Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
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Os autores agradecem ao Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, França), por fornecer os IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari e Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Itália); Dr. Simone Haupt (Universidade de Bonn, Alemanha); Dr. Tiziana Santini (Instituto Italiano de Tecnologia, Roma), para fornecer aconselhamento sobre a avaliação da coloração por imunofluorescência; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo e Dr. Luca Persano (Universidade de Pádua, Itália), por suas contribuições para a análise de RPPA e validação de anticorpos. Financiamento: este trabalho foi apoiado pelo projeto financiado pela UE &quot;SCR &amp; Tox&quot; (Acordo de Subsídio N ° 266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho descreve um protocolo robusto e relativamente rápido para a diferenciação de IMR90-hiPSCs em neurônios pós-mitóticos e células gliais. Os protocolos de diferenciação neuronal previamente publicados baseados em hESCs e HiPSCs geralmente produzem altas porcentagens de precursores neurais 25 , 26 e um número significativo de células alvo neuronais 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogamente, o protocolo de diferenciação descrito aqui é adequado para gerar culturas heterogêneas de células neuronais GABAérgicas, glutamatérgicas e dopaminérgicas, juntamente com glia e uma proporção discreta de células nestin + . A presença de células neurais glutamatérgicas (~ 35-42%) e GABAérgicas (~ 15-20%) sugere queEssa cultura possui características anteriores do cérebro, características corticais e a presença de um número discreto de neurônios dopaminérgicos (~ 13-20%) também pode indicar especificidade mesencéfalo. Além disso, a permanência de uma proporção modesta de células nestin + pode ser adequada para o estudo da neurogênese e os possíveis efeitos de substâncias químicas em NSCs, que são principalmente confinados tanto ao hipocampo quanto à zona subventricular (SVZ) do prosencéfalo 34 . Outras análises imunocitoquímicas e de expressão gênica ajudariam a definir melhor a especificidade regional dos derivados de células diferenciadas. Os dois passos mais críticos no protocolo de diferenciação descrito neste documento são: (i) o corte de colônias de hiPSC em fragmentos homogêneos (o que é crítico para a geração de EBs com tamanhos homogêneos) e (ii) o corte de estruturas neuroectodérmicas (rosetas ) Para diferenciação NSC, que requer habilidade manual significativaE precisão para evitar a coleta de células mesodérmicas e endodérmicas que podem reduzir as proporções de neurônios e células gliais obtidas após a diferenciação. É crucial caracterizar os fenótipos das células durante a expansão (como colônias indiferenciadas ou NSCs) e durante todas as etapas de diferenciação. Em particular, os perfis de expressão de genes e proteínas dos derivados das células neuronais / gliais devem mostrar uma regulação positiva e ativação de caminhos de sinalização relacionados aos neurônios, enquanto que a expressão de marcadores de pluripotência deve ser diminuída. A geração de EBs e derivados neuroectodermais (rosetas) podem ser desafiantes manualmente e propensos a variabilidade. Por esse motivo, desenvolvemos um protocolo para a expansão de NSC derivadas de roseta e sua maior diferenciação em células neuronais / gliais. Possíveis limitações deste protocolo de diferenciação são principalmente (i) a porcentagem relativamente baixa de dDerivados gliais indiferenciados e (ii) Falta de funções de rede neuronal maduras (como mostra a falta de explosões). Além disso, subpopulações específicas de astrocitos podem funcionar como progenitores primários ou NSCs 35 . Embora não tenham sido observadas células níquel / GFAP duplo-positivas nesta cultura de células diferenciadas (dados não apresentados), a hipótese de que as células GFAP + nestas culturas são progenitores astrócitos e astrócitos. É plausível que, ao ampliar o tempo de diferenciação, o número de astrocitos pode aumentar, e sua morfologia pode tornar-se mais madura, como já foi indicado por trabalhos anteriores do grupo 36 , 37 de Zhang. No novo paradigma de teste de toxicidade, o conhecimento sobre perturbações induzidas por produtos químicos das vias biológicas é de extrema importância na avaliação da adversidade química. Portanto, os sistemas de teste in vitro devem ser capazes deRelacionar efeitos adversos com os distúrbios das vias de sinalização, de acordo com o conceito de via de desfecho adverso (AOP). Como uma prova de conceito, a rotenona pode ser usada para avaliar a ativação da via Nrf2, que está envolvida na defesa celular contra o estresse oxidativo ou eletrofílico 38 e o estresse oxidativo é um evento chave importante e comum em vários AOPs relevantes para Neurotoxicidade no desenvolvimento e adulto 39 . Rotenone deve induzir a ativação da via Nrf2, que pode ser demonstrada pela translocação nuclear da proteína Nrf2 e pelo aumento da expressão de enzimas alvo Nrf2, incluindo NQO1 e SRXN1. Verificou-se que a rotenona induz um aumento dose-dependente de níveis de proteína GFAP, indicativo de ativação de astrocitos 40 , 41 . Rotenone também diminui o número de células dopaminérgicas (TH + ), que está de acordo com previEstudos in vitro e in vivo que mostram morte celular dopaminérgica dependente de rotenona, uma vez que este tipo de neurônio é particularmente sensível ao estresse oxidativo 21 , 22 , 23 . Em conclusão, este modelo de cultura celular neuronal e glial derivado de HiPSC é uma ferramenta valiosa para avaliar os efeitos neurotóxicos de produtos químicos que provocam estresse oxidativo, resultando na ativação da via Nrf2. Como este protocolo de diferenciação permite a geração de culturas mistas de células neuronais (neurônios GABAérgicos, dopaminérgicos e glutamatérgicos) e astrócitos, pode ser adequado para estudar a interferência entre neurônios e glia em condições fisiológicas e patológicas, como em doenças neurodegenerativas ( Por exemplo, doença de Parkinson). Além disso, a presença de uma proporção significativa de NSCs pode ajudar a avaliar os possíveis efeitos de produtos químicos no prog neuralEnors, que são conhecidos como o alvo principal de mutações ou infecções virais quimicamente induzidas 42 .

