Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Wij willen bedanken van Pierre Bourdoncle en Thomas Guilbert van de Cochin Imaging faciliteit (Institut Cochin, Parijs) voor advies en hulp met microscopen. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Franse Ligue Nationale contre le Cancer, door de CARPEM (Cancer Research voor gepersonaliseerde geneeskunde), door de Fondation de France en door onderzoek en innovatie programma van de Europese Unie Horizon 2020 onder subsidie overeenkomst No 667980 (CARAT).

Menselijke tumoren werden verkregen met instemming van de Franse ethische Commissie en door het Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) in de toepassing met het artikel L.1121-1 van de Franse wet. Een schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van de patiënten voorafgaand aan de opname in de studie.
1. het verkrijgen van menselijke longen tumoren
<ol>
	<li>Verse Long tumor monsters verkrijgen bij patiënten met stadium I-III niet-kleincellige longkanker die onderging een volledige chirurgische resectie van hun longen tumoren4.</li>
	<li>Het vervoer van de niet-vaste verse tumor in conische buis 15 mL met ijskoude Roswell Park Memorial Instituut (RPMI 1640) medium. Gereserveerd op het ijs gedurende 30 minuten tot stap 2.7. Opmerking: Wanneer tumoren worden ontvangen in de middag, plaats ze bij 4 ° C's nachts en de volgende dag proces. In dit geval een aanvulling op de RPMI-1640 media met 5% foetale runderserum (FBS).</li>
</ol>
2. Agarose insluiten en vibratome snijden van menselijke longen tumoren
Opmerking: Alle stappen tot en met 2.10 onder steriele omstandigheden.
<ol>
	<li>Voorbereiden op 5% agarose oplossing insluiten door ontbinding van 1 g laag-melting point agarose in 20 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium. Magnetron deze oplossing totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de agarose afkoelen bij 37 ° C door het plaatsen van de oplossing in een incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Bereiden in de kap van een weefselkweek, volledige RPMI-1640 medium (zonder fenol rood) met 10% foetale runderserum (FBS), 4 mM L-glutamine en 1 x penicilline en streptomycine.</li>
	<li>Volledige RPMI-1640-medium 1.1 mL per putje toevoegen aan een 6-well cel cultuur plaat en plaats een 30 mm invoegen voor de cultuur van de cel in elk putje. Gereserveerd de plaat in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten tot stap 2.12.</li>
	<li>Plaats gesteriliseerd roestvast stalen vlakke sluitringen (inwendige diameter van 5 mm buiten diameter van 10 mm en een dikte van 1 mm) in een 35-mm kunststof schotel gevuld met RPMI compleet medium. Sluitringen zal verder worden gebruikt voor het concentreren van de antilichamen op het vibratome-cut-segment.</li>
	<li>De biopsie van de tumor in een 10-cm kunststof schotel plaatsen en snijd de tumor met een scherp mes in kleine kubus vorm fragmenten van ongeveer 5 x 5 mm lengte.</li>
	<li>Neem de agarose uit de incubator en giet de oplossing in een kunststof schotel van 35-mm.</li>
	<li>Gebruik een paar pincet om zorgvuldig de tumor fragmenten naar een veeg weefsel te verwijderen van de overmaat van medium. De fragmenten invoegen in de agarose en plaats deze aan de onderkant van de kunststof schotel. Laat de agarose gel op het ijs gedurende 5 minuten om te stollen.</li>
	<li>Zodra de agarose stolt, omkeren van de kunststof schotel en gebruik een spatel om de hele gel vrij te geven.</li>
	<li>Gebruik een scherp mes om de overtollige agarose rondom de tumor fragment, verlaten van 3-5 mm van de gel rond het weefsel trim.</li>
	<li>Mount elke agarose blok op de schijf van het specimen van de vibratome met een daling van de niet-toxisch butyl cyanoacrylaat weefsel lijm. Vul de vibratome buffer lade met steriele ijskoude PBS en installeren van de model-schijf in de lade.</li>
	<li>Knip de agarose ingebed weefsel in 350 µm dikke sneden. Pas de instellingen van de vibratome met een snelheid van langzame bereik (0,2-0,3 mm/s) en de frequentie van de trillingen op een middellange afstand (1,5 mm).</li>
