Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר מארק Peschanski (I-Stem, Évry, צרפת), על מתן IMR90-hiPSCs; ד&quot;ר ג&#39;ובאנה לזארי וד&quot;ר סילביה קולוני (Avantea srl, קרמונה, איטליה); ד&quot;ר סימון האפט (אוניברסיטת בון, גרמניה); ד&quot;ר Tiziana Santini (המכון האיטלקי לטכנולוגיה, רומא), למתן ייעוץ על הערכת מכתים immunofluorescence; ד&quot;ר בנדטה אקורדי, ד&quot;ר אלנה רמפאצו וד&quot;ר לוקה פרסאנו (אוניברסיטת פאדובה, איטליה), על תרומתם לניתוח ה- RPPA ולאימות הנוגדן. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי במימון פרויקט &quot;SCR &amp; Tox&quot; (הסכם מענק מס &#39;266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול חזק ומהיר יחסית עבור בידול של IMR90-hiPSCs לתוך נוירונים פוסט מיטוטי ותאי גלייה. פורסמו בעבר פרוטוקולים בידול נוירונים המבוססים על hESCs ו hiPSCs בדרך כלל תשואה אחוזים גבוהים של מבשרי עצבים 25 , 26 ו מספר משמעותי של תאים היעד העצבית 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . באופן אנלוגי, פרוטוקול ההבחנה המתואר כאן מתאים ליצירת תרבויות הטרוגניות של תאים עצביים של GABAergic, glutamatergic ו- dopaminergic, יחד עם גליה ושיעור דיסקרטי של תאי Nestin + . נוכחות של תאים עצביים גלוטמטריים (~ 35-42%) ו GABAergic (~ 15-20%) עצביים עולה כילתרבות זו יש תכונות של המוח הקדמי, כמו קליפת המוח, ונוכחות של מספר דיסקרטי של נוירונים דופאמינרגיים (~ 13-20%) עשויה גם להצביע על סגוליות של המוח התיכון. בנוסף, הקביעות של אחוז קטן של תאים + nestin עשוי להוכיח מתאים לחקר neurogenesis ואת ההשפעות האפשריות של כימיקלים על NSCs, אשר מוגבלים בעיקר הן את ההיפוקמפוס ואת אזור subventricular (SVZ) של forebrain 34 . ניתוח נוסף immunocytochemical ו ביטוי גנים יעזור להגדיר טוב יותר את הספציפיות האזורית של נגזרות תא מובחן. שני הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול ההבחנה המתואר במסמך זה הם: (i) חיתוך מושבות hiPSC לשברים הומוגניים (קריטיים לדור EBS עם גודל הומוגני) ו- (ii) חיתוך מבנים נוירו-אוקטרומלים (שושנות) ) עבור בידול NSC, הדורש מיומנות ידנית משמעותיתואת דיוק כדי למנוע איסוף mesodermal ו תאים endodermal שעלולים להפחית את הפרופורציות של נוירונים ותאי גלייה שהושגו על בידול. זה חיוני כדי לאפיין את פנוטיפים של התאים במהלך ההתרחבות (כמו מושבות לא מובחנות או NSCs) ובמהלך כל הצעדים בידול. בפרט, הגן פרופילים ביטוי חלבון של נגזרות תא עצבי / גליה צריך להראות upregulation והפעלה של מסלולי איתות נוירון הקשורים, ואילו הביטוי של סמנים pluripotency צריך להיות מופחת. הדור של EBS ונגיפים neuroectodermal (רוזטות) יכול להיות מאתגר באופן ידני נוטה השתנות. מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול להרחבת NSCs נגזר רוזטה והבחנה נוספת שלהם לתוך תאים עצביים / גליה. המגבלות האפשריות של פרוטוקול זה בידול הם בעיקר (i) אחוז נמוך יחסית של דנגזרים גליליים שונים ו - (ii) היעדר פונקציות רשת נוירונים בוגרים (כפי שמוצג על ידי חוסר התפרצויות). יתר על כן, subpopulations ספציפיים של astrocytes יכול לתפקד כמו אבות ראשוניים או NSCs 35 . בעוד Nestin / GFAP תאים חיוביים פעמיים לא נצפו בתרבות תאים מובחנת זו (נתונים לא מוצג), הוא שיערו כי GFAP + תאים אלה תרבויות מעורבות הם אבות astrocytic ו astrocytes. סביר כי על ידי הארכת הזמן של בידול, מספר האסטרוציטים עשוי להגדיל, המורפולוגיה שלהם עשוי להיות יותר בוגרת, כפי שכבר צוין על ידי עבודות קודמות של הקבוצה של ג &#39;אנג 36 , 37 . בפרדיגמת בדיקת הרעילות החדשה, הידע על הפרעות ביולוגיות של נתיבים ביולוגיים הוא בעל חשיבות עליונה בהערכת מצוקות כימיות. לכן, במבחנה מערכות הבדיקה צריכה להיות מסוגלתמתייחסים לתופעות שליליות להפרעות של מסלולי איתות, בהתאם למושג של מסלול התוצאה השלילית (AOP). כמו הוכחה של קונספט, rotenone ניתן להשתמש כדי להעריך את ההפעלה של נתיב Nrf2, אשר מעורב בהגנה הסלולרית נגד מתח חמצוני או electrophilic 38 , ואת הלחץ החמצוני הוא אירוע מפתח חשוב משותף ב- AOPs שונים הרלוונטיים נוירוטוקסיות התפתחותית ומבוגרת 39 . Rotenone צריך לעורר את ההפעלה של נתיב Nrf2, אשר ניתן להוכיח על ידי Nrf2 חלבון טרנסלוקציה גרעינית ביטוי מוגבר של אנזימים היעד Nrf2, כולל NQO1 ו SRXN1. נמצא כי rotenone גורם לגידול תלוי מינון של רמות חלבון GFAP, המעיד על הפעלת אסטרוציטים 40 , 41 . Rotenone גם מקטין את מספר תאים dopaminergic (TH + ), אשר עולה בקנה אחד עם previOus במבחנה ובבדיקות vivo המציגות רוטנון תלוי במוות דופאמינרגי, שכן סוג זה של נוירון רגיש במיוחד למתח חמצוני 21 , 22 , 23 . לסיכום, זה hiPSC הנגזרות נוירונים ותאי גלייה התרבות מודל הוא כלי רב ערך כדי להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של כימיקלים המעוררים מתח חמצוני וכתוצאה מכך הפעלה נתיב Nrf2. כמו פרוטוקול הבחנה זה מאפשר את הדור של תרבויות מעורבות של תאים עצביים (GABAergic, dopaminergic, ו נוירונים glutamatergic) ו astrocytes, זה עשוי להוכיח מתאים ללמוד את crosstalk בין נוירונים וגליה בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כגון מחלות נוירודגנרטיבית ( למשל, מחלת פרקינסון). יתר על כן, הנוכחות של חלק משמעותי של NSCs עשוי לעזור להעריך את ההשפעות האפשריות של כימיקלים על פרווה עצביתEnitors, אשר ידוע להיות היעד העיקרי של מוטציות הנגרמות כימית או זיהומים ויראליים 42 .

