Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrike), for å gi IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari og Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italia); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr. Tiziana Santini (italiensk institutt for teknologi, Roma), for å gi råd om immunfluorescensfarging evaluering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo, og Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italia), for deres bidrag til RPPA-analysen og antistoffvalidering. Finansiering: dette arbeidet ble støttet av EU-finansiert prosjekt &quot;SCR &amp; Tox&quot; (Grant Agreement nr. 266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Dette arbeidet beskriver en robust og relativt rask protokoll for differensiering av IMR90-hiPSCs i postmittotiske nevroner og glialceller. Tidligere publiserte neuronal differensieringsprotokoller basert på hESCs og hiPSCs gir vanligvis høye prosentvis av nevrale forløpere 25 , 26 og et signifikant antall neuronale målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt er differensieringsprotokollen beskrevet her egnet for å generere heterogene kulturer av GABAergic, glutamatergiske og dopaminerge neuronale celler, sammen med glia og en diskret andel av nestin + -celler. Tilstedeværelsen av glutamatergiske (~ 35-42%) og GABAergic (~ 15-20%) nevrale celler antyder atDenne kulturen har forløp, kortikale egenskaper, og tilstedeværelsen av et diskret antall dopaminerge nevroner (~ 13-20%) kan også indikere midbrainspesifikitet. Videre kan permanentheten til en beskjeden andel av nestin + -celler være egnet for undersøkelsen av nevrogenese og de mulige effektene av kjemikalier på NSC, som hovedsakelig er begrenset til både hippocampus og subventrikulær sone (SVZ) av forebrain 34 . Ytterligere immuncytokjemiske og genuttrykksanalyser vil bidra til å bedre definere den regionale spesifisiteten av de differensierte cellederivatene. De to mest kritiske trinnene i differensieringsprotokollen beskrevet i dette dokumentet er: (i) kutting av hiPSC-kolonier i homogene fragmenter (som er kritisk for generering av EB med homogene størrelser) og (ii) kutting av neuroektodermale strukturer (rosetter ) For NSC-differensiering, som krever betydelig manuell ferdighetOg presisjon for å unngå å samle mesodermale og endodermale celler som kan redusere proporsjonene av nevroner og glialceller oppnådd ved differensiering. Det er avgjørende å karakterisere fenotypene til cellene under ekspansjon (som utifferentierte kolonier eller NSC) og under alle differensieringstrinn. Spesielt bør gen- og proteinuttrykksprofiler av nevron / glialcelle-derivatene vise oppregulering og aktivering av nevronrelaterte signalveier, mens uttrykket av pluripotensmarkører bør reduseres. Genereringen av EB og neuroektodermale derivater (rosettes) kan være manuelt utfordrende og utsatt for variabilitet. Av denne grunn utviklet vi en protokoll for utvidelse av rosett-avledede NSC og deres videre differensiering i nevron / glialceller. Mulige begrensninger av denne differensieringsprotokollen er hovedsakelig (i) den relativt lave prosentandelen av dIfferentiated glialderivater og (ii) mangelen på modne neuronale nettverksfunksjoner (som vist ved mangel på sprekker). Videre kan spesifikke subpopulasjoner av astrocytter fungere som primære progenitorer eller NSCs 35 . Mens nestin / GFAP dobbelt positive celler ikke ble observert i denne differensierte cellekulturen (data ikke vist), er det hypoteset at GFAP + -cellene i disse blandede kulturer er astrocytiske stamceller og astrocytter. Det er plausibelt at ved å forlenge tiden for differensiering, kan antallet astrocytter øke, og deres morfologi kan bli mer moden, som allerede angitt av tidligere verk fra Zhangs gruppe 36 , 37 . I det nye toksisitetsprøveparadigmet er kunnskap om kjemisk induserte forstyrrelser av biologiske veier av største betydning når man vurderer kjemisk motgang. Derfor bør in vitro testsystemer kunneRelaterer bivirkninger til forstyrrelser av signalveier, i henhold til begrepet bivirkningsvei (AOP). Som et bevis på konseptet kan rotenon brukes til å vurdere aktiveringen av Nrf2-banen, som er involvert i det cellulære forsvaret mot oksidativ eller elektrofil stress 38 , og oksidativt stress er en viktig og vanlig nøkkelhendelse i ulike AOPer som er relevante for Utviklings- og voksen nevrotoksisitet 39 . Rotenon bør fremkalle aktiveringen av Nrf2-banen, som kan demonstreres ved Nrf2-proteinkjernetranslokasjon og økt ekspression av Nrf2-mål-enzymer, inkludert NQO1 og SRXN1. Det har blitt funnet at rotenon induserer en doseavhengig økning av GFAP-proteinnivåer, som indikerer astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon reduserer også antall dopaminerge (TH + ) celler, som er i samsvar med previOus in vitro og in vivo studier som viser rotenonavhengig dopaminerge celledød, siden denne typen neuron er spesielt følsom for oksidativt stress 21 , 22 , 23 . Som konklusjon er denne hiPSC-avledede nevron- og glialcellekulturmodellen et verdifullt verktøy for å vurdere de nevrotoksiske virkninger av kjemikalier som fremkaller oksidativt stress som resulterer i Nrf2-pathway-aktivering. Siden denne differensieringsprotokollen tillater generering av blandede kulturer av nevronceller (GABAergic, dopaminergic og glutamatergic neurons) og astrocytter, kan det vise seg egnet til å studere kronestrekningen mellom nevroner og glia i fysiologiske og patologiske forhold, som for eksempel i neurodegenerative sykdommer ( F.eks. Parkinsons sykdom). Videre kan tilstedeværelsen av en betydelig andel NSCs bidra til å vurdere de mulige effektene av kjemikalier på neurale progEnitors, som er kjent for å være hovedmål for kjemisk induserte mutasjoner eller virusinfeksjoner 42 .

