Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Vi ønsker at takke Pierre Bourdoncle og Thomas Guilbert Cochin Imaging facilitetens (Institut Cochin, Paris) for rådgivning og bistand med mikroskoper. Dette arbejde blev støttet i en del af tilskud fra franske Ligue Nationale contre le Cancer, af CARPEM (Cancer Research for personlig medicin), af Fondation de France og af EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under tilskud aftale nej 667980 (CARAT).

Menneskelige tumorer blev indhentet med samtykke fra den franske etiske komité og af Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) i henhold til artikel L.1121-1 i den franske lov. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter før inklusion i studiet.
1. at opnå menneskelige lunge tumorer
<ol>
	<li>Få friske lunge tumor prøver fra patienter med stadium I-III ikke-småcellet lungekræft, der undergik en komplet kirurgisk resektion af deres lunge tumorer4.</li>
	<li>Transport af ikke-fast frisk tumor i 15 mL konisk rør indeholdende iskold Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medium. Der er afsat på is i 30 min. indtil trin 2.7. Bemærk: Når tumorer er modtaget i eftermiddag, placere dem på 4 ° C natten over og proces den følgende dag. I dette tilfælde supplere RPMI-1640 medier med 5% føtal bovint serum (FBS).</li>
</ol>
2. Agarosen indlejring og vibratome udskæring af menneskelige lunge tumorer
Bemærk: Udfør alle trin indtil 2.10 under sterile forhold.
<ol>
	<li>Forberede 5% Agarosen løsning for indlejring ved at opløse 1 g lav-smeltende punkt Agarosen i 20 mL sterilt af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden calcium og magnesium. Mikroovn denne løsning, indtil Agarosen er fuldstændigt opløst. Tillad Agarosen afkøles ved 37 ° C ved at placere løsningen i en rugemaskine ved 37 ° C i 5 min.</li>
	<li>I en vævskultur hætte, forberede komplet RPMI-1640 medium (uden phenol rød) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS), 4 mM L glutamin og 1 x penicillin og streptomycin.</li>
	<li>Tilføje 1,1 mL komplet RPMI-1640 medium pr. brønd til en 6-godt celle kultur plade og placere en 30 mm celle kultur indsætte i hver brønd. Sæt pladen til side i en inkubator ved 37 ° C i 30 min indtil trin 2.12.</li>
	<li>Sted steriliseret rustfri flade skiver (indre diameter 5 mm, diameter 10 mm og tykkelse på 1 mm) i en 35-mm plastik fad fyldt med RPMI komplet medium. Skiver bruges yderligere at koncentrere antistofferne på vibratome-cut skive.</li>
	<li>Placer tumor biopsi i en 10-cm plastik fad og skær tumor med en skarp kniv i lille cube figur fragmenter af ca 5 x 5 mm længde.</li>
	<li>Tag Agarosen fra rugemaskinen og hæld opløsningen i et 35-mm plastik fad.</li>
	<li>Bruge et par pincet omhyggeligt overføre tumor fragmenter til en væv tørre at fjerne overskydende af medium. Indsætter Agarosen fragmenter og placere dem i bunden af plast fadet. Forlade agarosegel i isbad i 5 min at størkne.</li>
	<li>Når Agarosen størkner, invertere den plastik skål og brug en spatel til at frigive den hele gel.</li>
	<li>Brug en skarp kniv til at trimme det overskydende Agarosen omkring tumor fragment, forlader 3-5 mm gel omkring væv.</li>
	<li>Montere enkelte Agarosen blok på modellen disk af vibratome med en dråbe af giftfri butyl ren væv lim. Fyld pufferkarret vibratome med sterile iskold PBS og installere modellen disk i bakken.</li>
	<li>Cut Agarosen indlejret væv i 350 µm tykke skiver. Justere indstillingerne vibratome ved en langsom vifte hastighed (0,2-0,3 mm/s) og vibrationer frekvensen i en mellemlang rækkevidde (1,5 mm).</li>
