Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Gli autori vorrebbero ringraziare il dottor Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Francia), per la fornitura di IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari e Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italia); Dr. Simone Haupt (Università di Bonn, Germania); Dott.ssa Tiziana Santini (Istituto Italiano di Tecnologia, Roma), per la consulenza sulla valutazione delle macchie di immunofluorescenza; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo e Dr. Luca Persano (Università di Padova, Italia), per i loro contributi all&#39;analisi della RPPA e alla convalida dell&#39;anticorpo. Finanziamenti: questo lavoro è stato sostenuto dal progetto &quot;SCR &amp; Tox&quot; finanziato dall&#39;UE (accordo di sovvenzione n. 266753).

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questo lavoro descrive un protocollo robusto e relativamente rapido per la differenziazione di IMR90-hiPSC nei neuroni post-mitosi e nelle cellule gliali. I protocolli di differenziazione neuronali precedentemente pubblicati in base a hESC e hiPSC hanno generalmente elevati percentuali di precursori neurali 25 e 26 e un numero significativo di cellule bersaglio neuronali 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogamente, il protocollo di differenziazione qui descritto è idoneo a generare culture eterogenee di cellule neuronali GABAergiche, glutamatergiche e dopaminergiche, insieme a glia e ad una quota discreta di cellule Nestin + . La presenza di cellule neuronali glutamatergiche (~ 35-42%) e GABAergiche (~ 15-20%) suggerisce cheQuesta cultura possiede forebrain, caratteristiche corticali e la presenza di un numero discreto di neuroni dopaminergici (~ 13-20%) può anche indicare la specificità del midbrain. Inoltre, la permanenza di una modesta percentuale di cellule Nestin può risultare idonea allo studio della neurogenesi e ai possibili effetti di sostanze chimiche su NSCs, che sono principalmente limitate sia all&#39;ippocampo che alla zona subventrica (SVZ) del forebrain 34 . Ulteriori analisi di immunocitochimica e di espressione genica aiuterebbero a definire meglio la specificità regionale dei derivati ​​cellulari differenziati. Le due fasi più critiche del protocollo di differenziazione descritte in questo documento sono: (i) il taglio delle colonie hiPSC in frammenti omogenei (che sono critici per la generazione di EB con dimensioni omogenee) e (ii) il taglio delle strutture neuroectodermiche (rosette ) Per la differenziazione NSC, che richiede una significativa abilità manualeE precisione per evitare la raccolta di cellule mesodermiche e endodermiche che possono ridurre le proporzioni di neuroni e cellule gliali ottenute dopo la differenziazione. È fondamentale caratterizzare i fenotipi delle cellule durante l&#39;espansione (come colonie indifferenziate o NSCs) e durante tutti i passaggi di differenziazione. In particolare, i profili di espressione genica e proteica dei derivati ​​neuronali / gliali cellulari dovrebbero mostrare upregulation e attivazione di vie di segnalazione correlate al neurone, mentre l&#39;espressione di marcatori pluripotenziali dovrebbe essere ridotta. La generazione di EB e dei derivati ​​neuroectodermici (rosette) può essere impegnata manualmente e soggetta a variabilità. Per questo motivo abbiamo sviluppato un protocollo per l&#39;espansione di NSC derivanti da rosette e la loro ulteriore differenziazione nelle cellule neuronali / gliali. Le limitazioni possibili di questo protocollo di differenziazione sono principalmente (i) la percentuale relativamente bassa di dDerivati ​​ialenti differenziati e (ii) la mancanza di funzioni di rete neuronali mature (come dimostra la mancanza di esplosioni). Inoltre, alcune sottopopolazioni di astrociti possono funzionare come progenitori primari o NSCs 35 . Mentre le cellule double-positive Nestin / GFAP non sono state osservate in questa coltura cellulare differenziata (dati non mostrati), si ipotizza che le cellule GFAP + in queste culture miste siano progenitori astrocitici e astrociti. È plausibile che estendendo il tempo della differenziazione, il numero di astrociti può aumentare e la loro morfologia può diventare più matura, come già indicato da precedenti lavori del gruppo di Zhang 36 , 37 . Nel nuovo paradigma di test sulla tossicità, la conoscenza delle perturbazioni dei percorsi biologici indotti dalle sostanze chimiche è di fondamentale importanza nel valutare le avversità chimiche. Pertanto, i sistemi di test in vitro dovrebbero essere in grado diRiferiscono effetti negativi ai disturbi delle vie di segnalazione, secondo il concetto del percorso espositivo avverso (AOP). Come prova di concetto, il rotenone può essere utilizzato per valutare l&#39;attivazione del percorso Nrf2, che è coinvolto nella difesa cellulare contro lo stress ossidativo o elettrofilo 38 e lo stress ossidativo è un importante e comune avvenimento chiave in vari AOPs rilevanti per Neurotoxicity dello sviluppo e dell&#39;adulto 39 . Il Rotenone dovrebbe provocare l&#39;attivazione del sentiero Nrf2, che può essere dimostrato dalla traslocazione nucleare della proteina Nrf2 e da una maggiore espressione degli enzimi Nrf2-target, tra cui NQO1 e SRXN1. È stato trovato che il rotenone induce un aumento dose-dipendente dei livelli di proteina GFAP, indicativo di attivazione astrocitica 40 , 41 . Rotenone diminuisce anche il numero di cellule dopaminergiche (TH + ), che è in accordo con previGli studi in vitro e in vivo che dimostrano la morte delle cellule dopaminergiche dipendenti da rotenone, poiché questo tipo di neurone è particolarmente sensibile allo stress ossidativo 21 , 22 , 23 . In conclusione, questo modello di coltura cellulare neuronale e gliale di cellule hiPSC è uno strumento prezioso per valutare gli effetti neurotossici di sostanze chimiche che provocano lo stress ossidativo, con conseguente attivazione della via Nrf2. Poiché questo protocollo di differenziazione consente la generazione di colture miste di cellule neuronali (neuroni GABAergici, dopaminergici e glutamatergici) e astrociti, può risultare opportuno studiare la crosstalk tra neuroni e glia in condizioni fisiologiche e patologiche, come nelle malattie neurodegenerative ( Ad esempio, la malattia di Parkinson). Inoltre, la presenza di una percentuale significativa di NSC può aiutare a valutare i possibili effetti delle sostanze chimiche sui programmi neuraliChe sono noti per essere il principale obiettivo di mutazioni chimiche-indotte o infezioni virali 42 .

