Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

نود أن نشكر بيير بوردونكلي، وتوماس جيلبرت كوشين التصوير مرفق (معهد كوشين، باريس) لتقديم المشورة والمساعدة مع مجاهر. كان يؤيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من "الرابطة الفرنسية" الوطنية جنيه مكافحة السرطان، كاربيم (أبحاث السرطان للطب الشخصي)، في مؤسسة فرنسا وافق 2020 برنامج الاتحاد الأوروبي في البحوث والابتكار في إطار المنحة اتفاق لا 667980 (قيراط).

الأورام البشرية وتم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الفرنسية والمساعدة العامة-تجمع في باريس (AP-إتش بي) في تطبيق المادة L.1121-1 من القانون الفرنسي. تم الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة من المرضى قبل إدراجها في الدراسة.
1-الحصول على أورام الرئة البشرية
<ol>
	<li>الحصول على عينات من ورم الرئة الطازجة من المرضى المصابين بسرطان الرئة الخلية غير الصغيرة-ثالثا المرحلة الذي خضع بتر جراحية كاملة أورام الرئة4.</li>
	<li>نقل الورم الطازجة غير ثابت في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على الجليد روزويل بارك التذكاري المعهد (RPMI 1640) متوسطة. جانبا على الجليد لمدة 30 دقيقة حتى الخطوة 2.7. ملاحظة: عندما يتم تلقيها الأورام في فترة ما بعد الظهر، وضعها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها وعملية في اليوم التالي. وفي هذه الحالة، الملحق ربمي-1640 وسائل الإعلام مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS).</li>
</ol>
2-[اغروس] التضمين وتقطيع فيبرتوم أورام الرئة البشرية
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات حتى 2.10 تحت ظروف معقمة.
<ol>
	<li>إعداد 5% [اغروس] الحل لتضمينها بتذويب ز 1 ذوبان منخفضة نقطة [اغروس] في 20 مل العقيمة للفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم والمغنيسيوم. الميكروويف هذا الحل حتى يذوب تماما [اغروس]. يسمح [اغروس] لتبريد في 37 درجة مئوية عن طريق وضع الحل في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>في غطاء زراعة الأنسجة، إعداد كاملة المتوسطة RPMI 1640 (دون الفينول الحمراء) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، الجلوتامين 4 مم ل و 1 x البنسلين ووالستربتوميسين.</li>
	<li>إضافة 1.1 مل المتوسط RPMI 1640 كاملة كل بئر لوح ثقافة خلية 6-جيدا ومكان إدراج ثقافة خلية 30 ملم في كل بئر. تعيين اللوحة جانبا في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة حتى الخطوة 2.12.</li>
	<li>تعقيم مكان غسالات شقة الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الداخلي 5 ملم، وخارج قطر 10 مم وسمك 1 مم) في طبق بلاستيك 35 ملم مليئة ربمي المتوسطة كاملة. سيتم استخدام غسالات زيادة تركيز الأجسام المضادة على شريحة قطع فيبرتوم.</li>
	<li>ضع خزعة الورم في طبق بلاستيك 10 سم ومقطعة مكعبات صغيرة الشكل شظايا من حوالي 5 × 5 مم طول الورم بشفرة حادة.</li>
	<li>إخراج [اغروس] من الحاضنة وصب الحل في طبق بلاستيك 35 ملم.</li>
	<li>استخدام زوج من الملقط لنقل أجزاء الورم بعناية لمسح أنسجة لإزالة الفائض في المتوسط. إدراج الأجزاء [اغروس] ووضعها في الجزء السفلي من الطبق البلاستيك. ترك [اغروس] هلام على الجليد لمدة 5 دقائق يصلب.</li>
	<li>متى يتصلب [اغروس]، عكس الطبق البلاستيك واستخدام ملعقة للإفراج عن جيل كامل.</li>
	<li>استخدام شفرة حادة لتقليم [اغروس] الزائدة المحيطة يفتت الورم، ترك 3-5 مم لجل حول الأنسجة.</li>
	<li>جبل كل كتلة [اغروس] على القرص العينة فيبرتوم مع قطره غراء الأنسجة cyanoacrylate بوتيل غير سامة. ملء علبة المخزن المؤقت فيبرتوم مع برنامج تلفزيوني المثلج العقيمة وتثبيت القرص العينة في العلبة.</li>
	<li>قص [اغروس] مضمن الأنسجة إلى 350 ميكرون شرائح سميكة. قم بضبط إعدادات فيبرتوم بسرعة بطيئة نطاق (0.2-0.3 mm/s)، وتواتر الاهتزاز في مجموعة متوسطة الحجم (1.5 مم).</li>
	<li>استخدام الملقط غرامة، بعناية جمع شرائح الأورام حيث يتم قطع ووضعها شقة على إدراج الثقافة الخلية من لوحة 6-جيدا (الخطوة 2، 3). نقل شريحة واحدة في كل إدراج. استخدام الحذر الشديد عند التعامل مع الشرائح كما أنها يمكن أن تتلف بسهولة.</li>
	<li>استخدام الملقط غرامة لوضع غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ على كل شريحة الفردية. تأكد من وضع غسالات جيدا على [اغروس] في ورم الأنسجة المحيطة.</li>
	<li>الحفاظ على لوحة الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد2 CO 5% 10 دقيقة المضي قدما إلى إيمونوستينينج.</li>
</ol>
3-إيمونوستينينج المقيم تي CD8 الخلايا والخلايا السرطانية
<ol>
