Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Марка Пещански (I-Stem, Évry, Франция) за предоставление IMR90-hiPSC; Д-р Джованна Лаззари и д-р Сильвия Коллени (Avantea srl, Кремона, Италия); Д-р Симоне Хаупт (Университет Бонна, Германия); Д-р Tiziana Santini (Итальянский технологический институт, Рим) за предоставление рекомендаций по оценке окраски иммунофлюоресценцией; Д-р Бенедетта Аккорди, д-р Елена Рампаццо и д-р Лука Персано (Университет Падуи, Италия) за их вклад в анализ RPPA и проверку антител. Финансирование: эта работа была поддержана финансируемым ЕС проектом «SCR &amp; Tox» (Соглашение о гранте № 266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа описывает надежный и относительно быстрый протокол для дифференциации IMR90-hiPSC в постмитотические нейроны и глиальные клетки. Ранее опубликованные протоколы дифференцировки нейронов на основе hESC и hiPSC обычно дают высокие проценты нейронных предшественников 25 , 26 и значительное количество нейронных клеток-мишеней 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Аналогично описанный здесь протокол дифференцирования подходит для генерации гетерогенных культур ГАМКергических, глутаматергических и допаминергических нейронных клеток, а также глии и дискретной доли нестиновых + клеток. Наличие глутаматергических (~ 35-42%) и ГАМКергических (~ 15-20%) нейронных клеток предполагает, чтоЭта культура обладает передним мозгом, кортикальными особенностями, а наличие дискретного числа дофаминергических нейронов (~ 13-20%) также может указывать на специфичность среднего мозга. Кроме того, постоянство умеренной доли нестин + клеток может оказаться подходящим для изучения нейрогенеза и возможных эффектов химических веществ на НСК, которые в основном ограничены как гиппокампом, так и субвентрикулярной зоной (СВЗ) переднего мозга 34 . Дальнейшие анализы на иммуноцитохимические и генные экспрессии помогут лучше определить региональную специфичность дифференцированных клеточных производных. Двумя наиболее важными шагами в протоколе дифференцирования, описанными в этом документе, являются: (i) разрезание колоний hiPSC на гомогенные фрагменты (что имеет решающее значение для генерации EB с однородными размерами) и (ii) резка нейроэктодермальных структур (розетки ) Для дифференциации НБК, что требует значительного ручного уменияИ точность, чтобы избежать сбора мезодермальных и эндодермальных клеток, которые могут уменьшить пропорции нейронов и глиальных клеток, полученных при дифференцировке. Крайне важно охарактеризовать фенотипы клеток во время расширения (как недифференцированные колонии или НСК) и на всех этапах дифференциации. В частности, профили экспрессии гена и белка производных нейронов / глиальных клеток должны проявлять повышенную регуляцию и активацию нейронов, связанных с сигнальными путями, тогда как выражение плюрипотентных маркеров должно быть уменьшено. Генерация EB и нейроэктодермальных производных (розеток) может быть рутинной и подверженной изменчивости. По этой причине мы разработали протокол