Den amerikanske forskningsrådets rapport 1 forestilte et nytt toksisitetsprøveparadigm hvor reguleringstoksisitetstesting skulle forskyves fra en tilnærming som baserer seg på fenotypiske endringer observert hos dyr til en tilnærming som fokuserer på mekanistiske in vitro- analyser ved bruk av humane celler. Pluripotente stamceller (PSC) derivater kan representere alternativer til kreftcellemodeller, da de oppnådde celler kan ligner de fysiologiske tilstandene av humane vev og gi mer relevante verktøy for å studere kjemisk fremkalte bivirkninger. De to hovedtyper av PSC-kulturer som er mest lovende for toksisitetstesting er humane embryonale stamceller (hESCs) og humant induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), som for tiden er mye brukt innen grunnforskning og regenerativ medisin 2 , 3 . Denne kompetansen kan nå utnyttes for utvikling av en ny klasse toxicoloGiske in vitro tester med sikte på å identifisere de forstyrrede fysiologiske banene som er involvert i utviklingen av bivirkninger in vivo . Testmetoder for reguleringssikkerhetsvurderinger basert på hESCs vil imidlertid ikke sannsynligvis bli akseptert av alle EU-landene og landene over hele verden på grunn av mulige etiske bekymringer og ulike nasjonale lovgivningspolitikker som regulerer bruken av embryoavledede celler. HiPSCs deler egenskaper som ligner hESCs 4 , 5 og har stort potensial for in vitro- metoder, både for å identifisere terapeutiske mål, samt for sikkerhetsvurderinger. I tillegg reduserer hiPSC-teknologien begrensningene i et begrenset donorbasseng og de etiske problemene knyttet til embryo-avledede celler. En stor utfordring for hiPSC er demonstrasjonen om at disse cellene reproduserbart kan danne et betydelig utvalg av toksikologisk relevante cellederivater,Med egenskaper og responser som er typiske for humane vev. Forhåndsdefinerte nivåer av de valgte markørene brukes vanligvis til å karakterisere cellepopulasjoner etter differensieringsprosessen og å gi innsikt i stabiliteten av differensieringsprosessen. Tidligere arbeider evaluerte egnethet av hiPSCs for å generere blandede kulturer av nevron- og glialceller og for å vurdere effekten av rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, ved aktivering av Nrf2-banen, en nøkkelregulator for antioksidant-forsvarsmekanismer i Mange celletyper 6 , 7 . Dette arbeidet beskriver en protokoll som brukes for differensiering av hiPSCs i blandede nevron- og glialkulturer, og gir detaljer om signalveiene (gen- og proteinnivå) som aktiveres ved neuronal / glialdifferensiering. I tillegg viser arbeidet representative resultater som viser hvordan detteHiPSC-avledet nevron- og glialcellemodell kan brukes til å vurdere Nrf2-signalaktivisering indusert ved akutt (24-h) behandling med rotenon, som muliggjør vurdering av oksidativ stressinduksjon. IMR90 fibroblaster ble omprogrammert til hiPSCs ved I-Stem (Frankrike) ved viral transduksjon av 2 transkripsjonsfaktorer (okt4 og sox2) ved anvendelse av pMIG vektorer 6 . Analoge HiPSC-modeller kan også brukes. Protokollene beskrevet nedenfor oppsummerer alle stadier av differensiering av hiPSCs i neurale stamceller (NSC) og videre inn i blandede kulturer av postmittotiske nevroner og glialceller (trinn 1 og 2, se også EURL ECVAM DBALM-nettsiden for en detaljert beskrivelse av Protokollen) 8 . En tilleggsprotokoll for isolering, utvidelse, kryopreservering og videre differensiering av NSC i blandede nevroner og glialceller er beskrevet i trinn 3 og 4 (se også EURL ECVAM DBALM viBsite for en detaljert beskrivelse av denne protokollen) 9 . Trinn 5 beskriver analysene som kan gjøres for å vurdere cellens fenotypiske identitet under de flere stadier av engasjement og differensiering.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

