Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
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आईएमआर 90-एचपीएससी प्रदान करने के लिए लेखकों को डॉ। मार्क पेस्चन्स्की (आई-स्टेम, एवरी, फ़्रांस) को धन्यवाद देना चाहूंगा; डॉ। Giovanna Lazzari और डा। सिल्विया Colleoni (Avantea srl, Cremona, इटली); डॉ। सिमोन हौपट (बॉन, जर्मनी विश्वविद्यालय); डॉ। टिज़ियाना संतिनी (इटालियन इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी, रोम), immunofluorescence धुंधला मूल्यांकन पर सलाह देने के लिए; आरपीपीए विश्लेषण और एंटीबॉडी सत्यापन के लिए उनके योगदान के लिए डॉ। बेनेडेट्स एक्सीर्डी, डॉ। एलेना रैम्पजोजो, और डा। लुका पर्सानो (यूनिवर्सिटी ऑफ पडुआ, इटली) अनुदान: यह कार्य यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित परियोजना &quot;एससीआर और टॉक्स&quot; (अनुदान समझौता एन ° 266753) द्वारा समर्थित था।

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लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

यह काम आईएमआर 9 0-एचपीएससी के भेदभाव के लिए एक मजबूत और अपेक्षाकृत तेजी से प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो पोस्ट माइटोटिक न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं में है। एचईएससीएस और एचईपीएससी के आधार पर पूर्व में प्रकाशित न्यूरोनल भेदभाव प्रोटोकॉल आमतौर पर 25 , 26 के न्यूरल अग्रदूतों के उच्च प्रतिशत और 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 की एक महत्वपूर्ण संख्या में न्यूरॉनल लक्ष्य कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। समरूपता, यहाँ वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल ग्लैया और नेस्टिन + कोशिकाओं के असंतुलित अनुपात के साथ, गैबार्जिक, ग्लूटामेएटरजीक, और डोपामिनर्जिक न्यूरोनल कोशिकाओं के विषम संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त है। ग्लूटामेटरगिक (~ 35-42%) और गैबर्जिक (~ 15-20%) तंत्रिका कोशिकाओं की उपस्थिति से पता चलता है किइस संस्कृति में अग्रमस्तिष्क, कोर्टिकल जैसी विशेषताएं हैं, और डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (~ 13-20%) की एक असतत संख्या की उपस्थिति भी मस्तिष्क की विशिष्टता का संकेत कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, नेस्टिन + कोशिकाओं के एक मामूली अनुपात की स्थायित्व न्यूरोजेनेसिस के अध्ययन और एनएससी पर रसायनों के संभावित प्रभावों के लिए उपयुक्त साबित हो सकती है, जो प्राथमिक रूप से पूर्वोत्तर 34 के हिप्पोकैम्पस और सब्विंटिक्कुलर ज़ोन (एसवीजेड) दोनों तक सीमित हैं। इसके अलावा इम्युनोकायटोकैमिकल और जीन एक्सप्रैशन एक्सपोज़िशन विभेदित सेल डेरिवेटिव के क्षेत्रीय विशिष्टता को बेहतर ढंग से परिभाषित करने में मदद करेगा। इस दस्तावेज में वर्णित भेदभाव प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) समरूप टुकड़े (जो समरूप आकार के साथ ईबीएस की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है) में hiPSC कॉलोनियों का काटने और (ii) न्यूरोरेकोडर्मल संरचनाओं का काटने (रोसेट्स ) एनएससी भेदभाव के लिए, जो महत्वपूर्ण पुस्तिका कौशल की आवश्यकता हैऔर मेसोडर्मल और एंडोडार्मल कोशिकाओं को एकत्रित करने से बचने के लिए परिशुद्धता जो भेदभाव पर प्राप्त न्यूरॉन्स और ग्लील कोशिकाओं के अनुपात को कम कर सकती है। विस्तार के दौरान कोशिकाओं के फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है (जैसा कि undifferentiated colonies या एनएससी) और सभी भेदभाव चरणों के दौरान विशेष रूप से, न्यूरॉनल / ग्लियाल सेल डेरिवेटिव के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल को न्यूरॉन से संबंधित सिग्नलिंग मार्गों के अपग्रेड और सक्रियण दिखाना चाहिए, जबकि प्लूरापोटेंसी मार्कर की अभिव्यक्ति कम होनी चाहिए। ईबीएस और न्यूरोरेकोडर्मल डेरिवेटिव (रोसेट्स) की पीढ़ी मैन्युअल रूप से चुनौतीपूर्ण और परिवर्तनशीलता से ग्रस्त हो सकती है। इस कारण से, हमने रोसेट-व्युत्पन्न एनएससी के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया और उनके न्यूरोनल / ग्लियाल कोशिकाओं में भेदभाव विकसित किया। इस भेदभाव प्रोटोकॉल की संभावित सीमाएं मुख्य रूप से हैं (i) घ के अपेक्षाकृत कम प्रतिशतअनुमेय glial डेरिवेटिव और (ii) परिपक्व न्यूरोनल नेटवर्क कार्यों की कमी (जैसा कि फटने की कमी के कारण दिखाया गया है)। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स के विशिष्ट उप-जनसंख्या प्राथमिक प्रजनन या एनएससी 35 के रूप में कार्य कर सकते हैं। हालांकि इस विभेदित सेल संस्कृति (डेटा नहीं दिखाया गया) में नेस्टिन / जीएफ़एपी डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को नहीं देखा गया था, यह अनुमान है कि इन मिश्रित संस्कृतियों में जीएफएपी + कोशिकाएं एस्ट्रोसाइटेटिक पूर्वज और एस्ट्रोसाइट्स हैं। यह विवेकपूर्ण है कि भेदभाव के समय को बढ़ाकर, एस्ट्रोसाइट्स की संख्या में वृद्धि हो सकती है, और उनका आकारिकी अधिक परिपक्व हो सकता है, जैसा कि झांग के समूह 36 , 37 से पहले के कामों से पहले ही बताई गई है। नए विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान में, रासायनिक प्रतिकूल परिस्थितियों का आकलन करते समय जैविक मार्गों के रासायनिक प्रेरित अनुषानों पर ज्ञान अत्यंत महत्वपूर्ण है। इसलिए, इन विट्रो टेस्ट सिस्टम में सक्षम होना चाहिएप्रतिकूल परिणाम मार्ग (एओपी) की अवधारणा के अनुसार, सिग्नलिंग पथों की गड़बड़ी के लिए प्रतिकूल प्रभाव से संबंधित है। प्रूफ-ऑफ-अवधारणा के रूप में, रोटोनोन का उपयोग एनआरएफ 2 मार्ग की सक्रियता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जो ऑक्सीडेटिव या इलेक्ट्रोफिलिक तनाव के खिलाफ सेलुलर डिफेन्स में शामिल है 38 , और ऑक्सीडेटिव तनाव विभिन्न एओपी में एक महत्वपूर्ण और आम कुंजी घटना है विकास और वयस्क न्यूरोटॉक्सिसिटी 39 रोटोनोन को एनआरएफ 2 मार्ग की सक्रियता को प्राप्त करना चाहिए, जिसे एनआरएफ 2 प्रोटीन परमाणु हस्तांतरण और एनआरएफ 2-लक्ष्य एंजाइम की वृद्धि की अभिव्यक्ति, एनक्यूओ 1 और एसआरएक्सएन 1 सहित, का प्रदर्शन किया जा सकता है। यह पाया गया है कि रोटोनोन जीएफएपी प्रोटीन स्तर की खुराक पर निर्भर वृद्धि को प्रेरित करता है, एस्ट्रोसाइट सक्रियण 40 , 41 का संकेत देता है। रोटेनोन डोपामिनर्जिक (TH + ) कोशिकाओं की संख्या भी घटाता है, जो प्रीवी के साथ समझौता हैइन प्रकार के न्यूरॉन विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव 21 , 22 , 23 के प्रति संवेदनशील हैं, क्योंकि इन विट्रो और विवो अध्ययन में रोटोनोन-निर्भर डोपामिनर्जिक कोशिका मृत्यु का अध्ययन किया गया है। निष्कर्ष में, यह हायपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरोनल और ग्लियाल सेल कल्चर मॉडल एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो कि रसायनों के न्यूरोटॉक्सिक प्रभाव का आकलन करता है जो एनएफएफ 2 मार्ग सक्रियण के परिणामस्वरूप ऑक्सीडेटिव तनाव को प्राप्त करते हैं। चूंकि यह भेदभाव प्रोटोकॉल न्यूरॉनल कोशिकाओं (GABAergic, डोपामिनर्जिक, और ग्लूटामेटरगिक न्यूरॉन्स) और एस्ट्रोसाइट्स के मिश्रित संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, यह न्यूरॉइडजनरेटिव रोगों जैसे न्यूरॉन्स और ग्लिया के बीच क्रोसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त साबित हो सकता है, जैसे कि neurodegenerative रोगों ( जैसे, पार्किंसंस रोग)। इसके अलावा, एनएससी के एक महत्वपूर्ण अनुपात की उपस्थिति तंत्रिका कार्यक्रमों पर रसायनों के संभावित प्रभावों का आकलन करने में मदद कर सकती हैइनसेटर, जो कि रासायनिक प्रेरित म्यूटेशन या वायरल संक्रमण का मुख्य लक्ष्य है।