для расширения NSC розеток и их дальнейшей дифференциации в нейронные / глиальные клетки. Возможные ограничения этого протокола дифференциации заключаются в основном (i) относительно низкий процент dДифференцированные глиальные производные и (ii) отсутствие зрелых функций нейронной сети (как показывает отсутствие всплесков). Более того, специфические субпопуляции астроцитов могут функционировать в качестве первичных предшественников или НСК 35 . Хотя в этой дифференцированной клеточной культуре (данные не показаны) не наблюдались двухполюсные клетки нестина / GFAP, предполагается, что клетки GFAP + в этих смешанных культурах являются астроцитарными предшественниками и астроцитами. Правдоподобно, что, расширяя время дифференциации, число астроцитов может увеличиваться, и их морфология может стать более зрелой, как уже указывалось в предыдущих работах из группы 36 , 37 Чжан. В новой парадигме тестирования токсичности знания об индуцированных химическими веществами возмущениях биологических путей имеют огромное значение при оценке химической невзгоды. Поэтому в тестовых системах in vitro должны бытьОтносятся к неблагоприятным последствиям для нарушений сигнальных путей в соответствии с концепцией неблагоприятного пути исхода (АОП). В качестве доказательства концепции ротенон можно использовать для оценки активации пути Nrf2, который участвует в клеточной защите от окислительного или электрофильного стресса 38 , а окислительный стресс является важным и общим ключевым событием в различных АОП, относящихся к Развивающая и нейротоксичность взрослых 39 . Ротенон должен вызывать активацию пути Nrf2, что может быть продемонстрировано путем транслокации белка Nrf2 белка и повышенной экспрессии ферментов Nrf2-мишеней, включая NQO1 и SRXN1. Было обнаружено, что ротенон вызывает зависящее от дозы увеличение уровней белка GFAP, что указывает на активацию астроцитов 40 , 41 . Rotenone также уменьшает количество допаминергических (TH + ) клеток, что согласуется сИсследования in vitro и in vivo , показывающие гибель ротенон-зависимой гибели дофаминергических клеток, поскольку этот тип нейронов особенно чувствителен к окислительному стрессу 21 , 22 , 23 . В заключение, эта модель культивирования нейронов и глиальных клеток hiPSC является ценным инструментом для оценки нейротоксических эффектов химических веществ, которые вызывают окислительный стресс, приводящий к активации пути Nrf2. Поскольку этот протокол дифференциации позволяет генерировать смешанные культуры нейронных клеток (ГАМКергические, дофаминергические и глутаматергические нейроны) и астроциты, он может оказаться подходящим для изучения перекрестных помех между нейронами и глиями в физиологических и патологических состояниях, таких как нейродегенеративные заболевания ( Например, болезнь Паркинсона). Более того, наличие значительной доли НСК может помочь оценить возможные последствия химических веществ для нейронных прогКоторые, как известно, являются основной мишенью химически индуцированных мутаций или вирусных инфекций 42 .