	<li>تضعف من الأجسام المضادة (تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل) والصبغة النووية (التركيز النهائي 1 ميكروغرام/مل) في وسائل الإعلام ربمي-1640 دون الأحمر الفينول. ملاحظة: استخدم فلوريسسينتلي، إلى جانب مكافحة-CD8 (مفتش مورين، استنساخ SK1) ومكافحة-ابكام (جزيء التصاق الخلايا الظهارية) (مورين مفتش هيئة التعليم العالي-125) الأجسام المضادة لتسمية الخلايا اللمفية تي CD8 وورم الخلايا الظهارية، على التوالي. استخدام جسم فلوريسسينتلي، إلى جانب مكافحة--CD90/Thy1 (مفتش مورين، استنساخ 5E10) إلى تسمية الخلايا الليفية، وخلايا بطانية المنشط. استخدام 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) لتسمية نواة الخلايا التي تحتوي على غشاء البلازما خطر بغية تقييم صلاحية الأنسجة.</li>
	<li>إزالة لوحات الثقافة من الحاضنة واستخدم ماصة لنضح أي سائل داخل غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ. لا تقم بإزالة الوسائط 1.1 مل ربمي-1640 تحت إدراج ثقافة الخلية (الخطوة 2، 3).</li>
	<li>دون لمس الشريحة واستخدام تلميح ماصة، إضافة 40 ميليلتر من الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة على كل شريحة الورم.</li>
	<li>احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لتلطيخ جسم.</li>
	<li>مع الملقط غرامة، إزالة الغسالات، إخراج الشرائح، وق dip 10 منهم في وسائل الإعلام ربمي-1640 دون الأحمر الفينول. وضع الشرائح على إدراج الثقافة الخلية مرة أخرى وإضافة قطره 1640 RPMI خالية من الفينول الحمراء المتوسطة على كل شريحة الفردية. الحفاظ على اللوحة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 المضي قدما للتصوير.</li>
</ol>
4-التصوير وتحليل الهجرة الخلية CD8 تي المقيمين داخل شرائح ورم الرئة البشرية
ملاحظة: [كنفوكل] المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول تستقيم الغزل القرص مجهزة 25 × الهدف غمر المياه (25 ×/0.95 N.A.).
<ol>
	<li>إعداد إعداد المجهر<ol>
		<li>ضبط درجة حرارة مجهر الحرارة-الدائرة عند 37 درجة مئوية قبل بدء الدورة التصوير ساعات قليلة.</li>
		<li>إعداد نظام استمرار نتخلل شرائح الورم مع اﻷوكسيجين (5% CO2، 95% O2) ربمي خالية من الفينول الحمراء المتوسطة (الشكل 1). استخدام مضخة تمعجية لتدفق الوسائط التروية في قاعة التصوير ونضح حل قارورة جمع نفايات.</li>
		<li>تشغيل مضخة تمعجية للسماح بحل اﻷوكسيجين للذهاب من خلال أنابيب التروية.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>مع الملقط غرامة، أخرج الشريحة من لوحة 6-جيدا ونقل إلى الطبق البلاستيك 35 ملم مليئة خالية من الفينول الحمراء المتوسطة ربمي. شل الشريحة بنقطة ربط شريحة قطر مم 19.7 بخيوط متباعدة على 2 مم. ضع طبق بيتري في مرحلة التصوير المجهر. قم بتوصيل نصائح مدخل ومخرج للنظام التروية. قم بتشغيل نظام التروية وضبط معدل تدفق الوسائط إلى 0.8 مل/دقيقة.</li>
	<li>انخفاض الهدف غمر المياه للشريحة. التركيز على رأس الشريحة بميدان مشرق الضوء.</li></ol>باستخدام ضوء نيون المناسبة، حدد منطقة الاهتمام الذي يحتوي على خلايا تي CD8 وورم الجزيرات (إيجابية بالنسبة ابكام) ومنطقة ستروما (إيجابية بالنسبة CD90). التحقق من صلاحية الخلايا داخل الشريحة بتقييم DAPI المصبوغة على سطح قطع وأعمق في الأنسجة. ملاحظة: يتضمن شريحة صحية أقلية فقط من الخلايا DAPI إيجابية في عدة ميكرون من سطح قطع.
	<li>تعيين جلسة تصوير باستخدام الإجراءات التالية.<ol>
		<li>اعتماداً على كثافة إشارة الفلورية 3 fluorophores، تعيين وقت التعرض بين 50 إلى 800 مللي ثانية وكثافة الليزر بين 20 إلى 40 في المائة.</li>
		<li>حدد سمك المكدس z للصورة داخل الشريحة الورم. ملاحظة: هنا، 10-12 طائرات الضوئية التي تمتد على عمق 60-70 ميكرومتر في البعد z مجموع أسر.</li>
		<li>حدد موضع البدء في حوالي 10 ميكرون أدناه خلايا CD8 تي المسمى الأول.</li>
		<li>تحديد الفاصل الزمني بين كل صورة z-المكدس بين 10 إلى 30 ثانية ووقت التسجيل الإجمالي بين 10 إلى 30 دقيقة.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحليل الهجرة الخلية CD8 تي المقيمين كما هو موضح في مرجع4.<ol>
		<li>بعد استيراد البيانات إلى برنامج تعقب، إنشاء المواقع لكل خلية CD8 T في الميدان. ضبط قطر الخلايا وعتبة الكشف وفقا على الخلايا الفلورسنت المصورة.</li>
		<li>فحص المسارات وإزالة أي مسار غير ذي صلة بحذفها. المسارات الصحيحة قبل الاتصال وقطع مسارات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة من المسارات نفسها. تصدير البيانات (سرعة المسار، والمسار بطول التشرد) إلى برنامج جدول بيانات.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