अमेरिकी नेशनल रिसर्च काउंसिल की रिपोर्ट 1 ने एक नई विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान की कल्पना की, जिसमें विनियामक विषाक्तता परीक्षण पशु कोशिकाओं में मानव कोशिकाओं का उपयोग करते हुए इन विट्रो एशेज में यंत्रवत् पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक दृष्टिकोण के अनुसार दिखाई जाने वाले फेनोटाइपिक परिवर्तनों पर निर्भर एक दृष्टिकोण से स्थानांतरित किया जाएगा। प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (पीएससी) डेरिवेटिव कैंसर सेल मॉडल के विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, क्योंकि प्राप्त कोशिकाएं मानवीय ऊतकों की शारीरिक स्थितियों के समान निकटता से और रासायनिक प्रेरित प्रतिकूल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अधिक प्रासंगिक उपकरण प्रदान कर सकती हैं। पीएससी संस्कृतियों के दो प्रमुख प्रकार जो कि विषाक्तता परीक्षण के लिए सबसे अधिक आशाजनक हैं मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाएं (एचईएससी) और इंसान से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) हैं, जो वर्तमान में बुनियादी शोध और पुनर्योजी दवाओं 2 , 3 के क्षेत्रों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस विशेषज्ञता को अब एक नए वर्ग के toxicolo के विकास के लिए उपयोग किया जा सकता हैजीआईएल इन विट्रो परीक्षणों के उद्देश्य से विवो में प्रतिकूल प्रभाव के विकास के साथ जुड़े परेशान शारीरिक रास्ते की पहचान करने के उद्देश्य से। हालांकि, एचईएससी के आधार पर नियामक सुरक्षा आकलन के लिए परीक्षण विधियां संभावित ईसाई सदस्य राज्यों और दुनिया भर में संभावित नैतिक चिंताओं और भ्रूण-व्युत्पन्न कोशिकाओं के उपयोग को विनियमित करने वाली विविध राष्ट्रीय विधायी नीतियों के कारण स्वीकार करने की संभावना नहीं होगी। एचईपीएससी 4 , 5 के समान ही एचपीसीसीएस विशेषताओं को साझा करते हैं और इन्हेट्रो मैट्रिक्स के लिए महान क्षमता रखते हैं, दोनों के लिए चिकित्सीय लक्ष्य की पहचान करने के साथ-साथ सुरक्षा मूल्यांकन के लिए भी। इसके अलावा, हायपीएससी टेक्नोलॉजी सीमित दाता पूल की बाधाओं और भ्रूण-व्युत्पन्न कोशिकाओं से जुड़े नैतिक चिंताओं को कम करता है। हायपीएससी के लिए एक बड़ी चुनौती प्रदर्शन है कि ये कोशिका विषाक्तता से प्रासंगिक सेल डेरिवेटिव की एक महत्वपूर्ण श्रेणी उत्पन्न कर सकती हैं,मानवीय ऊतकों की विशिष्टताओं और प्रतिक्रियाओं के साथ चयनित मार्करों के पूर्वनिर्धारित स्तर आमतौर पर भेदभाव की प्रक्रिया के बाद सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए और भेदभाव प्रक्रिया की स्थिरता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है। पिछला कार्यों ने न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के मिश्रित संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए और एनटीएफ 2 मार्ग के सक्रियण पर मिटोकॉन्ड्रियल श्वसन परिसर के एक अवरोध करनेवाला, एंटि ऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के एक प्रमुख नियामक के प्रभावों का आकलन करने के लिए hiPSCs की उपयुक्तता का मूल्यांकन किया है। कई सेल प्रकार 6 , 7 यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो एचईपीएससी के मिश्रित न्यूरॉनल और ग्लियाल संस्कृतियों में भेदभाव के लिए उपयोग किया जाता है, जो न्यूरोनल / ग्लिलियल भेदभाव पर सक्रिय होते हैं, सिग्नलिंग पथ (जीन और प्रोटीन स्तर) पर विवरण प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, यह दर्शाता है कि यह कैसे दिखाता है कि यह प्रदर्शन दर्शाता हैहायपीएससी-व्युत्पन्न न्यूरोनल और ग्लियाल सेल मॉडल का उपयोग एनआरएफ 2 सिग्नलिंग एक्टिवेशन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है जो तीव्र (24-एच) रोटोनोन से प्रेरित होता है, जिससे ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरण के आकलन की अनुमति मिलती है। पीएमआईआईआई वैक्टर 6 का इस्तेमाल करते हुए 2 प्रतिलेखन कारकों (अक्टूबर 4 और सॉक्स 2) के वायरल ट्रांसडकेशन द्वारा आई-एम -9 9 एफआईबीआरबीएलस्ट्स को आई-स्टेम (फ़्रांस) में hiPSCs में पुनर्मुद्रित किया गया