Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Författarna vill tacka doktor Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrike) för att tillhandahålla IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari och Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italien); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr Tiziana Santini (Italienska Tekniska Institutet, Rom), för att ge råd om immunfluorescensfärgningsutvärdering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo och Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italien), för deras bidrag till RPPA-analysen och antikroppsvalideringen. Finansiering: Detta arbete stöddes av det EU-finansierade projektet &quot;SCR &amp; Tox&quot; (Grantavtal nr 266753).

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

Författarna har ingenting att avslöja.

Detta arbete beskriver ett robust och relativt snabbt protokoll för differentieringen av IMR90-hiPSCs i postmittotiska neuroner och glialceller. Tidigare publicerade neuronal differentieringsprotokoll baserade på hESCs och hiPSCs ger vanligtvis höga procenttal av neurala prekursorer 25 , 26 och ett signifikant antal neuronala målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt är det här beskrivna differentieringsprotokollet lämpligt att alstra heterogena kulturer av GABAergic, glutamatergiska och dopaminerga neuronala celler, tillsammans med glia och en diskret andel av nestin + -celler. Närvaron av glutamatergiska (~ 35-42%) och GABAergic (~ 15-20%) neurala celler föreslår attDenna kultur har förekomst, kortikaliknande egenskaper och närvaron av ett diskret antal dopaminerga neuroner (~ 13-20%) kan också indikera midbrainspecificitet. Dessutom kan permanentiteten hos en blygsam mängd nestin + -celler vara lämplig för studier av neurogenes och de möjliga effekterna av kemikalier på NSC, vilka huvudsakligen är begränsade till både hippocampus och subventrikulära zonen (SVZ) hos förkärnan 34 . Ytterligare immunocytokemiska och genuttrycksanalyser skulle bidra till att bättre definiera den regionala specificiteten hos de differentierade cellderivaten. De två mest kritiska stegen i differentieringsprotokollet som beskrivs i detta dokument är: (i) skärning av hiPSC-kolonier i homogena fragment (vilket är kritiskt för generering av EB med homogena storlekar) och (ii) skärning av neuroektodermala strukturer (rosetter ) För NSC-differentiering, vilket kräver betydande manuell skicklighetOch precision för att undvika att samla mesodermala och endodermala celler som kan minska proportionerna av neuroner och glialceller erhållna vid differentiering. Det är avgörande att karakterisera fenotyperna hos cellerna under expansionen (som odifferentierade kolonier eller NSC) och under alla differentieringssteg. I synnerhet bör gen- och proteinuttrycksprofilerna för neuronala / glialcellderivaten uppvisa uppreglering och aktivering av neuronrelaterade signalvägar, medan uttrycket av pluripotensmarkörer bör minskas. Genereringen av EB och neuroektodermala derivat (rosetter) kan vara manuellt utmanande och benägen att variabilitet. Av detta skäl utvecklade vi ett protokoll för expansion av rosett-härledda NSC och deras ytterligare differentiering i neuronala / glialceller. Eventuella begränsningar av detta differentieringsprotokoll är huvudsakligen (i) den relativt låga procenten av dIfferenterade glialderivat och (ii) bristen på mogna neuronala nätverksfunktioner (som visas genom brist på brister). Dessutom kan specifika subpopulationer av astrocyter fungera som primära progenitorer eller NSC 35 . Medan nestin / GFAP-dubbelpositiva celler inte observerades i denna differentierade cellodling (data ej visad) antas det att GFAP + -cellerna i dessa blandade kulturer är astrocytiska progenitorer och astrocyter. Det är rimligt att genom att förlänga tiden för differentiering kan antalet astrocyter öka, och deras morfologi kan bli mer mogen, vilket redan indikerats av tidigare arbeten från Zhangs grupp 36 , 37 . I det nya testmetoden för toxicitetstest är kunskap om kemiska inducerade störningar av biologiska vägar av yttersta vikt vid bedömning av kemisk motgång. Därför bör in vitro testsystem kunnaRelatera biverkningar till störningar av signalvägar, enligt begreppet biverkningsväg (AOP). Som ett bevis på konceptet kan rotenon användas för att bedöma aktiveringen av Nrf2-vägen, vilken är involverad i det cellulära försvaret mot oxidativ eller elektrofil stress 38 och oxidativ stress är en viktig och gemensam nyckelhändelse i olika AOPs relevanta för Utvecklings- och vuxen neurotoxicitet 39 . Rotenon bör framkalla aktiveringen av Nrf2-vägen, som kan demonstreras genom Nrf2-proteinkärntransplokation och ökat uttryck av Nrf2-målenzymer, inklusive NQO1 och SRXN1. Det har visat sig att rotenon inducerar en dosberoende ökning av GFAP-proteinnivåer, vilket indikerar astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon minskar också antalet dopaminerga (TH + ) celler, vilket överensstämmer med previIn vitro och in vivo- studier som visar rotenonberoende dopaminergcelldöd, eftersom denna typ av neuron är särskilt känslig för oxidativ stress 21 , 22 , 23 . Sammanfattningsvis är denna hiPSC-härledda neuron- och glialcellodlingsmodellen ett värdefullt verktyg för att bedöma de neurotoxiska effekterna av kemikalier som framkallar oxidativ stress vilket resulterar i Nrf2-vägens aktivering. Eftersom detta differentieringsprotokoll möjliggör generering av blandade kulturer av neuronala celler (GABAergic, dopaminerga och glutamatergiska neuroner) och astrocyter, kan det visa sig lämpligt för att studera crosstalk mellan neuroner och glia i fysiologiska och patologiska tillstånd, såsom i neurodegenerativa sjukdomar ( T.ex. Parkinsons sjukdom). Vidare kan förekomsten av en betydande andel av NSC-värdena bidra till att bedöma de möjliga effekterna av kemikalier på neurala progEnitors, som är kända för att vara huvudmålet för kemiskt inducerade mutationer eller virusinfektioner 42 .