	<li>Bruger fine pincet, omhyggeligt indsamle tumorer skiver, da de er skæres og placere dem fladt på celle kultur skær af en 6-godt plade (trin 2.3). Overføre 1 skive på hver Indsæt. Brug stor omhu, når du håndterer skiver, som de let kan beskadiges.</li>
	<li>Brug fine pincet til at placere rustfrit stål skiver på hver enkelt skive. Sørg for skiver er godt placeret på Agarosen omkring tumor væv.</li>
	<li>Opretholde kultur pladen ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet inkubator for 10 min. Fortsæt at immunfarvning.</li>
</ol>
3. immunfarvning af hjemmehørende CD8 T celler og tumorceller
<ol>
	<li>Fortyndes antistoffer (slutkoncentration 10 µg/mL) og den nukleare farvestof (slutkoncentration 1 µg/mL) i RPMI-1640 medier uden phenol rød. Bemærk: Brug fluorescently kombineret anti-CD8 (murine IgG, klon SK1) og anti-EpCAM (epitelcelle vedhæftning molekyle) (murine IgG HEA-125) antistoffer til at mærke CD8 T-lymfocytter og tumor epitelceller, henholdsvis. Brug fluorescently kombineret anti-CD90/Thy1 (murine IgG, klon 5E10) antistof til etiketten fibroblaster og aktiveret endotelceller. Brug 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for at mærke kernen i celler med en kompromitteret plasma membran for at vurdere væv levedygtighed.</li>
	<li>Fjern kultur plader fra rugemaskinen og bruge en pipette til Aspirér væske inde i rustfrit stål-skiver. Fjern ikke 1,1 mL RPMI-1640 medierne placeret under celle kultur skær (trin 2.3).</li>
	<li>Uden at røre skive og ved hjælp af en pipette tip, tilføje 40 µL af den løsning, der indeholder antistoffer på hver tumor skive.</li>
	<li>Inkuber plade ved 37 ° C i 15 min at tillade antistoffarvning.</li>
	<li>Med fine pincet, fjerne skiver, tage ud skiver og dip dem 10 s i RPMI-1640 medier uden phenol rød. Sted tilbage skiver på celle kultur skær og tilføje en dråbe af phenol rød-gratis RPMI-1640 medium på hver enkelt skive. Vedligeholde plade ved 37 ° C i 10 min. Fortsæt til billedbehandling.</li>
</ol>
4. imaging og analysere bosiddende CD8 T celle migration inden for human lunge tumor skiver
Bemærk: Konfokal mikroskop bruges i denne protokol er en opretstående spinning disk udstyret med et 25 x vand fordybelse mål (25 x / 0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Forberede mikroskop setup<ol>
		<li>Indstil temperaturen af mikroskopet varmen-kammer ved 37 ° C et par timer før du starter imaging-session.</li>
		<li>Oprettet et system til konstant perfuse tumor skiver med iltet (5% CO2, 95% O2) fenol rød-fri RPMI medium (figur 1). Bruge en peristaltisk pumpe til at flyde perfusion medier ind i imaging kammeret og Opsug løsningen til en affaldsindsamling kolbe.</li>
		<li>Kør den peristaltiske pumpe til at tillade den iltede løsning at gå gennem perfusion rør.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Med fine pincet, tage udsnit fra 6-godt plade og overføre det til 35-mm plastik fad fyldt med phenol rød-fri RPMI medium. Immobilisere skive med en 19,7 mm diameter skive anker med 2 mm afstand-tråde. Placer petriskålen på imaging scenen i mikroskopet. Tilslut indsugnings- og udstødningsporte tips af perfusion system. Tænd perfusion system og Indstil media strømningshastighed til 0,8 mL/min.</li>
	<li>Lavere vand-fordybelse mål til skive. Fokusere på toppen af udsnittet med lysfelt lys.</li></ol>Ved hjælp af passende fluorescerende lys, Vælg en region af interesse, der indeholder CD8 T celler, tumor Holme (positiv for EpCAM) og et stroma område (positiv for CD90). Kontrollere levedygtigheden af celler inden for udsnittet ved at vurdere DAPI farvning på snitfladen og dybere ind i vævet. Bemærk: En sund skive indeholder kun et mindretal af DAPI positive celler på flere mikron fra snitfladen.