Il rapporto 1 del Consiglio Nazionale di Ricerca USA ha previsto un nuovo paradigma di test sulla tossicità in cui i test di regolamentazione della tossicità sarebbero stati spostati da un approccio che si basa sui cambiamenti fenotipici osservati negli animali ad un approccio focalizzato sui test meccanici in vitro utilizzando le cellule umane. I derivati ​​pluripotenti di cellule staminali (PSC) possono rappresentare alternative ai modelli delle cellule tumorali, in quanto le cellule ottenute possono similmente assomigliare alle condizioni fisiologiche dei tessuti umani e fornire strumenti più rilevanti per studiare effetti collaterali indotti da sostanze chimiche. I due principali tipi di colture PSC che sono più promettenti per la sperimentazione della tossicità sono le cellule staminali embrionali umane (hESCs) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo (hiPSCs), attualmente ampiamente utilizzate nei settori della ricerca di base e della medicina rigenerativa 2 , 3 . Questa competenza può ora essere sfruttata per lo sviluppo di una nuova classe di toxicoloGical in vitro per identificare i percorsi fisiologici perturbed coinvolti nello sviluppo di effetti negativi in vivo . Tuttavia, i metodi di prova per le valutazioni di sicurezza regolamentare basati su hESC non sarebbero probabilmente accettati da tutti gli Stati membri dell&#39;UE e da paesi in tutto il mondo a causa di eventuali preoccupazioni etiche e di diverse politiche legislative nazionali che regolano l&#39;uso di cellule embrioni. HiPSCs condividono caratteristiche simili a quelle dei hESCs 4 , 5 e hanno un grande potenziale per metodi in vitro , sia per identificare obiettivi terapeutici, sia per valutazioni di sicurezza. Inoltre, la tecnologia hiPSC mitiga i vincoli di un pool limitato di donatori e le preoccupazioni etiche associate a cellule embrione. Una grande sfida per i hiPSC è la dimostrazione che queste cellule possono generare riproducibilmente una gamma significativa di derivati ​​cellulari tossicologicamente rilevanti,Con caratteristiche e risposte tipiche dei tessuti umani. Livelli predefiniti dei marcatori selezionati vengono generalmente utilizzati per caratterizzare le popolazioni cellulari dopo il processo di differenziazione e per fornire approfondimenti sulla stabilità del processo di differenziazione. I precedenti lavori hanno valutato l&#39;idoneità dei hiPSC per generare colture miste di cellule neuronali e gliali e per valutare gli effetti di rotenone, inibitore del complesso respiratorio mitocondriale I, sull&#39;attivazione del percorso Nrf2, un regolatore chiave dei meccanismi di difesa antiossidanti in Molti tipi di cellule 6 , 7 . Questo lavoro descrive un protocollo utilizzato per la differenziazione di hiPSCs in colture neuronali e gliali miste, fornendo dettagli sui percorsi di segnalazione (livello di gene e proteine) che vengono attivati ​​sulla differenziazione neuronale / gliale. Inoltre, il lavoro mostra i risultati rappresentativi dimostrando come questoIl modello hi-CSC derivato da neuroni e gliali può essere utilizzato per valutare l&#39;attivazione di segnalazione Nrf2 indotta da un trattamento acuto (24h) con rotenone, consentendo la valutazione dell&#39;induzione dello stress ossidativo. I fibroblasti IMR90 sono stati riprogrammati in hiPSC a I-Stem (Francia) mediante la trasduzione virale di 2 fattori di trascrizione (Oct4 e Sox2) usando i vettori pMIG 6 . Possono essere applicati modelli analoghi hiPSC. I protocolli descritti qui di seguito riassumono tutte le fasi della differenziazione dei hiPSC in cellule staminali neurali (NSCs) e successivamente in colture miste di neuroni post-mitotici e cellule gliali (passaggi 1 e 2), vedere anche il sito web EURL ECVAM DBALM per una descrizione dettagliata Il protocollo) 8 . Un protocollo aggiuntivo per l&#39;isolamento, l&#39;espansione, la crioconservazione e l&#39;ulteriore differenziazione dei NSCs in neuroni misti e cellule gliali sono dettagliate nei passaggi 3 e 4 (si fa anche riferimento al EURL ECVAM DBALMBsite per una descrizione dettagliata di questo protocollo) 9 . Il passo 5 descrive le analisi che possono essere effettuate per valutare l&#39;identità fenotipica delle cellule durante le diverse fasi di impegno e differenziazione.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