Humane pluripotente stamceller kan differensiere til forskjellige celletyper som kan brukes på humane-baserte in vitro toksisitetsanalyser. En stor fordel er at omprogrammeringen av somatiske celler for å produsere humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) unngår de etiske og lovgivningsmessige problemene knyttet til bruken av humane embryonale stamceller (hESCs). HiPSCs kan utvides og effektivt differensieres til forskjellige typer nevrale og glialceller, som tjener som testsystemer for toksisitetstesting, og spesielt for vurdering av forskjellige veier involvert i nevrotoksisitet. Dette arbeidet beskriver en protokoll for differensiering av hiPSCs i blandede kulturer av nevron- og glialceller. Signalveiene som er regulert og / eller aktivert ved neuronal differensiering er definert. Denne informasjonen er kritisk for anvendelsen av cellemodellen til det nye toksisitetsprøveparadigmet, der kjemikalier vurderes ut fra deres evne til å peRturb biologiske veier. Som et bevis på konseptet ble rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, brukt til å vurdere aktiveringen av Nrf2 signalveien, en nøkkelregulator av antioksidant-respons-elementet (ARE) -driven cellulær forsvarsmekanisme mot oksidativ stress .

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Menneskeinducerte pluripotente stamceller (hiPSCs) anses som et kraftig verktøy for stoff- og kjemisk screening og for utvikling av nye in vitro- modeller for toksisitetstesting, inkludert nevrotoksisitet. Her beskrives en detaljert protokoll for differensiering av hiPSCs i nevroner og glia.

Protokol for differensiering av humane inducerte pluripotente stamceller i blandede kulturer av neuroner og glia for test av neurotoxicitet

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensjonal Kvantifisering av dendrittutløperne fra Pyramideformet Nevroner Avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rapid neuronal Differensiering av Induced Pluripotent stamceller for måling Network Aktivitet på Micro-elektrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptiske Microcircuit modellering med 3D Cocultures av astrocyttene og Neurons fra menneskelige Pluripotent stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserte omprogrammering av menneskelig primære fibroblaster til indusert Pluripotent stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...