	<li>Angive en billeddannelse session med følgende handlinger.<ol>
		<li>Afhængigt af intensiteten af fluorescerende signalet på de 3 fluorophores, indstillet eksponeringstid mellem 50 til 800 ms og laser intensitet mellem 20 og 40%.</li>
		<li>Vælge z stak tykkelse til billedet i tumor skive. Bemærk: Her, 10-12 optisk fly der spænder over en total dybde på 60-70 µm i dimensionen z blev erobret.</li>
		<li>Vælg startposition på ca. 10 µm under de første mærket CD8 T celler.</li>
		<li>Definer intervallet mellem hver z-stakken billede mellem 10-30 s og den samlede registreringstid mellem 10-30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysere bosiddende CD8 T celle migration, som beskrevet i reference4.<ol>
		<li>Når du har importeret data til en tracking software, skal du oprette steder for hver CD8 T-celle i feltet. Justere diameteren af cellerne og tærsklen for registrering ifølge på de afbildede fluorescerende celler.</li>
		<li>Inspicere sporene og fjerne enhver irrelevant spor ved at slette dem. Korrekte numre ved at tilslutte og frakoble forskellige spor og forskellige tidspunkter i de samme spor. Eksportere data (spor hastighed, track forskydning længde) til et regneark software.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

En enkel, hurtig og robust teknik for at skabe menneskelige lunge tumor skiver og vurdering af den dynamiske opførsel af hjemmehørende CD8 T celler i en bevarede tumor miljø ved hjælp af en Konfokal mikroskop er beskrevet. Denne protokol er en videreudvikling af en tidligere JoVE artikel, der beskriver overvågning af forgyldt T celler murine lymfeknude skiver2.
Blegning af fluorescerende farvestoffer må betragtes især med første generation farvestoffer som fluorescein isothiocyanat og phycoerythrin. Vi konstateret, at der en udtalt photobleaching af direkte koblet antistoffer med en to-foton mikroskop. Omvendt, minimal photobleaching blev bemærket med Konfokal mikroskoper, især ved hjælp af lyse fluorescerende farvestoffer udviklet for nylig.
Antistoffer er forholdsvis store molekyler og deres indtrængen i vævet kan derfor være vanskeligt. Dette trin kan forbedres ved at øge inkubationstiden. Derudover farvning at anvende en mindre reagenser som direkte koblet Fab fragmenter af antistoffer repræsenterer et godt alternativ.
Alle antistoffer er beskrevet i denne protokol har tidligere valideret og kendt for at producere lys farvning4. Derfor er isotype kontrolelementer ikke påkrævet. Dog hvis ændringer til denne metode ved hjælp af andre antistoffer er ønsket, er så brug af isotype kontrol antistoffer stærkt anbefales.
Denne eksperimentelle system præsenterer nogle begrænsninger. Skæring proceduren vil skade det væv, som kan påvirke funktionsmåden af CD8 T celler, især i nærheden snitfladen. Derudover kan en række opløselige faktorer (f.eks. kemokiner) medvirkende til styring af migrationen af T-celler gå tabt. En måde at omgå disse problemer er ved at overvåge T celler beliggende på flere snese mikron fra overfladen i formentlig sundere regioner af væv. Offentliggjorte forsøg afslører, at T celler lokaliseret dybt inde i vævet vandrer mere aktivt end T celler er lokaliseret nær den cut overflade4. Vi har brugt Konfokal mikroskoper til vores undersøgelser, men det er sandsynligt, at to-foton mikroskoper vil øge den rumlige opløsning i dybden.
Denne tilgang er baseret på brug af fluorescently kombineret antistoffer, der ikke er neutrale molekyler. Fuld størrelse antistoffer er modtagelige for at påvirke den normale funktion af T-celler på forskellige måder. Først, anti-CD8 antistoffer kan ændre T-celle migration ved at udløse en intracellulær signalering cascade kan påvirke lymfocyt cytoskelet. Andet, anti-CD8 antistoffer kan modulere samspillet mellem CD8 og MHC klasse i molekyler, et vigtigt skridt i antigen anerkendelse proces. Tredje, intakt antistoffer kan binde til Fc receptorer udtrykt af mange myeloide celler distribueres i tumor og derfor modtagelige at øge uspecifikke signal. Vi har ingen tegn på, at sådan et problem påvirket vores data, sandsynligvis fordi Fc receptorer af hjemmehørende myeloide celler er, i modsætning til celler i kultur, mættet med immunoglobuliner stede i tumor milieu. Faktisk, tilsætning af serum under proceduren mærkning, en proces kendt at blokere gratis Fc receptorer, ikke ændre immuno-farvningen. Ikke desto mindre Fab fragmenter af antistoffer, blottet for Fc region, såvel som antistoffer muteret i deres Fc region og camelid-afledte antistof fragmenter8 repræsenterer andre alternative strategier til at spore bosiddende celler med fluorescerende sporstoffer.