وأعلن لا تضارب في المصالح.

ويرد وصف تقنية بسيطة وسريعة وقوية لتوليد شرائح ورم الرئة البشرية وتقييم السلوك الديناميكي للخلايا التائية CD8 المقيم في بيئة ورم يتم الحفاظ عليها باستخدام مجهر [كنفوكل]. هذا البروتوكول هو صقل المادة جوف السابقة التي تصف رصد خلايا تي مطلي على العقدة الليمفاوية مورين شرائح2.
يجب اعتبار تبييض الأصباغ الفلورية خصوصا مع الأصباغ الجيل الأول مثل fluorescein isothiocyanate وفيكوريثرين. ووجدنا أن فوتوبليتشينج وضوحاً للأجسام المضادة إلى جانب مباشرة حدث مع مجهر اثنين-فوتون. وفي المقابل، لوحظ فوتوبليتشينج الحد الأدنى مع مجاهر [كنفوكل]، خاصة باستخدام الأصباغ الفلورية المشرقة وضعت مؤخرا.
الأجسام المضادة جزيئات كبيرة نسبيا وذلك اختراق الأنسجة يمكن أن يكون صعباً. ويمكن تحسين هذه الخطوة بزيادة فترة الحضانة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام أصغر تلطيخ شظايا الكواشف مثل مباشرة إلى جانب القوات المسلحة البوروندية من الأجسام المضادة يمثل بديلاً جيدا.
تم التحقق من صحة جميع الأجسام المضادة المبينة في هذا البروتوكول ومعروفة لإنتاج المصبوغة مشرق4سابقا. ولذلك، ايستب عناصر التحكم غير مطلوبة. ومع ذلك، إذا كان المرغوب فيها تعديلات لهذا الأسلوب باستخدام أجسام مضادة أخرى، ثم استخدام ايستب مراقبة الأجسام المضادة ينصح بشدة.
ويعرض هذا النظام التجريبي بعض القيود. الإجراء القطع سيضر الأنسجة، والتي قد تؤثر على سلوك الخلايا التائية CD8، خصوصا بالقرب من سطح قطع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فقدان عدد من العوامل القابلة للذوبان (مثل المستقطبات) دور فعال في السيطرة على هجرة الخلايا T. أحد السبل لتجاوز هذه المشاكل عن طريق رصد خلايا T الموجودة في عدة عشرات من ميكرون من على سطح الأرض في مناطق يفترض أنها أكثر صحة من الأنسجة. وتكشف التجارب المنشورة أن ترحيل الخلايا تي مترجمة عميقة داخل الأنسجة بنشاط أكبر من خلايا تي مترجمة قرب سطح قطع4. أننا استخدمنا مجاهر [كنفوكل] لدراساتنا، لكن من المرجح أن المجاهر اثنين-فوتون ستزيد القرار المكانية في العمق.
هذا النهج يعتمد على استخدام الأجسام المضادة إلى جانب فلوريسسينتلي التي لا تكون جزيئات محايدة. الأجسام المضادة لكامل الحجم عرضه لتؤثر على السير العادي للخلايا T بطرق مختلفة. أولاً، يمكن أن تغير الأجسام المضادة-CD8 الهجرة الخلية T بالتسبب تتالي إشارات داخل الخلايا قادرة على التأثير على سيتوسكيليتون اللمفاويات. وثانيا، يمكن أن تعدل الأجسام المضادة-CD8 التفاعل بين CD8 و MHC الفئة الأولى الجزيئات، خطوة هامة في عملية التعرف على المستضد. يمكن ربط مستقبلات Fc التي أعرب عنها العديد من الخلايا النقوي الموزعة في الورم وعرضه لذلك أجسام سليمة، والثالثة زيادة الإشارات غير محددة. لدينا أي دليل على أن هذه مشكلة تؤثر البيانات المتوفرة لدينا، ربما لأن مستقبلات Fc الخلايا النقوي المقيم، خلافا للخلايا في الثقافة، مشبعة المناعية داخل الوسط الورم. وفي الواقع، لم تتغير إضافة المصل أثناء عملية وضع العلامات، عملية تعرف بكتلة حرة Fc المستقبلات، المناعية تلطيخ. على الرغم من ذلك، القوات المسلحة البوروندية أجزاء من الأجسام المضادة، تخلو من منطقة Fc، فضلا عن الأجسام المضادة المتحولة في منطقتها Fc و أجزاء جسم المستمدة من الكامليد8 تمثل استراتيجيات أخرى بديلة لتعقب الخلايا المقيمين مع تتبع الفلورسنت.
