Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
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著者は、IMR90-hiPSCを提供してくれたMarc Peschanski博士（I-Stem、フランス、エヴリー）に感謝したい。 Giovanna Lazzari博士とSilvia Colleoni博士（Avantea srl、Cremona、Italy）; Dr. Simone Haupt（ボン大学、ドイツ）; Tiziana Santini博士（イタリア工科大学ローマ）は、免疫蛍光染色の評価に関するアドバイスを提供してくれました。 RPPA分析と抗体の検証に貢献したBenedetta Accordi博士、Elena Rampazzo博士、Luca Persano博士（パドヴァ大学、イタリア）資金調達：このプロジェクトは、EUが資金を提供するプロジェクト「SCR＆To​​x」（無償資金協力協定第266753号）によって支援されました。

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著者は何も開示することはない。

この研究は、IMR90-hiPSCを分裂後ニューロンおよびグリア細胞に分化させるための、堅牢で比較的迅速なプロトコールを記載する。以前に公開されたhESCおよびhiPSCに基づくニューロン分化プロトコールは、通常、高い割合の神経前駆体25,26およびかなりの数の神経標的細胞27,28,29,30,31,32,33を産生する。同様に、本明細書に記載の分化プロトコルは、グリアおよび恒常的な割合のネスチン+細胞と共に、GABA作動性、グルタミン酸作動性およびドーパミン作動性ニューロン細胞の異種培養物を作製するのに適している。グルタミン酸作動性（〜35-42％）およびGABA作動性（〜15-20％）神経細胞の存在は、この培養は前脳、皮質様の特徴を有し、ドーパミン作動性ニューロン（〜13〜20％）の不連続数の存在も中脳特異性を示し得る。さらに、ネスチン+細胞の適度な割合の永続性は、神経新生の研究、および主として前脳34の海馬および脳室下領域（SVZ）の両方に限定されるNSCに対する化学物質の考えられる効果に適していると考えられる。さらなる免疫細胞化学および遺伝子発現分析は、分化した細胞誘導体の領域特異性をより明確にするのに役立つであろう。 この文書に記載されている分化プロトコルの2つの最も重要なステップは、（i）均質な断片へのhiPSCコロニーの切断（均質な大きさのEBの生成に重要である）、および（ii）神経外胚葉構造）、NSC分化のためにはかなりの手作業スキルが必要分化時に得られるニューロンおよびグリア細胞の割合を減少させる可能性のある中胚葉および内胚葉細胞の収集を避けるために、 増殖中（未分化コロニーまたはNSCとして）およびすべての分化段階中に細胞の表現型を特徴付けることは重要である。特に、ニューロン/グリア細胞誘導体の遺伝子およびタンパク質発現プロファイルは、ニューロン関連シグナル伝達経路のアップレギュレーションおよび活性化を示すが、多能性マーカーの発現は減少しなければならない。 EBおよび神経外胚葉誘導体（ロゼット）の生成は、手作業で挑戦的であり、変動する傾向があり得る。この理由から、我々は、ロゼット由来NSCの拡大およびニューロン/グリア細胞へのそれらのさらなる分化のためのプロトコールを開発した。 この分化プロトコルの可能な限界は、主に（i）d（ii）成熟したニューロンネットワーク機能の欠如（バーストの欠如によって示されるように）のいずれかである。さらに、星状細胞の特定の亜集団は、初代前駆細胞またはNSCとして機能し得る35 。この分化した細胞培養物においてネスチン/ GFAP二重陽性細胞は観察されなかったが（データ示さず）、これらの混合培養物中のGFAP +細胞は星状細胞前駆体および星状細胞であると仮定される。分化の時間を伸ばすことによって、星群の数は増加し、その形態は、Zhangのグループ36,37の以前の研究によってすでに示されているように、より成熟する可能性がある。 新しい毒性試験のパラダイムでは、生物学的経路の化学誘起摂動に関する知識は、化学的逆行を評価する際に最も重要である。したがって、 インビトロ試験システムは、有害な結果経路（AOP）の概念に従って、シグナル伝達経路の障害に悪影響を関連付ける。概念の証明として、ロテノンは、酸化ストレスまたは求電子ストレスに対する細胞防御に関与するNrf2経路の活性化を評価するために使用することができ、酸化ストレスは、関連する様々なAOPにおける重要かつ共通の主要事象である発生および成人神経毒性39 。 ロテノンは、Nrf2タンパク質の核移行およびNQO1およびSRXN1を含むNrf2標的酵素の発現の増加によって示され得るNrf2経路の活性化を誘発すべきである。ロテノンは、星状細胞の活性化を示すGFAPタンパク質レベルの用量依存的増加を誘導することが見出されている（ 40,41） 。ロテノンはまた、ドーパミン作動性（TH + ）細胞の数を減少させ、これは、previこのタイプのニューロンは酸化ストレスに特に敏感であるため、ロテノン依存性ドーパミン作動性細胞死を示すインビトロおよびインビボ研究21,22,23 。 結論として、このhiPSC由来のニューロンおよびグリア細胞培養モデルは、Nrf2経路活性化をもたらす酸化ストレスを誘発する化学物質の神経毒性効果を評価するための貴重なツールである。この分化プロトコルは、神経細胞（GABA作動性、ドーパミン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロン）および星状細胞の混合培養物の生成を可能にするので、神経変性疾患などの生理学的および病理学的状態におけるニューロンとグリアとの間のクロストークを研究するのに適している例えば、パーキンソン病）。さらに、有意な割合のNSCの存在は、神経前駆体に対する化学物質の考えられる影響を評価するのに役立つかもしれない化学的に誘発された突然変異またはウィルス感染の主な標的であることが知られている42 。