USA: s forskningsrådets rapport 1 föreslog ett nytt toxicitetsprovningsparadigm där reglerings toxicitetstestning skulle flyttas från ett tillvägagångssätt baserat på fenotypiska förändringar observerade hos djur till ett tillvägagångssätt som fokuserade på mekaniska in vitro- analyser med användning av humana celler. Pluripotenta stamceller (PSC) derivat kan representera alternativ till cancercellsmodeller, eftersom de erhållna cellerna mer kan likna de fysiologiska förhållandena hos humana vävnader och tillhandahålla mer relevanta verktyg för att studera kemiskt inducerade negativa effekter. De två huvudtyperna av PSC-kulturer som är mest lovande för toxicitetstestning är humana embryonala stamceller (hESCs) och humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), som för närvarande används i stor utsträckning inom områdena grundforskning och regenerativ medicin 2 , 3 . Denna kompetens kan nu utnyttjas för utveckling av en ny klass av toxicoloGiska in vitro- tester som syftar till att identifiera de störda fysiologiska vägarna som är inblandade i utvecklingen av negativa effekter in vivo . Testmetoder för säkerhetsbedömningar på grundval av hESCs skulle dock inte troligtvis godtas av alla EU-medlemsstater och länder över hela världen på grund av möjliga etiska problem och olika nationella lagstiftningspolitiska regler som reglerar användningen av embryon-härledda celler. HiPSCs delar egenskaper som liknar hESCs 4 , 5 och har stor potential för in vitro- metoder, både för att identifiera terapeutiska mål och för säkerhetsbedömningar. Dessutom mildrar hiPSC-tekniken begränsningarna för en begränsad givarpool och de etiska problem som är förknippade med embryo-härledda celler. En stor utmaning för hiPSCs är demonstrationen att dessa celler reproducerbart kan generera ett betydande antal toxikologiskt relevanta cellderivat,Med egenskaper och svar som är typiska för mänskliga vävnader. Fördefinierade nivåer av de markerade markörerna används allmänt för att karakterisera cellpopulationer efter differentieringsprocessen och för att ge insikt i stabiliteten i differentieringsprocessen. Tidigare verk utvärderade lämpligheten hos hiPSCs för att generera blandade kulturer av neuronala och glialceller och för att bedöma effekterna av rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk komplex I, vid aktiveringen av Nrf2-vägen, en nyckelregulator för antioxidantförsvarsmekanismer i Många celltyper 6 , 7 . Detta arbete beskriver ett protokoll som används för differentiering av hiPSCs i blandade neuronala och glialkulturer, vilket ger detaljer om signaleringsvägarna (gen- och proteinnivå) som aktiveras vid neuronal / glialifferentiering. Dessutom visar arbetet representativa resultat som visar hur dettaHiPSC-härledd neuron- och glialcellsmodell kan användas för att bedöma Nrf2-signaleringsaktivering inducerad genom akut (24-h) behandling med rotenon vilket möjliggör bedömning av oxidativ stressinduktion. IMR90-fibroblaster omprogrammerades till hiPSCs vid I-Stem (Frankrike) genom viraltransduktion av 2 transkriptionsfaktorer (Oct4 och Sox2) med användning av pMIG-vektorer 6 . Analoga HiPSC-modeller kan också appliceras. Protokollen som beskrivs nedan sammanfatta alla stadier av differentiering av hiPSCs till neurala stamceller (NSC) och vidare i blandade kulturer av postmittotiska neuroner och glialceller (steg 1 och 2, se även EURL ECVAM DBALM-webbplatsen för en detaljerad beskrivning av Protokollet) 8 . Ett tilläggsprotokoll för isolering, expansion, kryopreservering och ytterligare differentiering av NSC i blandade neuroner och glialceller beskrivs i steg 3 och 4 (se även EURL ECVAM DBALM viBsite för en detaljerad beskrivning av detta protokoll) 9 . Steg 5 beskriver de analyser som kan göras för att bedöma cellens fenotypiska identitet under de flera stadierna av engagemang och differentiering.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