على مدى العقود الماضية، وتم وضع عدة نظم نموذجية وتستخدم للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا اللمفية تي. وتشمل هذه الاستعدادات في المختبر تي الخلايا سابقا المنقي ومثقف مع عرض مستضد الخلايا. وسمحت هذه الأعمال التحضيرية تقدما ملحوظا في تحديد آليات الاعتراف مستضد، والقدرة على الاستجابة. بيد أنها تفتقر إلى الطابع المعقد للبيئة الأنسجة. وتم إنشاء الأعمال التحضيرية الأخرى أكثر عن كثب تقليد هيكل الأنسجة الأصلية. للحصول على أمثلة، مصفوفات جل الكولاجين ثلاثي الأبعاد في الخلايا تي النقية التي قد تم تضمينها، فضلا عن ثقافة ريجريجاتيد الأنسجة الشظايا قد استخدمت لرصد السلوك الديناميكي للخلايا اللمفية تي مع الفلورسنت التصوير التكنولوجيات9 . تقدم هذه الأنظمة في الاستفادة من بنية قريبة من الأنسجة الأصلية، لكنها تفتقر إلى عوامل هامة أخرى الخلوية وقابل للذوبان. في الماوس، استخدمت اثنين-فوتون إينترافيتال الفحص المجهري لتعقب الخلايا T في بيئة حقاً الفسيولوجية الجهاز سليمة10. بيد أن مثل هذا النهج صعبة تقنيا لإعداد. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس تظهر اختلافات ملحوظة مع علم وظائف الأعضاء البشرية.
ويمثل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول في بيئة معقدة متعددة الخلايا ورم فريد يسمح لها العمل كحلقة وصل هامة بين دراسات الثقافة المشتركة ونماذج حيوانية.
يمكن أيضا استخدام البروتوكول الموضحة هنا لتتبع الحركية الخلايا الأخرى من الخلايا اللمفية تي CD8 التي تم إنشاؤها بالأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها للبشرية ومورين الأورام والأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، تمكنا من أن الصورة في الوقت الحقيقي المسمى ديناميات الخلايا ب مع جسم المضادة-CD19 في اللوزتين البشرية الطازجة.
الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح للشاشة لجزيئات علاجية مراقبة حركية الخلية تي في الأنسجة. إمكانية الوصول إلى نظام الثقافة يسمح لتطبيق بعض الكواشف الدوائي واختبار آثارها على الهجرة الخلية T. من المقبول الآن أن الخلايا التائية CD8 في نمو الأورام، يحمل هجرة منخفضة وخفضت صلات مع خلايا الورم11. الأهم من ذلك، وجود خلايا تي في ورم خلايا المناطق الشحيحة يرتبط بالتوصل إلى نتائج سيئة ويعتبر إحدى آليات المقاومة للسرطان يستند إلى الخلية تي العلاج المناعي. وقد حددت عدة عقبات تحد من خلايا تي من الهجرة في الأورام بما في ذلك مصفوفة خارج الخلية كثيفة. وفي هذا الصدد، تحديد جزيئات قادرة على استعادة خلية T حركية والتفاعل مع الخلايا الخبيثة يمثل خطوة هامة في العلاج المناعي السرطان. وفي دراسة سابقة، وجدنا أن يحسن إلى تحلل جزئي للكولاجين كولاجيناز، شدة تطبيقها على الشرائح الرئة البشرية، مع جهة الاتصال للخلايا T مع الخلايا السرطانية.
أخيرا، يوفر إمكانية للحفاظ على شرائح الورم البشري في الثقافة لما يصل إلى عدة أيام7،،من1213 عددا من التطبيقات الواعدة في المدة من خلايا تي والعلاج المناعي.بيد أن استقرار النظام النموذجي خلال الثقافة طويل الأجل هو معلمة هامة التي تحتاج إلى تقييم دقيق.
الحصول على أنسجة جديدة وسليمة عامل حاسم لإنتاج شرائح نوعية مع إيمونوستينينج جيدة CD8 الخلايا والخلايا السرطانية، وعناصر اللحمية. حفظ خزعة الورم عند 4 درجة مئوية قبل معالجة أمر حاسم.
التعامل مع الشرائح مع غرامة الملقط يمثل خطوة حاسمة أخرى ضمن هذا البروتوكول. وهذا ينبغي أن يجري بعناية كبيرة كما [اغروس] يمكن أن تتلف بسهولة. سوف ينال قطع في [اغروس] ختم المقدمة من الفولاذ المقاوم للصدأ الغسالة أسفر عن تسرب للأجسام المضادة التي تحتوي على حلول.