था। एनालॉगस हायपीएससी मॉडल भी लागू किया जा सकता है। नीचे वर्णित प्रोटोकॉल, एचईपीएससी के तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) में भिन्नता के सभी चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं और आगे में मेटाटिक्स न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं (चरण 1 और 2 के मिश्रित संस्कृतियों में भी) के विस्तृत विवरण के लिए ईआरआरसी ईसीवीएएम डीबीलम वेबसाइट देखें प्रोटोकॉल) 8 अलगाव, विस्तार, क्रियोपेशेशेशन और एनएससी के मिश्रित न्यूरॉन्स और ग्लियाल कोशिकाओं में आगे भेद करने के लिए अतिरिक्त प्रोटोकॉल का विवरण चरण 3 और 4 में बताया गया है (यह भी ईआरआरसी ईसीवीएएम डीबीलम को देखेंइस प्रोटोकॉल के विस्तृत विवरण के लिए bsite) 9 चरण 5 उन विश्लेषणों का वर्णन करता है जो प्रतिबद्धता और भेदभाव के कई चरणों के दौरान कोशिकाओं के फेनोटाइपिक पहचान का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं जो मानव- इन विट्रो विषाक्तता assays में लागू किया जा सकता है। एक प्रमुख फायदा यह है कि मानव प्रेरित प्लूिपोटेंट स्टेम सेल (एचईपीएससी) का निर्माण करने के लिए दैहिक कोशिकाओं के पुनर्रोग्रैग्रामिंग मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के उपयोग से संबंधित नैतिक और विधायी मुद्दों से बचा जाता है। हाईपीएससी को विस्तारित और कुशलता से विभिन्न प्रकार के न्यूरॉनल और ग्लिअल कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है, जो विषाक्तता परीक्षण के लिए टेस्ट सिस्टम के रूप में सेवा कर रहे हैं और, विशेष रूप से, न्यूरोटॉक्सिकिटी में शामिल विभिन्न मार्गों के मूल्यांकन के लिए। इस काम में एचईपीएससी के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है जो न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के मिश्रित संस्कृतियों में है। न्यूरोनल भेदभाव से विनियमित और / या सक्रिय किए जाने वाले सिग्नलिंग मार्गों को परिभाषित किया जाता है। यह जानकारी नई विषाक्तता परीक्षण प्रतिमान के लिए सेल मॉडल के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें रसायनों का आकलन उनकी क्षमता के आधार पर किया जाता है।जंगली जैविक मार्ग अवधारणा का एक प्रमाण के रूप में, रोटोनोन, मिटोकॉन्ड्रियल श्वसन जटिल का अवरोध करने वाला, का उपयोग एनआरएफ 2 सिग्नलिंग मार्ग के सक्रियण का आकलन करने के लिए किया गया था, एंटीऑक्सिडेंट-प्रतिक्रिया-तत्व- (एआरई) -ड्रवियन सेलुलर डिफेंस तंत्र के ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रमुख नियामक ।

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Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) दवा और रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण और विषाक्तता परीक्षण के लिए इन विट्रो मॉडल में नए विकास के लिए माना जाता है, जिसमें न्यूरोटॉक्सिकता शामिल है। यहां, एनएचओएससीएस के न्यूरॉन्स और ग्लिया में भेदभाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

न्यूरोटॉक्सिसीटी परीक्षण के लिए न्यूरॉन्स की मिश्रित संस्कृतियों और ग्लिया में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न पिरामिड न्यूरॉन्स से वृक्ष के समान spines के तीन आयामी मात्रा

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

मानव स्टेम कोशिकाओं से melanocytes के फीडर मुफ्त व्युत्पत्ति

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

मापने नेटवर्क गतिविधि माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं का तेजी से neuronal भेदभाव

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

मानव pluripotent की इन विट्रो भेदभाव में स्टेम कोशिकाओं Trophoblastic में कोशिकाओं

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से Astrocytes और न्यूरॉन्स की 3डी Cocultures के साथ Synaptic Microcircuit मॉडलिंग

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

आरएनए-प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल में मानव प्राथमिक Fibroblasts के reprogramminging आधारित

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...