	<li>Met behulp van fijne pincet, zorgvuldig verzamelen de tumoren segmenten zoals ze zijn ingekrompen en plaats ze plat op de cel cultuur inzetstukken van een 6-well plaat (stap 2.3). 1 sneetje overbrengen op elke toevoeging. Gebruik grote zorgvuldigheid bij het verwerken van segmenten zoals zij gemakkelijk kunnen worden beschadigd.</li>
	<li>Gebruik fijne pincet om Roestvrijstalen ringen op elke individuele slice. Zorg ervoor dat de ringen zijn goed gepositioneerd op de agarose rondom de tumor weefsel.</li>
	<li>De plaat van de cultuur bij 37 ° C in een 5% CO2 bevochtigde incubator voor 10 min. doorgaan naar immunokleuring handhaven.</li>
</ol>
3. immunokleuring van resident CD8 T-cellen en tumorcellen
<ol>
	<li>Verdun de antilichamen (eindconcentratie 10 µg/mL) en de nucleaire kleurstof (eindconcentratie 1 µg/mL) in RPMI-1640 media zonder fenol rood. Opmerking: Gebruik fluorescently-coupled anti-CD8 (lymfkliertest IgG, kloon SK1) en anti-EpCAM (epitheliale cel adhesie molecuul) (lymfkliertest IgG HEA-125) antilichamen tegen label CD8 T lymfocyten en tumor epitheliale cellen, respectievelijk. Gebruik fluorescently-coupled anti-CD90/Thy1 (lymfkliertest IgG, kloon 5E10) antilichaam aan label fibroblasten en geactiveerde endotheliale cellen. Gebruik 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) op het etiket van de kern van cellen met een gecompromitteerde plasmamembraan om te beoordelen van de levensvatbaarheid van het weefsel.</li>
	<li>Verwijderen van de cultuur-platen uit de incubator en iedere vloeistof binnen de ringen van edelstaal gecombineerd met een pipet. Verwijder niet de 1.1 mL RPMI-1640-media die onder de cel cultuur inserts (stap 2.3) geplaatst.</li>
	<li>Zonder het aanraken van het segment en met behulp van een pipet tip, voeg 40 µL van de oplossing met de antilichamen op elk segment van de tumor.</li>
	<li>Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 15 minuten zodat antilichaam kleuring.</li>
	<li>Met een fijne Tang, verwijder de sluitringen, nemen de segmenten, en duik hen 10 s in RPMI-1640 media zonder fenol rood. Plaats terug de plakjes op de cel cultuur inserts en voeg een druppel fenol red-gratis RPMI-1640 middellange op elke individuele slice. De plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten doorgaan met imaging behouden blijven.</li>
</ol>
4. imaging en analyseren van resident CD8 T-cel migratie binnen de menselijke longen tumor segmenten
Opmerking: De confocal microscoop gebruikt in dit protocol is een rechte draaiende schijf voorzien van een 25 x water onderdompeling doelstelling (25 x / 0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Microscoop setup voorbereiden<ol>
		<li>Stel de temperatuur van de Microscoop warmte-kamer bij 37 ° C een paar uur voordat de imaging-sessie.</li>
		<li>Instellen van een systeem om voortdurend perfuse tumor segmenten met zuurstof (5% CO2, 95% O2) fenol rood-vrije RPMI medium (Figuur 1). Gebruik een peristaltische pomp de perfusie media stromen naar de imaging kamer en naar de oplossing in een maatkolf van afvalinzameling gecombineerd.</li>
		<li>De slangenpomp zodat de zuurstofrijk oplossing te gaan door middel van de perfusie-buizen worden uitgevoerd.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Haal met een fijne Tang, het segment van de 6-well plaat en de overdracht het aan de 35-mm kunststof schotel gevuld met fenol rood-vrije RPMI medium. Het segment met een 19.7 mm diameter segment anker met 2 mm spaced-threads te immobiliseren. Plaats de petrischaal op de imaging stadium van de Microscoop. Sluit de uiteinden van het inlaat en uitlaat van de perfusie-systeem. Schakel op de perfusie-systeem en stel het debiet van de media op 0,8 mL/min.</li>
	<li>De doelstelling van de water-onderdompeling van het segment te verlagen. Focus op de top van het segment met heldere veld licht.</li></ol>Met behulp van passende tl-licht, selecteer een regio van belang waarin CD8 T cellen, tumor eilandjes (positief voor EpCAM) en een (positief voor de CD90) stroma-gebied. Controleer de levensvatbaarheid van de cellen binnen het segment door de beoordeling van de DAPI kleuring op het snijvlak geconstateerd en dieper in het weefsel. Opmerking: Een gezonde segment bevat slechts een minderheid van de DAPI positieve cellen bij verschillende micron van het snijvlak.