الخلايا التائية CD8 دوراً رئيسيا في المعركة ضد السرطان. ومع ذلك، منع العديد من الآليات القمعية لمفاوية T من قتل الخلايا الخبيثة. خلال السنوات الماضية، تم وضع العديد من الاستراتيجيات الواعدة التي حرر الفرامل في خلايا تي والمستخدمة في العيادة5. النهجين التي تحتفظ بقدر كبير من الاهتمام استهداف نقطة تفتيش محصنة ضد الأجسام المضادة، مثل العلاجات خلية T المضادة-PD-1 والتبني. ومع ذلك، وعلى الرغم من النجاحات التي تحققت مؤخرا، مجموعة فرعية فقط من المرضى الاستفادة من هذه العلاجات6. تحديا رئيسيا لتحديد آليات لمقاومة السرطان العلاج المناعي من أجل تطوير علاجات أكثر فعالية. تحد آخر هو تطوير نظم نموذجية في الرواية التي يمكن أن تتميز العلاجات واختبارها على فاعلية وسلامة. وحتى الآن، تستند معظم هذه الاختبارات في المختبر خلية ثقافة النظم التي تحاكي الطابع المعقد للأنسجة السرطانية سيئة.
السابقين فيفو شرائح الأنسجة تقنية واعدة، كما أنه يحافظ على النسيج الأصلي المكروية7. على مر السنوات، أنشأنا هذا النهج لتتبع ديناميات الخلايا اللمفية تي في الأنسجة المختلفة. نتائجنا تشير إلى أن المسمى فلوريسسينتلي خلايا تي أضيف فوق شرائح العقدة الليمفاوية مورين تهاجر إلى الأنسجة، والاستجابة لتلك المناسبة العظة ميكرونفيرونمينتال1،2. وبالمثل، يجند لمفاوية T مضافين إلى شرائح ورم الرئة البشرية سريعاً في ستروما ورم3. باستخدام هذا الأسلوب، حددنا المصفوفة خارج الخلية كعنصر هام في السيطرة على توزيع والهجرة للخلايا T داخل الأورام البشرية3،4. نظراً للسلوك السابقين فيفو تنقيته ومطلي خلايا تي لا تعكس بالضرورة سلوك المقيمين intratumoral تي الخلايا الليمفاوية، ونحن قد مؤخرا صقل هذا النهج4.
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتعقب الخلايا اللمفية تي المقيمين داخل شرائح من أورام الرئة البشرية الطازجة. الخطوات المختلفة التي تتألف من إعداد الشرائح ورم الرئة البشرية (بما في ذلك [اغروس] التضمين وتمزيقها فيبرتوم الأنسجة المضمنة)، تلطيخ الخلايا الذاتية مع الأجسام المضادة الفلورسنت في الشرائح الطازجة الورم، ورصد هذه الخلايا مع مجهر [كنفوكل].

