolo genutzt werdenIn-vitro- Tests, die darauf abzielen, die gestörten physiologischen Wege zu identifizieren, die mit der Entwicklung von nachteiligen Wirkungen in vivo verbunden sind. Allerdings wäre es unwahrscheinlich, dass Prüfverfahren für regulatorische Sicherheitsbewertungen auf der Grundlage von HESCs von allen EU-Mitgliedstaaten und von Ländern weltweit aufgrund möglicher ethischer Bedenken und verschiedener nationaler Gesetzgebungspolitik, die die Verwendung von Embryo-abgeleiteten Zellen regeln, akzeptiert werden. HiPSCs teilen sich ähnliche Merkmale wie hESCs 4 , 5 und halten großes Potenzial für in vitro Methoden, sowohl für die Identifizierung von therapeutischen Zielen als auch für Sicherheitsbewertungen. Darüber hinaus verringert die hiPSC-Technologie die Einschränkungen eines begrenzten Spender-Pools und die ethischen Bedenken, die mit Embryo-abgeleiteten Zellen verbunden sind. Eine große Herausforderung für hiPSCs ist die Demonstration, dass diese Zellen reproduzierbar einen signifikanten Bereich von toxikologisch relevanten Zellderivaten erzeugen können,Mit Merkmalen und Reaktionen, die für menschliche Gewebe typisch sind. Vordefinierte Ebenen der ausgewählten Marker werden im Allgemeinen verwendet, um Zellpopulationen nach dem Differenzierungsprozess zu charakterisieren und Einblicke in die Stabilität des Differenzierungsprozesses zu geben. Bisherige Arbeiten beurteilten die Eignung von hiPSCs, um gemischte Kulturen von neuronalen und gliazellen zu erzeugen und die Effekte von Rotenon, einem Inhibitor des mitochondrialen Atmungskomplexes I, auf die Aktivierung des Nrf2-Weges zu beurteilen, ein Schlüsselregulator für antioxidative Abwehrmechanismen in Viele Zelltypen 6 , 7 . Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das für die Differenzierung von hiPSCs in gemischte neuronale und gliale Kulturen verwendet wird, wobei Details über die Signalwege (Gen und Protein-Ebene) bereitgestellt werden, die bei der neuronalen / glialen Differenzierung aktiviert werden. Darüber hinaus zeigt die Arbeit repräsentative Ergebnisse, die zeigen, wie diesDas hiPSC-abgeleitete neuronale und glialzellenmodell kann verwendet werden, um die durch akute (24-h) Behandlung mit Rotenon induzierte Nrf2-Signalisierungsaktivierung zu beurteilen, was die Beurteilung der oxidativen Stressinduktion ermöglicht. IMR90-Fibroblasten wurden bei der I-Stem (Frankreich) durch die virale Transduktion von 2 Transkriptionsfaktoren (Oct4 und Sox2) unter Verwendung von pMIG-Vektoren 6 in hiPSCs umprogrammiert. Es können auch analoge hiPSC-Modelle angewendet werden. Die nachstehend beschriebenen Protokolle fassen alle Stufen der Differenzierung von HiPSCs in neuronale Stammzellen (NSCs) und weiter in gemischte Kulturen von post-mitotischen Neuronen und Gliazellen zusammen (Schritte 1 und 2, siehe auch die EURL ECVAM DBALM Website für eine detaillierte Beschreibung von Das Protokoll) 8 . Ein zusätzliches Protokoll für die Isolierung, Expansion, Kryokonservierung und weitere Differenzierung von NSCs in gemischte Neuronen und Gliazellen ist in den Schritten 3 und 4 beschrieben (siehe auch EURL ECVAM DBALM wirBsite für eine detaillierte Beschreibung dieses Protokolls) 9 . Schritt 5 beschreibt die Analysen, die getan werden können, um die phänotypische Identität der Zellen während der verschiedenen Stadien der Verpflichtung und Differenzierung zu beurteilen.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

Menschliche pluripotenten Stammzellen können in verschiedene Zelltypen differenzieren, die auf human- in-vitro- Toxizitäts-Assays angewendet werden können. Ein wichtiger Vorteil ist, dass die Neuprogrammierung von somatischen Zellen zur Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) die ethischen und legislativen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) vermeidet. HiPSCs können erweitert und effizient in verschiedene Arten von neuronalen und glialen Zellen differenziert werden, die als Testsysteme für die Toxizitätstests dienen und insbesondere für die Bewertung verschiedener Wege, die an der Neurotoxizität beteiligt sind. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Differenzierung von hiPSCs in gemischte Kulturen von neuronalen und gliazellen. Die Signalisierungswege, die durch neuronale Differenzierung reguliert und / oder aktiviert werden, werden definiert. Diese Information ist entscheidend für die Anwendung des Zellmodells auf das neue Toxizitätstestparadigma, in dem Chemikalien auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, peBiologische Wege umgehen. Als Nachweis des Konzepts wurde Rotenon, ein Inhibitor des mitochondrialen Atmungskomplexes I, zur Aktivierung des Nrf2-Signalweges, eines Schlüsselregulators des Antioxidans-Response-Element- (ARE) -getriebenen zellulären Abwehrmechanismus gegen oxidativen Stress, eingesetzt .

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Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gelten als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Arzneimittel- und Chemikalien-Screening und für die Entwicklung neuer in vitro- Modelle für die Toxizitätstests, einschließlich Neurotoxizität. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von hiPSCs in Neuronen und Glia beschrieben.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...