	<li>Het instellen van een imaging-sessie met de volgende acties.<ol>
		<li>Afhankelijk van de intensiteit van het fluorescerende signaal van de 3 fluorophores, stelt u de belichtingstijd tussen 50 tot 800 ms en de intensiteit van de laser tussen 20 tot 40%.</li>
		<li>Selecteer de dikte van de stapel z naar afbeelding binnen het segment van de tumor. Opmerking: Hier, 10-12 optische vliegtuigen verspreid over een totale diepte van 60-70 µm in de z-dimensie werden gevangen genomen.</li>
		<li>Selecteer de beginpositie op ongeveer 10 µm onder de eerste gelabelde CD8 T-cellen.</li>
		<li>Definiëren van het tijdsinterval tussen elke afbeelding van de z-stack tussen 10 tot 30 s en de totale opnametijd tussen 10 tot 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resident CD8 T-cel migratie analyseren zoals beschreven in referentie4.<ol>
		<li>Na het importeren van de gegevens naar een tracking software maken vlekken voor elke CD8 T cel in het veld De diameter van de cellen en de drempel van detectie volgens op de verbeelde fluorescerende cellen aanpassen.</li>
		<li>Inspecteer de tracks en irrelevante nummer verwijderen door ze te verwijderen. Juiste tracks door aansluiten en loskoppelen van de verschillende tracks en verschillende tijdstippen van de dezelfde tracks. De gegevens (track snelheid, verplaatsing Tracklengte) exporteren naar een spreadsheet-software.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een eenvoudige, snelle en robuuste techniek voor het genereren van menselijke longen tumor segmenten en beoordeling van het dynamisch gedrag van resident CD8 T-cellen in een omgeving van de bewaarde tumor met behulp van een confocal microscoop wordt beschreven. Dit protocol is een verfijning van een vorige JoVE artikel die beschrijft het toezicht op vergulde T-cellen op lymfkliertest lymfeklier segmenten2.
Bleken van fluorescente kleurstoffen moet vooral met de eerste generatie kleurstoffen zoals fluoresceïne isothiocyanaat en phycoerythrin worden beschouwd. We vonden dat een uitgesproken photobleaching van antilichamen direct-in combinatie met een twee-foton microscoop plaatsgevonden. Omgekeerd, minimale photobleaching werd opgemerkt met confocal microscopen, vooral met helder fluorescerende verfstoffen onlangs ontwikkeld.
Antilichamen zijn relatief grote moleculen en hun penetratie in het weefsel kan dus moeilijk. Deze stap kan worden verbeterd door het verhogen van de incubatietijd. Bovendien, kleuring het gebruik van een kleinere reagentia zoals direct-coupled Fab fragmenten van antilichamen vertegenwoordigt een goed alternatief.
Alle antilichamen die worden beschreven in dit protocol hebben eerder gevalideerd en bekend voor de productie van lichte kleuring4. Isotype besturingselementen zijn daarom niet vereist. Echter als wijzigingen aan deze methode met andere antilichamen gewenst zijn, wordt dan het gebruik van isotype controle antilichamen sterk aangeraden.