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

خلية CD8 T هي الجهات الفاعلة الرئيسية في مجال مكافحة السرطان. أنهم بحاجة إلى الدخول في الورم كي الخلايا التائية CD8 لقتل الخلايا السرطانية، تهاجر داخل ورم المكروية والاستجابة على نحو كاف لمولدات الورم. التطورات الأخيرة لتحسين النهج التصوير، مثل الفحص المجهري 2-فوتون، واستخدام نماذج الورم الماوس قوية تلقي ضوءا على بعض الآليات التي تنظم أنشطة الخلية تي المضادة للورم. بينما نظم من هذا القبيل قد قدمت أفكاراً قيمة، أنهم لا دائماً التنبؤ بالاستجابات البشرية. في الإنسان، معارفنا في هذا المجال يأتي أساسا من وصف لعينات الورم ثابت من البشر المرضى، فضلا عن الدراسات في المختبر . ومع ذلك، نماذج في المختبر تفتقر إلى الوسط ورم ثلاثية الأبعاد المعقدة وبالتالي، هي تقريبية غير مكتملة في فيفو أنشطة الخلية T. شرائح جديدة مصنوعة من أنسجة اكسبلانتيد تمثل بيئة معقدة ورم متعددة الخلايا التي يمكن أن تعمل كحلقة وصل هامة بين دراسات شارك مثقف ونماذج حيوانية. الآن قد أنشئت أصلاً في العقد الليمفاوية مورين1 والموصوفة سابقا في جوف المادة2، تم نقلها هذا النهج إلى الأورام البشرية لدراسة ديناميات مطلي3 فضلا عن الخلايا T المقيمين4.
ويرد هنا، على بروتوكول لإعداد شرائح ورم الرئة البشرية، إيمونوستينينج من المقيمين تي CD8 وورم الخلايا، وتتبع الخلايا اللمفية تي CD8 داخل ورم المكروية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. وهذا النظام فريد الموضوعة على الشاشة لوكلاء المناعي رواية تحابي الهجرة الخلية تي في الأورام.