I de sidste årtier, er flere modelsystemer blevet udviklet og anvendes til real-time imaging af T-lymfocytter. Disse omfatter in vitro- præparater af T celler tidligere renset og dyrkede med antigen-præsenterer celler. Sådanne præparater har gjort bemærkelsesværdige fremskridt med at definere mekanismerne af antigen anerkendelse og lydhørhed. Men de mangler kompleksitet af væv miljø. Andre præparater har fastslået at mere nøje efterligne struktur af en indfødt væv. Eksempler, tre-dimensionelle kollagen gel matricer i hvilke renset T celler har været indkapslet, samt kultur af reaggregated væv fragmenter er blevet brugt til at overvåge den dynamiske opførsel af T-lymfocytter med fluorescerende imaging technologies9 . Disse systemer præsentere fordel af en arkitektur, tæt på den oprindelige væv, men de mangler andre vigtige faktorer, cellulære og opløselige. I mus, er to-foton intravital mikroskopi ansat til at spore T-celler i en intakt orgel10virkelig fysiologiske miljø. Sådan tilgang er imidlertid teknisk svært at sætte op. Derudover vise musemodeller bemærkelsesværdige forskelle med det menneskets fysiologi.
Den teknik, der er beskrevet i denne protokol repræsenterer en komplekse multi-cellulære tumor miljø, der er unikt positioneret for at fungere som et vigtigt bindeled mellem Co kultur studier og dyremodeller.
Protokollen beskrevet heri kan også bruges til at spore motilitet af andre celler end CD8 T-lymfocytter som antistoffer er blevet genereret. Derudover kan teknikken tilpasses til andre menneskelige og murine tumorer og væv. Vi har eksempelvis kunnet billede i realtid dynamikken i B-celler mærket med en anti-CD19 antistof i frisk menneskelige mandler.
Den teknik, der er beskrevet i denne protokol giver mulighed for skærmen for terapeutisk molekyler kontrollerende T-celle motilitet i væv. Tilgængelighed for kultur-systemet gør det muligt at anvende nogle farmakologiske reagenser og teste deres konsekvenser for T-celle migration. Det er nu accepteret at CD8 T-celler i voksende tumorer, udviser en lav migration og reduceret kontakter med tumor celler11. Vigtigere, sparsomme forekomst af T-celler i tumor celle regioner er knyttet til et dårligt resultat og anses for at være en af resistensmekanismer til T-celle-baserede cancer immunterapi. Flere forhindringer begrænse T celler fra overflytning i tumorer er blevet identificeret, herunder en tætte ekstracellulære matrix. I denne henseende er identifikation af molekyler købedygtig genindføre T-celle motilitet og interaktion med maligne celler et vigtigt skridt i cancer immunterapi. I en tidligere undersøgelse fandt vi, at en delvis nedbrydning af kollagen med collagenase, akut anvendes til menneskelige lunge skiver, forbedrer kontakt af T-celler med tumorceller.
Endelig tilbyder muligheden for at holde menneskelige tumor skiver i kultur for op til flere dage7,12,13 en række lovende applikationer på sigt af T-celler og immunterapi.Stabiliteten i modelsystemet under lang sigt kultur er dog en vigtig parameter, der skal vurderes grundigt.
At få friske og sunde væv er en kritisk faktor til at producere kvalitet skiver med god immunfarvning af CD8 celler, tumorceller og stromale elementer. Holde tumor biopsi ved 4 ° C forud for forarbejdningen er afgørende.
Håndtering af skiver med fine pincet repræsenterer endnu et kritisk skridt i denne protokol. Dette bør udføres med stor omhu som Agarosen kan være let beskadiget. Et snit i Agarosen vil kompromittere seglet lavet af rustfrit stål vaskemaskinen resulterer i en lækage af det antistof, som indeholder løsninger.