Humana pluripotenta stamceller kan differentiera till olika celltyper som kan appliceras på humana-baserade in vitro- toxicitetsanalyser. En stor fördel är att omprogrammeringen av somatiska celler för att producera humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) undviker de etiska och lagstiftande frågorna i samband med användningen av mänskliga embryonala stamceller (hESCs). HiPSCs kan expanderas och effektivt differentieras till olika typer av neuronala och glialceller, som tjänar som testsystem för toxicitetstestning och i synnerhet för bedömning av olika vägar som är involverade i neurotoxicitet. Detta arbete beskriver ett protokoll för differentieringen av hiPSCs i blandade kulturer av neuronala och glialceller. Signalvägarna som regleras och / eller aktiveras genom neuronal differentiering definieras. Denna information är avgörande för cellmodellens tillämpning på det nya testmetoden för toxicitet, där kemikalier bedöms utifrån deras förmåga att peRturb biologiska vägar. Som ett bevis på konceptet användes rotenon, en hämmare av mitokondriell respiratorisk komplex I, för att bedöma aktiveringen av Nrf2-signaleringsvägen, en nyckelregulator för antioxidant-respons-element- (ARE) -driven cellulär försvarsmekanism mot oxidativ stress .

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Mänskligt inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) anses vara ett kraftfullt verktyg för drog- och kemisk screening och för utveckling av nya in vitro- modeller för toxicitetstestning, inklusive neurotoxicitet. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för differentieringen av hiPSCs i neuroner och glia.

Protokoll för differentieringen av humant inducerade plöripotenta stamceller i blandade kulturer av neuroner och Glia för neurotoxicitetstestning

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tredimensionell Kvantifiering av Dendritutskotten från Pyramidal nervceller Härstammar från Human inducerade pluripotenta stamceller

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Snabb neuronal differentiering av inducerade pluripotenta stamceller för att mäta nätverksaktivitet på Micro-elektrod arrayer

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Synaptic resonanskrets modellering med 3D Cocultures av astrocyter och nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserade omprogrammering av mänskliga primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...