عادة ما تكون الغاية هي تسللت إلى أورام الرئة البشرية في الخلايا التائية CD8 التي تم العثور على نحو تفضيلي في3،سدى4. باتباع هذا البروتوكول ينبغي للمرء أن يتوقع لتصور عدد كبير من إيمونوستينيد تي CD8 شرائح ورم الرئة البشرية. ينبغي أن تسمح العلامات يشترك مع الأجسام المضادة-ابكام ومكافحة CD90 لترسيم المناطق stromal وورم الجزيرات. يمكن تصور فيبريلار الكولاجين، وفرة في ستروما الورم، دون تلطيخ خارجية باستخدام الجيل الثاني متناسق على مجهر اثنين-فوتون3،4. علما أن بعض أورام الرئة البشرية الحالية لا يوجد تمييز واضح بين ورم الجزيرات وسدى. يجب أن يتم تجاهل هذه الأورام فضلا عن نموذج عرض مساحات كبيرة من نخر الخلية التي حددتها غير محددة ملزمة للأجسام المضادة وتلطيخ DAPI. تمشيا مع نشر النتائج التي تم الحصول عليها في الرئة البشرية وسرطانات المبيض، الخلايا التائية CD8 المقيم أكثر تتركز في ستروما مقارنة بورم الجزيرات4. ويرد مثال ممثل لتوزيع CD8 T الخلية بالنسبة لورم الخلايا و CD90 في الشكل 2.
يسمح فحص شريحة لتحليل حركية خلية T المقيمين في مناطق مختلفة من الورم. وتشمل معايير مفيدة لمقارنة حركية الخلية CD8 تي في مختلف المناطق على متوسط السرعة (طول المسار مقسوماً على وقت عينات) وطول التشرد (الناقل بين بداية ونهاية المسار). رغم أن نادرة في الجزيرات الورم، ترحيل الخلايا التائية CD8 بنشاط أكبر في حجرة هذه المقارنة إلى ستروما (الشكل 3). في المتوسط، ينبغي أن يكون متوسط سرعة الخلايا التائية CD8 الفردية ما يقرب من 4 ميكرون/دقيقة في ستروما الورم مع البينية عالية والتقلبات الورم بين4. في ستروما الورم، يتأثر بقوة الحركية خلايا تي المقيم بكثافة والتوجه للمصفوفة خارج الخلية ألياف3،4. سيؤدي إلى تجربة ناجحة في أقل من خلايا تي موجودة في المناطق الكثيفة مصفوفة مقارنة بمناطق مصفوفة فضفاضة، يتسق مع النتائج المنشورة3،4.
لاحظ أن بعض أورام الرئة البشرية يحمل درجة عالية جداً من أوتوفلوريسسينسي النافية لتصوير خلايا تي المقيم. ويلاحظ هذه الميزة سريعاً في بداية الدورة بالتصوير. يجب أن يتم تجاهل الأورام أوتوفلوريسسينت. ويرد مثال ممثل المقيم الخلايا التائية CD8 في ورم أوتوفلوريسسينت في الشكل 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
رقم 1: صور فوتوغرافية لنظام التروية. A هو إثراء الحل ربمي خالية من الفينول الحمراء) في 5% C02، س 95%2. ب) ثم هو perfused الحل بمضخة تمعجية. ج) الحل ربمي يدخل الطبق الثقافة عبر المدخل. عند المخرج، ويستنشق الحل بالمضخة من الدائرة في حاوية نفايات. لاحظ أن يتم تعيين تلميح تطلع على مستوى لتحديد الارتفاع الحل. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
رقم 2: توزيع المقيمين CD8 تي الخلايا في ورم الرئة بشرية. صورة تمثيلية لشريحة ورم الرئة البشرية الملون ل CD8 (الأخضر)، ابكام (أزرق) و CD90 (أحمر). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
الشكل 3: خلايا حركية من المقيمين CD8 تي في ورم الرئة بشرية. المسارات الفردية الخلايا التائية CD8 المقيمين في منطقتي ورم الخلية (الأزرق) شريحة سرطان الرئة البشرية و stromal (أحمر). الشريحة ملطخة بالأجسام المضادة المشار إليها وتصويرها لمدة 20 دقيقة مع مجهر [كنفوكل]. تم الكشف عن الكولاجين فيبريلاري في النهاية باستخدام جيل التوافقي الثاني (SHG) في مجهر اثنين-فوتون. المسارات هي مرمزة وفقا لطول التشرد خلية CD8 T. وقد تم تعديل هذه الصورة من 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
رقم 4: صورة الممثل ورم الرئة البشرية أوتوفلوريسسينت. وكان الملون شريحة الورم CD8 (الأخضر) وابكام (أزرق). إشارة SHG باللون الأحمر. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

ويصف هذا البروتوكول أسلوب للصورة المقيم التسلل إلى الورم CD8 تي الخلايا المسماة بالأجسام المضادة فلوريسسينتلي يزوج داخل شرائح ورم الرئة البشرية. هذا الأسلوب يسمح تحليل في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية CD8 تي استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].

السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

الجينات مراسل fluorescence النويدات المشعة التصوير لتتبع تطور الورم في نماذج القوارض الورم

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

الكشف عن الوقت الحقيقي في المختبر ورم الخلايا المبرمج الناجمة عن CD8+ تي الخلايا لدراسة وظائف المناعة القمعية من التسلل إلى ورم الخلايا النقوي

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

الكشف عن تطور ورم الرئة في الفئران عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

قياس الاستجابة للمخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم Organotypic

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...