米国国立研究評議会の報告書1は、ヒトでの細胞を用いた機構的インビトロアッセイに焦点を当てたアプローチに、動物で観察された表現型変化に基づくアプローチから規制毒性試験に移行する新しい毒性試験のパラダイムを構想しました 。取得された細胞がヒト組織の生理学的条件にさらに近似し、化学的に誘発された有害作用を研究するためのより適切なツールを提供し得るため、多能性幹細胞（PSC）誘導体は、癌細胞モデルの代替物を表し得る。毒性試験の最も有望なPSC培養物の2つの主要なタイプは、現在、基礎研究および再生医療の分野で広く使用されているヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）である2,3 。この専門知識は、新しいクラスのtoxicoloの開発のために利用できるようになりましたin vivoでの悪影響の発症に関与する摂動した生理学的経路を同定することを目的とした生体外試験である。しかし、hESCに基づく規制安全評価の試験方法は、倫理的懸念や胚由来細胞の使用を規制する様々な国内法制のために、EU加盟国および世界各国で受け入れられる可能性は低い。 hiPSCは、hESC4,5と同様の特徴を有し、治療標的の同定および安全性評価の両方のためのインビトロ方法の大きな可能性を保持する。さらに、hiPSC技術は、限られたドナープールの制約および胚由来細胞に関連する倫理的懸念を緩和する。 hiPSCsの主な課題は、これらの細胞が、毒性学的に関連する細胞誘導体の有意な範囲を再現可能に生成することができ、人間の組織に典型的な特徴および応答を有する。選択されたマーカーの所定のレベルは、一般に、分化プロセス後の細胞集団を特徴づけるため、および分化プロセスの安定性に関する洞察を提供するために使用される。 以前の研究では、ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物を生成し、ミトコンドリア呼吸複合体Iの阻害剤であるロテノンの抗酸化物質防御機構の重要な制御因子であるNrf2経路の活性化に対するhiPSCの適合性を評価した多くの細胞型6,7 。 この研究は、ニューロン/グリア分化の際に活性化されるシグナル伝達経路（遺伝子およびタンパク質レベル）に関する詳細を提供する、混合ニューロンおよびグリア培養へのhiPSCの分化に使用されるプロトコールを記載する。さらに、この作品は代表的な結果を示しています。hiPSC由来のニューロンおよびグリア細胞モデルを使用して、ロテノンによる急性（24時間）処置によって誘導されるNrf2シグナル伝達活性化を評価し、酸化ストレス誘導の評価を可能にする。 IMR90線維芽細胞をpMIGベクターを用いて2つの転写因子（Oct4およびSox2）のウイルス形質導入によりI-Stem（フランス）でhiPSCに再プログラムした6 。類似のhiPSCモデルも適用することができる。以下に記載するプロトコールは、hiPSCの神経幹細胞（NSC）への分化のすべての段階、さらに分裂後ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物へのまとめである（ステップ1および2、詳細については、EURL ECVAM DBALMウェブサイトも参照のこと）。プロトコル） 8 。 混合ニューロンおよびグリア細胞へのNSCの単離、拡大、凍結保存、およびさらなる分化のためのさらなるプロトコルは、ステップ3および4で詳述される（EURL ECVAM DBALMこのプロトコルの詳細な説明については、bsiteを参照してください）。ステップ5は、コミットメントおよび分化のいくつかの段階の間に細胞の表現型の同一性を評価するために行うことができる分析を記載する。

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

ヒト多能性幹細胞は、ヒトベースのインビトロ毒性アッセイに適用することができる様々な細胞型に分化することができる。 1つの大きな利点は、体細胞がヒト誘導性多能性幹細胞（hiPSC）を産生するように再プログラムすることにより、ヒト胚性幹細胞（hESC）の使用に関する倫理的および立法上の問題が回避されることである。 HiPSCは、毒性試験のための試験システムとして、特に神経毒性に関与する異なる経路の評価のために役立ち、異なるタイプのニューロンおよびグリア細胞に拡大し、効率的に分化させることができる。この研究は、ニューロンおよびグリア細胞の混合培養物へのhiPSCの分化のためのプロトコールを記載する。ニューロン分化によって調節および/または活性化されるシグナル伝達経路が規定される。この情報は、新しい毒性試験のパラダイムへの細胞モデルの適用に重要であり、化学物質はその能力に基づいて評価されるrturb生物学的経路。概念の証明として、ミトコンドリア呼吸複合体Iの阻害剤であるロテノンを、酸化ストレスに対する抗酸化応答要素（ARE）駆動の細胞防御機構の重要な制御因子であるNrf2シグナル伝達経路の活性化を評価するために使用した。

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Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

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