המועצה הלאומית למחקר של ארה&quot;ב דו&quot;ח 1 חזה חדש בדיקת רעילות פרדיגמה שבה בדיקות רעילות רגולטורית יועברו מתוך גישה להסתמך על שינויים פנוטיפי שנצפה בבעלי חיים לגישה המתמקדת מבחני מבחנה מכניסטית באמצעות תאים אנושיים. נגזרות של תאי גזע Pluripotent (PSC) עשויות לייצג חלופות למודלי תאים סרטניים, שכן התאים המתקבלים עשויים להיות דומים יותר לתנאים הפיזיולוגיים של רקמות האדם ולספק כלים רלוונטיים יותר לחקר השפעות שליליות הנגרמות על ידי כימי. שני סוגים עיקריים של תרבויות PSC כי הם המבטיחים ביותר לבדיקת רעילות הם תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ו האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs), אשר נמצאים בשימוש נרחב בתחומי מחקר בסיסי רפואה משובי 2 , 3 . מומחיות זו יכולה כעת להיות רתום לפיתוח של סוג חדש של toxicoloGical במבחנה בדיקות שמטרתן לזהות את המסלולים הפיזיולוגיים מוטרד מעורב עם התפתחות של תופעות לוואי in vivo . עם זאת, שיטות בדיקה עבור הערכות בטיחות רגולטורית המבוססת על hESCs יהיה סביר להתקבל על ידי כל המדינות החברות באיחוד האירופי ועל ידי מדינות ברחבי העולם בשל חששות אתיים אפשריים ומדיניות החקיקה הלאומית מגוונים המסדיר את השימוש בתאים הנגזרים העובר. HiPSCs לשתף מאפיינים דומים hESCs 4 , 5 ו להחזיק פוטנציאל גדול לשיטות חוץ גופית , הן לזיהוי מטרות טיפוליות, כמו גם עבור הערכות בטיחות. בנוסף, הטכנולוגיה hiPSC מפחית את האילוצים של מאגר התורם מוגבל ואת החששות האתיים הקשורים תאים הנגזרות העובר. האתגר העיקרי עבור hiPSCs היא ההוכחה כי תאים אלה יכולים reproducibly ליצור מגוון משמעותי של נגזרות תאים הרלוונטיים מבחינה רעילה,עם מאפיינים ותגובות אופייניות לרקמות אנושיות. רמות מוגדרות מראש של סמנים נבחרים משמשים בדרך כלל לאפיון אוכלוסיות תאים לאחר תהליך ההבחנה ולספק תובנות לגבי היציבות של תהליך ההבחנה. עבודות קודמות העריכו התאמה של hiPSCs ליצירת תרבויות מעורבות של תאים עצביים ותאי גלייה, ולהעריך את ההשפעות של רוטנון, מעכב של המורכבות הנשימתיות המיטוכונדריאליות I, בהפעלת נתיב Nrf2, וסת רגולציה של מנגנוני הגנה נוגדי חמצון סוגי תאים רבים 6 , 7 . עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול המשמש להבחנה של hiPSCs לתוך תרבויות מעורבות נוירונים וגליאלי, מתן פרטים על מסלולי איתות (רמת גן וחלבון) המופעלים על בידול נוירוני / גליאלי. בנוסף, העבודה מראה נציג תוצאות המדגים כיצד זהHiPSC הנגזרות תאים תאיים נוירונים ותאי גלייה ניתן להשתמש כדי להעריך Nrf2 הפעלת איתות המושרה על ידי טיפול אקוטי (24 שעות) עם rotenone, המאפשר הערכה של אינדוקציה מתח חמצוני. IMR90 fibroblasts היו מתוכנתים לתוך hiPSCs ב I-Stem (צרפת) על ידי התמרה ויראלי של 2 גורמי שעתוק (Oct4 ו Sox2) באמצעות וקטורים pMIG 6 . מודלים hiPSC אנלוגי יכול להיות מיושם גם. הפרוטוקולים המתוארים להלן מסכמים את כל השלבים של ההבחנה בין hiPSCs לתאי גזע עצביים (NSCs) ובין תרבויות מעורבות של נוירונים פוסט-מיטוטיים ותאי גלייה (שלבים 1 ו -2, ראו גם את האתר של EURL ECVAM DBALM לתיאור מפורט של הפרוטוקול) 8 . פרוטוקול נוסף לבידוד, הרחבה, cryopreservation, והבחנה נוספת של NSCs לתוך נוירונים מעורבים ותאי גלייה מפורטת בשלבים 3 ו 4 (גם מתייחסים EURL ECVAM DBALM אנחנוBsite לתיאור מפורט של פרוטוקול זה) 9 . שלב 5 מתאר את הניתוחים שניתן לעשות כדי להעריך את הזהות פנוטיפי של התאים במהלך שלבים שונים של מחויבות בידול.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