CD8 T celler spiller en afgørende rolle i kampen mod kræft. Mange undertrykkende mekanismer forhindrer dog T-lymfocytter dræbe maligne celler. I de seneste år, er flere lovende strategier, der slipper bremserne på T-celler blevet udviklet og anvendes i klinik5. De to tilgange, der bevarer betydelig opmærksomhed er immun checkpoint-målretning antistoffer, såsom anti-PD-1 og adoptivforældre T-celle terapi. Alligevel, trods nylige succeser, kun en delmængde af patienter drage fordel af disse behandlingsformer6. En stor udfordring er at identificere mekanismer af modstandsdygtighed over for cancer immunterapi for at udvikle mere effektive behandlinger. En anden udfordring er at udvikle modelsystemer i hvilke roman behandlingsformer kan karakteriseret og testet for deres sikkerhed og potens. Hidtil har er de fleste af disse analyser baseret på in vitro- celle kultur systemer der dårligt efterligner kompleksiteten af tumor væv.
Ex vivo væv skiver er en lovende teknik, da det bevarer den oprindelige væv mikromiljø7. Gennem årene har vi oprettet denne tilgang til at spore dynamikken i T-lymfocytter i forskellige væv. Vores resultater viser, at fluorescently mærket T celler tilføjede på toppen murine lymfeknude skiver migrere ind i vævet og reagere på deres passende microenvironmental stikord1,2. På samme måde er T-lymfocytter overlejret på menneskelige lunge tumor skiver hurtigt rekrutteret til tumor stroma3. Brug af denne teknik, har vi identificeret den ekstracellulære matrix som et vigtigt element i styring af distribution og migration af T-celler i humane tumorer3,4. Fordi adfærd af ex vivo renset og forgyldt T celler afspejler ikke nødvendigvis funktionsmåden for hjemmehørende intratumoral T lymfocytter, har vi for nylig forfinet denne metode4.
Her beskriver vi en protokol for at spore bosiddende T-lymfocytter i skiver fremstillet af friske menneskelige lunge tumorer. De forskellige trin består af forberedelse af menneskelige lunge tumor skiver (herunder Agarosen indlejring og vibratome skæring af indlejrede væv), farvning af endogene T celler med fluorescerende antistoffer i frisk tumor skiver, og overvågning af disse celler med en Konfokal mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 T celler er vigtige aktører i kampen mod kræft. For at CD8 T celler til at dræbe tumorceller, de har brug at komme ind til svulsten, overflytte inden for tumor mikromiljø og reagere hensigtsmæssigt på tumor antigener. Den seneste udvikling af forbedrede imaging tilgange, såsom 2-foton mikroskopi, og brugen af kraftfulde musen tumor modeller har kastet lys over nogle af de mekanismer, der regulerer anti-tumor T celle aktiviteter. Sådanne systemer har givet værdifulde indsigter, de ikke altid forudsige menneskers svar. I human kommer vores viden i feltet hovedsageligt fra en beskrivelse af fast tumor prøver fra patienter, som in vitro- undersøgelser. Dog in vitro- modeller mangler det komplekse tredimensionale tumor miljø, og derfor er ufuldstændig tilnærmelser af in vivo T-celle aktiviteter. Friske skiver fremstillet af eksplanterede væv repræsenterer en komplekse multi-cellulære tumor miljø, der kan fungere som et vigtigt bindeled mellem Co kulturperler undersøgelser og dyremodeller. Oprindeligt oprettet i murine lymfeknuder1 og tidligere beskrevet i en JoVE artikel2, er denne fremgangsmåde nu blevet omsat til menneskelige tumorer at undersøge dynamikken i både forgyldt3 samt bosiddende T celler4.
Her, er en protokol for forberedelse af menneskelige lunge tumor skiver, immunfarvning af hjemmehørende CD8 T og tumor celler og sporing af CD8 T-lymfocytter i tumor mikromiljø bruger Konfokal mikroskopi beskrevet. Dette system er unikt placeret til at screene for romanen immunterapi agenter favorisere T-celle migration i tumorer.