В докладе Национального исследовательского совета США 1 предусматривалась новая парадигма тестирования токсичности, в которой нормативное тестирование токсичности было бы смещено от подхода, основанного на фенотипических изменениях, наблюдаемых у животных, к подходу, ориентированному на механистические анализы in vitro с использованием человеческих клеток. Производные плурипотентных стволовых клеток (PSC) могут представлять собой альтернативы моделям раковых клеток, поскольку полученные клетки могут более близко напоминать физиологические условия тканей человека и предоставлять более подходящие инструменты для изучения химически индуцированных побочных эффектов. Двумя основными типами культур PSC, наиболее перспективными для тестирования на токсичность, являются эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), которые в настоящее время широко используются в областях фундаментальных исследований и регенеративной медицины 2 , 3 . Теперь этот опыт может быть использован для разработки нового класса токсикологическихКоторые были направлены на выявление нарушенных физиологических путей, связанных с развитием неблагоприятных эффектов in vivo . Тем не менее, методы испытаний для оценки безопасности безопасности, основанные на hESC, вряд ли будут приняты всеми государствами-членами ЕС и странами мира из-за возможных этических проблем и разнообразной национальной законодательной политики, регулирующей использование клеток, полученных из эмбрионов. HiPSCs разделяют характеристики, подобные hESCs 4 , 5, и обладают большим потенциалом для методов in vitro как для определения терапевтических целей, так и для оценки безопасности. Кроме того, технология hiPSC смягчает ограничения ограниченного пула доноров и этические проблемы, связанные с клетками, полученными из эмбрионов. Основной проблемой для hiPSC является демонстрация того, что эти клетки могут воспроизводимо генерировать значительный спектр токсикологически значимых клеточных производных,С характеристиками и ответами, характерными для тканей человека. Предопределенные уровни выбранных маркеров обычно используются для характеристики популяций клеток после процесса дифференциации и для обеспечения понимания стабильности процесса дифференциации. Предыдущие работы оценивали пригодность hiPSC для создания смешанных культур нейронных и глиальных клеток и для оценки влияния ротенона, ингибитора митохондриального дыхательного комплекса I, на активацию пути Nrf2, ключевого регулятора антиоксидантных защитных механизмов в Многие типы клеток 6 , 7 . В этой работе описывается протокол, используемый для дифференциации hiPSCs в смешанные нейронные и глиальные культуры, с подробной информацией о сигнальных путях (ген и уровень белка), которые активируются при дифференцировке нейронов / глиальных клеток. Кроме того, в работе показаны репрезентативные результаты, демонстрирующиеМодель нейронов и клеток глиальных клеток hiPSC может использоваться для оценки активации сигнализации Nrf2, вызванной острой (24-часовой) обработкой ротеноном, что позволяет оценить индукцию окислительного стресса. Фибробласты IMR90 перепрограммировали в hiPSC в I-Stem (Франция) путем вирусной трансдукции 2 транскрипционных факторов (Oct4 и Sox2) с использованием векторов pMIG 6 . Аналогичные модели hiPSC также могут применяться. Описанные ниже протоколы суммируют все этапы дифференциации hiPSC в нервные стволовые клетки (NSC) и далее в смешанные культуры постмитотических нейронов и глиальных клеток (этапы 1 и 2 также см. На веб-сайте EURL ECVAM DBALM для подробного описания Протокол). Дополнительный протокол для выделения, расширения, криоконсервации и дальнейшей дифференциации НСК в смешанные нейроны и глиальные клетки подробно описан в шагах 3 и 4 (также см. EURL ECVAM DBALM weBsite для подробного описания этого протокола). 9 . Шаг 5 описывает анализ, который можно сделать для оценки фенотипической идентичности клеток в течение нескольких этапов приверженности и дифференциации.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток, которые могут быть применены к анализу токсичности in vitro человека. Одним из основных преимуществ является то, что перепрограммирование соматических клеток для продуцирования индуцированных человеком стволовых клеток (hiPSC) позволяет избежать этических и законодательных вопросов, связанных с использованием эмбриональных стволовых клеток человека (hESC). HiPSC могут быть расширены и эффективно дифференцированы в различные типы нейронных и глиальных клеток, которые служат в качестве тестовых систем для тестирования токсичности и, в частности, для оценки различных путей, связанных с нейротоксичностью. В этой работе описывается протокол дифференциации hiPSCs в смешанные культуры нейронных и глиальных клеток. Определены сигнальные пути, которые регулируются и / или активируются дифференцированием нейронов. Эта информация имеет решающее значение для применения модели клетки к новой парадигме тестирования токсичности, в которой химические вещества оцениваются на основе их способности к peБиологические пути. В качестве доказательства концепции ротенон, ингибитор митохондриального дыхательного комплекса I, был использован для оценки активации сигнального пути Nrf2, ключевого регулятора антиокислительного реагирующего элемента (ARE) -дренажного клеточного защитного механизма против окислительного стресса ,

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Связанные с человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) считаются мощным инструментом для скрининга на наркотики и химические вещества и для разработки новых моделей in vitro для тестирования токсичности, включая нейротоксичность. Здесь описан подробный протокол для дифференциации hiPSCs в нейроны и глии.

Протокол дифференцирования индуцированных человеком стволовых клеток с плюрипотентными клетками в смешанные культуры нейронов и глии для тестирования нейротоксичности

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Трехмерная Количественное дендритных шипиков пирамидальных нейронов из производных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Крупномасштабное производство кардиомиоцитов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с использованием высокой воспроизводимостью Малый протокол Дифференциация Molecule на основе

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Дифференциация человека плюрипотентных стволовых клеток в клетки трофобласта

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Моделирование синаптических микросхемы с 3D Cocultures астроциты и нейроны от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

На базе РНК перепрограммирование первичной фибробластов в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...