Name: protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Yazarlar IMR90-hiPSC&#39;leri sağlamak için Dr. Marc Peschanski&#39;ye (I-Stem, Évry, Fransa) teşekkür etmek istiyor; Giovanna Lazzari ve Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, İtalya); Simone Haupt (Bonn Üniversitesi, Almanya); Tiziana Santini (İtalyan Teknoloji Enstitüsü, Roma), immünofloresan boyama değerlendirmesine ilişkin tavsiyelerde bulundu; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo ve Dr. Luca Persano (Padua Üniversitesi, İtalya), RPPA analizine ve antikor doğrulamasına katkılarından ötürü. Finansman: Bu çalışma AB fonlu &quot;SCR &amp; Tox&quot; projesi (Hibe Anlaşması N ° 266753) tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>NRC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications.">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells:+possibilities+and+challenges.">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li><li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency.">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li><li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing.">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity:+effects+of+CREB+pathway+inhibition.">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li><li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li><li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016)</li><li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM Available from: <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016)</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening.">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li><li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL.">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).</li><li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing.">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li><li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro.">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li><li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2+cell+defence+pathway:+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation.">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li><li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2/ARE+Pathway:+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson's+Disease.">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082 (2011).</li><li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase.">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li><li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons.">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Nrf2/small+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements.">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2/ARE+pathway+activation,+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K/AKT+signaling.">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li><li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson's+disease.">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li><li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation.">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li><li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures.">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors.">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li><li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases.">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495 (2015).</li><li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li><li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction.">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273 (2011).</li><li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li><li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells:+MPP++toxicity+and+GDNF+neuroprotection.">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li><li>Pa&#351;ca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons.">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li><li>Urb&#225;n, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain:+same+regulators,+different+roles.">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress.">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li><li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity.">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li><li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functions+in+astrocytes:+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone.">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li><li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+activation:+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage.">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li><li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+toxicology:+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities.">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma, IMR90-hiPSC&#39;lerin post mitotik nöronlar ve glial hücrelere diferansiyelleştirilmesi için sağlam ve nispeten hızlı bir protokolü açıklamaktadır. HESC&#39;lere ve hiPSC&#39;lere dayalı daha önce yayınlanmış nöronal farklılaşma protokolleri genellikle yüksek yüzdeli nöral öncüllerin 25 , 26 ve anlamlı sayıda nöronal hedef hücreleri 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 getirir. Benzer şekilde, burada açıklanan farklılaşma protokolü, glia ve nestin + hücrelerinin ayrı bir oranı ile birlikte heterojen kültür GABAergic, glutamaterjik ve dopaminerjik nöronal hücreler üretmek için uygundur. Glutamaterjik (~% 35-42) ve GABAerjik (~% 15-20) sinir hücrelerinin varlığı,Bu kültür, ön beyin, kortikal benzeri özellikler taşır ve ayrı sayıda dopaminerjik nöronların varlığı (~% 13-20) orta beyin özgüllüğünü de gösterebilir. Buna ek olarak, nestin + hücrelerinin mütevazı bir oranının kalıcılığı, nörogenezin çalışılması ve öncelikle ön beyin 34&#39;ün hipokampus ve subventriküler bölgesi (SVZ) ile sınırlı olan NSC&#39;ler üzerindeki kimyasalların olası etkileri için uygun olduğunu ispatlayabilir. Daha ileri immünositokimyasal ve gen ekspresyon analizleri, farklılaşmış hücre türevlerinin bölgesel özgüllüğünü daha iyi tanımlamaya yardımcı olur. Bu belgede tanımlanan farklılaştırma protokolündeki en kritik adımlar şunlardır: (i) hiPSC kolonilerinin homojen fragmanlara (homojen boyutlara sahip EB&#39;lerin üretilmesi için kritik önemi olan) kesilmesi ve (ii) nöroektodermal yapıların kesilmesi (rozetler ), Önemli manuel beceri gerektiren NSC farklılaştırması içinVe farklılık üzerine elde edilen nöronların ve glial hücrelerin oranlarını azaltabilecek mesodermal ve endodermal hücrelerin toplanmasını önlemek için hassasiyet. Genişleme sırasında (tanımlanmamış koloniler veya NSC&#39;ler olarak) hücrelerin fenotiplerini karakterize etmek ve tüm farklılaşma adımları boyunca önemlidir. Özellikle, nöronal / glial hücre türevlerinin gen ve protein ekspresyon profilleri, nöronla ilgili sinyal yollarının upregülasyonunu ve aktivasyonunu göstermekle birlikte pluripotens belirteçlerinin ekspresyonu azaltılmalıdır. EB&#39;lerin ve nöroektodermal türevlerin (rozetlerin) üretimi elle zorluk çekebilir ve değişkenliğe eğilimli olabilir. Bu nedenle, rozet türevi NSC&#39;lerin genleşmesi ve nöronal / glial hücrelere daha da farklılaşması için bir protokol geliştirdik. Bu farklılaşma protokolünün olası sınırlamaları esas olarak (i) d&#39;nin nispeten düşük yüzdesi(Ii) olgun nöronal ağ fonksiyonlarının olmaması (patlama olmaması ile gösterildiği gibi). Dahası, astrositlerin spesifik alt popülasyonları birincil öncü veya NSC olarak işlev görebilir 35 . Bu farklılaşmış hücre kültüründe nestin / GFAP çift pozitif hücreler gözlenmemiştir (veriler gösterilmemiştir), bu karışık kültürlerdeki GFAP + hücrelerinin astrositik progenitler ve astrositler olduğu varsayılmıştır. Farklılaşmanın zamanını uzatarak astrositlerin sayısı artabilir ve bunların morfolojisi daha önce Zhang&#39;ın 36 , 37.&#39;deki önceki çalışmalar tarafından da gösterildiği gibi daha olgunlaşabilir. Yeni toksisite testi paradigmasında, kimyasal adversiteyi değerlendirirken biyolojik yolların kimyasal kaynaklı bozulmalara ilişkin bilgi çok önemlidir. Bu nedenle, in vitro test sistemleri,Olumsuz sonuç yolağı (AOP) kavramına göre, yan etkileri sinyal yollarının bozulmalarıyla ilişkilendirin. Bir kanıt ispatı olarak rotenon, oksidatif veya elektrofilik strese karşı hücresel savunmaya katılan Nrf2 yolağının aktivasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir 38 ve oksidatif stres, çeşitli AOP&#39;lerde önemli ve ortak bir anahtar olaydır. Gelişimsel ve erişkin nörotoksisite 39 . Rotenon, Nrf2 protein nükleer translokasyonu ve NQO1 ve SRXN1 dahil olmak üzere Nrf2 hedef enzimlerin artmış ekspresyonu ile gösterilebilen Nrf2 yolağının aktivasyonunu sağlamalıdır. Rotenonun, astrosit aktivasyonunu gösteren 40 ila 41 arası doz bağımlı GFAP protein seviyeleri artışı indüklediği bulunmuştur. Rotenone ayrıca dopaminerjik (TH + ) hücrelerinin sayısını azaltmakta olup previ ile uyumludurBu tür nöronlar özellikle oksitlenme stresine duyarlı oldukları için, rotenona bağımlı dopaminerjik hücre ölümünü gösteren in vitro ve in vivo çalışmalar Bu , 21 , 22 , 23 . Sonuç olarak, bu hiPSC kaynaklı nöronal ve glial hücre kültürü modeli, Nrf2 yolağının aktivasyonuyla sonuçlanan oksidatif stres yaratan kimyasalların nörotoksik etkilerini değerlendirmek için değerli bir araçtır. Bu farklılaşma protokolü, nöronal hücrelerin karışık kültürlerinin (GABAerjik, dopaminerjik ve glutamaterjik nöronlar) ve astrositlerin üretilmesine izin verdiğinden, nörodejeneratif hastalıklar gibi fizyolojik ve patolojik koşullarda nöronlar ve glia arasındaki karışma incelemesine uygun olabileceğini kanıtlayabilir Örneğin Parkinson hastalığı). Dahası, NSC&#39;lerin önemli bir bölümünün varlığı, kimyasalların sinirsel progresyona olası etkilerini değerlendirmeye yardımcı olabilirKimyasal nedenli mutasyonların veya viral enfeksiyonların ana hedefi olarak bilinen enitorler 42 .