Menneskelige lunge tumorer er normalt stærkt infiltreret i CD8 T-celler, der findes fortrinsvis i stroma3,4. Ved at følge denne protokol skal man forvente at visualisere en lang række immunostained CD8 T i menneskelige lunge tumor skiver. En co mærkning med anti-EpCAM og anti-CD90 antistoffer bør tillade for at afgrænse tumor Holme og stromale områder. Fibrillar kollagen, rigelige i stroma tumor kan visualiseres uden eksogene farvning ved hjælp af anden generation af harmoniske på en to-foton mikroskop3,4. Bemærk at nogle menneskelige lunge tumorer præsentere nogen klar sondring mellem tumor Holme og stroma. Sådanne svulster skal kasseres og modellen præsenterer store områder af celle nekrose identificeret af ikke-specifik binding af antistoffer og DAPI farvning. Overensstemmelse med offentliggjorte resultater opnået i menneskelige lunge og æggestokkene karcinomer, bosiddende CD8 T celler er mere koncentreret i stroma i forhold til tumor Holme4. Et repræsentativt eksempel på CD8 T celle fordeling i forhold til tumorceller og CD90 er vist i figur 2.
Skive analysen giver mulighed for analyse af hjemmehørende T celle motilitet i forskellige tumor regioner. Nyttige kriterier for at sammenligne CD8 T celle motilitet i forskellige regioner omfatter den gennemsnitlige hastighed (stilængde divideret med varigheden for stikprøven) og forskydning længde (vektor mellem begyndelsen og slutningen af et spor). Selv om knappe i tumor Holme, vandrer CD8 T celler mere aktivt i dette rum, i forhold til stroma (figur 3). I gennemsnit, skal den gennemsnitlige hastighed af individuelle CD8 T celler være tæt på 4 µm/min i tumor stroma med høj intra- og Inter tumor variabilitet4. I tumor stroma, er motilitet af hjemmehørende T celler stærkt påvirket af den tæthed og orientering af ekstracellulære matrix fibre3,4. En vellykket eksperiment vil resultere i mindre T celler findes i tætte matrix områder sammenlignet med løs matrix regioner, i overensstemmelse med offentliggjorte resultater3,4.
Bemærk, at nogle menneskelige lunge tumorer udviser et meget højt niveau af autofluorescence udelukker tænkelig bopæl T celler. Sådanne indslag er hurtigt observeret i begyndelsen af imaging-session. Autofluorescent tumorer bør kasseres. Et repræsentativt eksempel på bopæl CD8 T celler i en autofluorescent tumor er vist i figur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figur 1: fotografier af ordningen perfusion. A) den phenol rød-fri RPMI løsning er beriget med 5% C02, 95% O2. B) løsningen er derefter perfunderet af en peristaltisk pumpe. C) RPMI-løsningen ind kultur parabol via fjorden. På outlet, er løsningen indsugning af pumpen fra salen til en spildbakken. Bemærk at aspiration tip er indstillet på en plan til at bestemme løsning højde. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figur 2: fordeling af hjemmehørende CD8 T celler i en menneskelig lunge tumor. Repræsentativt billede af en menneskelig lunge tumor skive farves for CD8 (grøn), EpCAM (blå) og CD90 (rød). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figur 3: motilitet af hjemmehørende CD8 T celler i en menneskelig lunge tumor. Baner af individuelle bosiddende CD8 T-celler i stromale (rød) og tumor celle (blå) regioner af en menneskelig lunge karcinom skive. Skive var plettet med de angivne antistoffer og afbildet i 20 min. med en Konfokal mikroskop. Den fibrillære kollagen blev opdaget i slutningen ved hjælp af anden harmonisk generation (SHG) på en to-foton mikroskop. Spor er farvekodede ifølge CD8 T celle fortrængning længde. Dette billede er blevet ændret fra 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figur 4: repræsentativt billede af en autofluorescent menneskelige lunge tumor. Tumor skive var plettet for CD8 (grøn) og EpCAM (blå). SHG signalet er i rødt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Denne protokol beskriver en metode til image bosat tumor infiltrerer CD8 T celler mærket med fluorescently koblede antistoffer i menneskelige lunge tumor skiver. Denne teknik giver mulighed for real-time analyser af CD8 T celle migration ved hjælp af Konfokal mikroskopi.

Ex Vivo Billeddannelse af hjemmehørende CD8 T-lymfocytter i menneskelige lunge Tumor skiver bruger konfokalmikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionukleid-fluorescens Reporter gen Imaging for at spore Tumor Progression i gnavere Tumor modeller

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirus for Tumor-målrettet Immunomodulation: Design og evaluering Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning af lungetumorprogression hos mus ved ultralydsscanning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Patologisk analyse af lungemetasase Efter Lateral Hale-Vene Injektion af tumorceller

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...