האדם בתאי גזע pluripotent יכול להבדיל סוגים שונים של תאים שניתן ליישם את האדם מבוסס מבחני רעילות מבחנה . אחד היתרונות העיקריים הוא שתכנות מחדש של תאים סומטיים לייצר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרשים על ידי האדם (hiPSCs) נמנעים מהנושאים האתיים והחקיקתיים הנוגעים לשימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC). HiPSCs ניתן להרחיב ו הבדיל ביעילות לסוגים שונים של תאים עצביים ותאי גלייה, המשמשים מערכות בדיקה לבדיקת רעילות, בפרט, לצורך הערכת מסלולים שונים המעורבים neurotoxicity. עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול ההבחנה של hiPSCs לתוך תרבויות מעורבות של תאים עצביים ותאי גלייה. מסלולי האיתות המווסתים ו / או מופעלים על ידי הבחנה נוירונים מוגדרים. מידע זה הוא קריטי ליישום המודל התא כדי פרדיגמה חדשה בדיקת רעילות, שבו כימיקלים מוערכים על בסיס יכולתם peRturb מסלולים ביולוגיים. כהוכחה לקונספט, rotenone, מעכב של מיטוכונדריה מורכבת I, שימש כדי להעריך את ההפעלה של נתיב איתות Nrf2, רגולטור מפתח של מנגנון נוגד חמצון תגובה אלמנט - (ARE) מונע מנגנון הגנה הסלולר נגד מתח חמצוני .

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) נחשבים כלי רב עוצמה עבור סריקה וכימיים ההקרנה ופיתוח של מודלים חדשים במבחנה לבדיקת רעילות, כולל נוירוטוקסיטי. הנה, פרוטוקול מפורט עבור ההבחנה של hiPSCs לתוך נוירונים וגליה מתואר.

Protocol עבור הבחנה של תאים גזעיים Pluripotent Indoced האדם לתוך תרבויות מעורבות של נוירונים וגליה עבור בדיקה נוירוטוקסיות

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...