ABD Ulusal Araştırma Konseyi raporu 1, düzenleyici toksisite testinin, hayvanlarda görülen fenotipik değişikliklere dayalı bir yaklaşımdan , insan hücrelerini kullanarak mekanik in vitro deneylere odaklanan bir yaklaşıma kaydırılmasını öngören yeni bir toksisite testi paradigması öngördü. Elde edilen hücreler, insan dokularının fizyolojik koşullarına daha yakından benzeyebilir ve kimyasal kaynaklı olumsuz etkileri incelemek için daha alakalı araçlar sağlayabileceğinden, çok hücreli kök hücre (PSC) türevleri kanser hücresi modellerine alternatif olabilir. Toksisite testi için en umut vericidir PSC kültürlerinin iki ana türü, şu anda temel araştırma ve rejeneratif tıp alanlarında yaygın olarak kullanılan insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC&#39;ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC&#39;ler) oluşur 2 , 3 . Bu uzmanlık artık toksikoloğun yeni bir sınıfının geliştirilmesi için kullanılabilirIn vivo advers etkilerin gelişimi ile ilgili rahatsız edici fizyolojik yolları belirlemeyi amaçlayan in vitro deneyler. Bununla birlikte, hESC&#39;lere dayanan düzenleyici güvenlik değerlendirmeleri için test yöntemleri, muhtemel etik kaygılardan ve embriyo kaynaklı hücrelerin kullanımını düzenleyen çeşitli ulusal yasama politikalarından dolayı tüm AB Üyesi Devletler tarafından ve dünya ülkelerince kabul edilmeyecektir. HiPSCs, hESC 4 , 5&#39;e benzer özellikleri paylaşır ve hem tedavi hedeflerini tanımlamak hem de güvenlik değerlendirmeleri için in vitro yöntemler için büyük potansiyel taşır. Buna ek olarak, hiPSC teknolojisi, sınırlı bir donör havuzun kısıtlamalarını ve embriyo kökenli hücrelerle bağlantılı etik kaygıları hafifletir. HiPSC&#39;ler için büyük bir zorluk, bu hücrelerin, toksikolojik olarak ilgili hücre türevleri,Insan dokularına özgü karakteristikler ve tepkilerle. Seçilen belirteçlerin önceden tanımlanmış seviyeleri genellikle hücre popülasyonlarını farklılaşma sürecinden sonra karakterize etmek için ve farklılaşma sürecinin kararlılığı hakkında bilgi sağlamak için kullanılır. Önceki çalışmalar, hiPSC&#39;lerin nöronal ve glial hücrelerin karışık kültürlerini üretmeye uygunluğunu ve mitotondrial solunum kompleksi I inhibitörü olan rotenonun, antioksidan savunma mekanizmalarının anahtar bir düzenleyicisi olan Nrf2 yolağının aktivasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirdi. Birçok hücre tipi 6 , 7 . Bu çalışma, hiPSC&#39;lerin karışık nöronal ve glial kültürlere ayrılması için kullanılan ve nöronal / glial diferansiyasyon üzerine aktive edilen sinyal yolları (gen ve protein seviyesi) hakkında ayrıntılar sağlayan bir protokolü açıklamaktadır. Buna ek olarak, çalışma, bunun nasılHiPSC türevi nöronal ve glial hücre modeli oksitlenme stres indüksiyonunun değerlendirilmesine izin veren, rotenon ile akut (24 saat) tedaviyle indüklenen Nrf2 sinyal aktivasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. IMR90 fibroblastları, pMIG vektörleri 6 kullanılarak 2 transkripsiyon faktörünün (Oct4 ve Sox2) viral transdüksiyonuyla I-Stem&#39;de (Fransa) hiPSC&#39;lere yeniden programlandı. Benzer hiPSC modelleri de uygulanabilir. Aşağıda açıklanan protokoller, hiPSClerin sinir kök hücrelerine (NSC&#39;ler) ve daha sonra mitotik sonrası nöronların ve glial hücrelerin karışık kültürlerine ayrılmasının tüm aşamalarını özetler (adım 1 ve 2, ayrıca ayrıntılı bir açıklama için EURL ECVAM DBALM web sitesine bakın) Protokol) 8 . NSC&#39;lerin karışık nöronlara ve glial hücrelere ayrılması, genişletilmesi, kriyoprezervasyonu ve daha ileri farklılaşması için ek bir protokol, 3. ve 4. adımlarda detaylandırılmıştır (aynı zamanda EURL ECVAM DBALM&#39;eBu protokolün ayrıntılı bir açıklaması için bsite) 9 . Adım 5, taahhüt ve farklılaşma aşamalarında hücrelerin fenotipik kimliğini değerlendirmek için yapılabilecek analizleri açıklar.

protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into mixed cultures of neurons and glia for neurotoxicity testing

İnsan pluripotent kök hücreleri, insan kaynaklı in vitro toksisite deneylerine uygulanabilen çeşitli hücre tiplerine ayrılabilir. En önemli avantajı, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) üretmek için somatik hücrelerin yeniden programlanmasının, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC&#39;ler) kullanımıyla ilgili etik ve yasama konularından kaçınmasıdır. HiPSC&#39;ler, toksisite testi için ve özellikle de nörotoksite dahil olan farklı yolların değerlendirilmesi için test sistemleri olarak işlev gören, nöronal ve glial hücrelere farklı tiplerde genişletilebilir ve etkili şekilde ayırt edilebilir. Bu çalışma hiPSC&#39;lerin nöronal ve glial hücrelerin karışık kültürlerine ayrılması için bir protokolü açıklamaktadır. Nöronal farklılaştırma ile düzenlenen ve / veya aktive edilen sinyal yolları tanımlanmıştır. Bu bilgi, hücre modelinin yeni toksisite testi paradigmasına uygulanması için kritiktir; burada, kimyasalların,Rturb biyolojik yollar. Konseptin bir kanıtı olarak, mitokondriyal solunum kompleksi I&#39;in bir inhibitörü olan rotenon, oksidatif strese karşı antioksidan-tepki-element- (ARE) tarafından tetiklenen hücresel savunma mekanizmasının anahtar regülatörü Nrf2 sinyal yolağının aktivasyonunu değerlendirmek için kullanılmıştır .

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing at JoVE.com

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), ilaç ve kimyasal tarama için ve nörotoksisiteyi de içeren toksisite testi için yeni in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir araç olarak düşünülür. Burada, hiPSC&#39;lerin nöronlara ve glia&#39;ya diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol anlatılmıştır.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

SCIENTISTS IN ACTION

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...