O relatório do Conselho Nacional de Pesquisa dos EUA 1 prevê um novo paradigma de teste de toxicidade em que o teste de toxicidade regulatória seria deslocado de uma abordagem que dependesse de alterações fenotípicas observadas em animais para uma abordagem focada em ensaios in vitro mecanicistas usando células humanas. Os derivados de células estaminais pluripotentes (PSC) podem representar alternativas aos modelos de células cancerosas, pois as células obtidas podem se assemelhar mais às condições fisiológicas dos tecidos humanos e fornecer ferramentas mais relevantes para estudar os efeitos adversos induzidos por produtos químicos. Os dois principais tipos de culturas de PSC que são mais promissores para o teste de toxicidade são as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSCs), que atualmente são amplamente utilizadas nas áreas de pesquisa básica e medicina regenerativa 2 , 3 . Esta experiência agora pode ser aproveitada para o desenvolvimento de uma nova classe de toxoloTestes in vitro in vitro destinados a identificar as vias fisiológicas perturbadas envolvidas no desenvolvimento de efeitos adversos in vivo . No entanto, os métodos de teste para avaliações de segurança regulamentares baseadas em hESCs não deverão ser aceitos por todos os Estados-Membros da UE e por países em todo o mundo devido a possíveis preocupações éticas e diversas políticas legislativas nacionais que regulam o uso de células derivadas de embriões. Os hiPSCs compartilham características semelhantes aos hESCs 4 , 5 e possuem grande potencial para métodos in vitro , tanto para identificar alvos terapêuticos como para avaliações de segurança. Além disso, a tecnologia hiPSC mitiga as restrições de um pool de doadores limitado e as preocupações éticas associadas às células derivadas de embriões. Um grande desafio para o HiPSCs é a demonstração de que essas células podem gerar de forma reprodutiva uma gama significativa de derivados de células toxicologicamente relevantes,Com características e respostas típicas dos tecidos humanos. Os níveis predefinidos dos marcadores selecionados geralmente são usados ​​para caracterizar as populações celulares após o processo de diferenciação e fornecer informações sobre a estabilidade do processo de diferenciação. Trabalhos anteriores avaliaram a adequação de hiPSCs para gerar culturas mistas de células neuronais e gliais e avaliar os efeitos da rotenona, um inibidor do complexo respiratório mitocondrial I, na ativação da via Nrf2, um regulador chave dos mecanismos de defesa antioxidante em Muitos tipos de células 6 , 7 . Este trabalho descreve um protocolo usado para a diferenciação de HiPSCs em culturas mestiças neuronais e gliais, fornecendo detalhes sobre as vias de sinalização (gene e nível de proteína) que são ativadas na diferenciação neuronal / glial. Além disso, o trabalho mostra resultados representativos demonstrando como issoO modelo de células neuronais e gliais derivadas de HiPSC pode ser usado para avaliar a ativação da sinalização Nrf2 induzida por tratamento agudo (24 h) com rotenona, permitindo a avaliação da indução do estresse oxidativo. Os fibroblastos IMR90 foram reprogramados em hiPSCs em I-Stem (França) pela transdução viral de 2 fatores de transcrição (Oct4 e Sox2) usando vetores pMIG 6 . Modelos hiPSC análogos também podem ser aplicados. Os protocolos descritos abaixo resumem todos os estágios de diferenciação de hiPSCs em células-tronco neurais (NSCs) e mais em culturas mistas de neurônios pós-mitóticos e células gliais (etapas 1 e 2, veja também o site EURL ECVAM DBALM para uma descrição detalhada de O protocolo) 8 . Um protocolo adicional para o isolamento, expansão, criopreservação e maior diferenciação de NSCs em neurônios misturados e células gliais é detalhado nas etapas 3 e 4 (também se referem ao EURL ECVAM DBALM nósBsite para uma descrição detalhada deste protocolo) 9 . O Passo 5 descreve as análises que podem ser feitas para avaliar a identidade fenotípica das células durante os vários estágios de compromisso e diferenciação.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

As células estaminais pluripotentes humanas podem se diferenciar em vários tipos de células que podem ser aplicadas a ensaios de toxicidade in vitro baseados em humanos. Uma grande vantagem é que a reprogramação de células somáticas para produzir células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (HiPSCs) evita as questões éticas e legislativas relacionadas ao uso de células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Os HiPSCs podem ser expandidos e diferenciados de forma eficiente em diferentes tipos de células neuronais e gliais, servindo como sistemas de teste para testes de toxicidade e, em particular, para a avaliação de diferentes caminhos envolvidos na neurotoxicidade. Este trabalho descreve um protocolo para a diferenciação de hiPSCs em culturas mistas de células neuronais e gliais. As vias de sinalização que são reguladas e / ou ativadas pela diferenciação neuronal são definidas. Esta informação é fundamental para a aplicação do modelo celular ao novo paradigma de teste de toxicidade, no qual os produtos químicos são avaliados com base na sua capacidade de peRturb caminhos biológicos. Como uma prova de conceito, a rotenona, um inibidor do complexo respiratório mitocondrial I, foi utilizada para avaliar a ativação da via de sinalização Nrf2, um regulador chave do mecanismo de defesa celular anti-oxidante-resposta-elemento- (ARE) contra o estresse oxidativo .

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Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Biologia do Desenvolvimento

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...