Le cellule staminali pluripotenti umane possono differenziarsi in vari tipi di cellule che possono essere applicati a test di tossicità in vitro basati sull&#39;uomo. Uno dei maggiori vantaggi è che la riprogrammazione delle cellule somatiche per produrre cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo (hiPSC) evita le questioni etiche e legislative legate all&#39;uso delle cellule staminali embrionali umane (hESCs). I HiPSCs possono essere ampliati e differenziati in modo efficace in diversi tipi di cellule neuronali e gliali, che servono come sistemi di test per test di tossicità e, in particolare, per la valutazione di diversi percorsi coinvolti nella neurotossicità. Questo lavoro descrive un protocollo per la differenziazione di hiPSCs in colture miste di cellule neuronali e gliali. Sono definiti i percorsi di segnalazione regolati e / o attivati ​​dalla differenziazione neuronale. Queste informazioni sono fondamentali per l&#39;applicazione del modello cellulare al nuovo paradigma di test sulla tossicità, in cui le sostanze chimiche vengono valutate sulla base della loro capacità diRturbare percorsi biologici. Come prova di concetto, il rotenone, inibitore del complesso respiratorio mitocondriale I, è stato utilizzato per valutare l&#39;attivazione del percorso di segnalazione Nrf2, un regolatore chiave del meccanismo di difesa cellulare anti-ossidante-risposta-elemento (ARE) .

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Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Le cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo (hiPSCs) sono considerate un potente strumento per la screening di droga e chimica e per lo sviluppo di nuovi modelli in vitro per la sperimentazione di tossicità, compresa la neurotossicità. Qui viene descritto un protocollo dettagliato per la differenziazione di hiPSC in neuroni e glia.

Protocollo per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo in culture miste di neuroni e glia per la sperimentazione della neurotossicità

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...