Dit experimenteel systeem presenteert enkele beperkingen. De procedure snijden beschadigt het weefsel, die invloed kan hebben op het gedrag van CD8 T-cellen, met name in de buurt van het snijvlak. Daarnaast kunnen een aantal oplosbare factoren (bijvoorbeeld chemokines) instrumentale bij het beheersen van de migratie van T cellen verloren. Unidirectioneel om te omzeilen deze problemen is door monitoring van T-cellen gelegen op enkele tientallen microns van het oppervlak van het weefsel vermoedelijk gezonder regio. Gepubliceerde experimenten blijkt dat T-cellen gelokaliseerd diep in het weefsel actiever dan T cellen gelokaliseerd in de buurt van de geslepen oppervlakte4migreren. We hebben onze studies confocal microscopen gebruikt maar het is waarschijnlijk dat twee-foton microscopen de ruimtelijke resolutie in diepte zal toenemen.
Deze aanpak is gebaseerd op het gebruik van fluorescently-coupled antilichamen die geen neutrale moleculen. Full-size antilichamen zijn gevoelig voor de normale werking van T-cellen op verschillende manieren beïnvloeden. Eerst, kunnen anti-CD8 antilichamen T-cel migratie wijzigen door triggering van een intracellulair signalering cascade kunnen beïnvloeden van het cytoskelet van de lymfocyt. Ten tweede, anti-CD8 antilichamen kunnen het moduleren van de interactie tussen CD8 en MHC klasse I moleculen, een belangrijke stap in het proces van de erkenning van antigeen. Derde, intact antilichamen kunnen binden aan Fc receptoren uitgedrukt door veel myeloïde cellen verdeeld in de tumor en dus gevoelig te verhogen van het niet-specifieke signaal. Wij hebben geen aanwijzing dat dergelijk probleem beïnvloed onze gegevens, waarschijnlijk omdat Fc receptoren van resident myeloïde cellen zijn, in tegenstelling tot cellen in cultuur, verzadigd met immunoglobulinen aanwezig binnen de omgeving van de tumor. Inderdaad, de toevoeging van het serum tijdens de labeling procedure, een proces dat bekend staat voor het blokkeren van gratis Fc receptoren, niet veranderen de immuno-kleuring. Echter Fab fragmenten van antilichamen, verstoken van Fc regio, evenals antilichamen gemuteerd in hun regio Fc en kameelachtige afkomstige antilichaam fragmenten8 andere alternatieve strategieën voor het bijhouden van resident cellen met fluorescerende traceurs vertegenwoordigen.
In de afgelopen decennia zijn verschillende modelsystemen ontwikkeld en gebruikt voor de real-time beeldvorming van T-lymfocyten. Het gaat hierbij om in vitro preparaten van T cellen eerder gezuiverde en gekweekte met antigeen-presenteren cellen. Dergelijke preparaten hebben opmerkelijke vooruitgang bij de vaststelling van de mechanismen voor antigeen erkenning en responsiviteit toegestaan. Echter, zij missen de complexiteit van de omgeving van het weefsel. Andere bereidingen hebben vastgesteld dat meer nauw na te de structuur van een inheemse weefsel bootsen. Voor voorbeelden, driedimensionale collageen gel matrices die in gezuiverde T cellen hebben opgenomen, alsook cultuur van reaggregated weefsel fragmenten zijn gebruikt voor het controleren van het dynamisch gedrag van T-lymfocyten met fluorescerende imaging technologieën9 . Deze systemen dienen het voordeel van een architectuur dichtbij het eigen weefsel, maar ze missen andere belangrijke cellulaire en oplosbare factoren. Twee-foton intravital microscopie is in muis werkzaam voor het bijhouden van T-cellen in de echt fysiologische omgeving van een intact orgel10. Dergelijke aanpak is echter technisch moeilijk om in te stellen. Bovendien tonen Muismodellen opmerkelijke verschillen met de menselijke fysiologie.
De techniek wordt beschreven in dit protocol vertegenwoordigt een complexe multi-cellulaire tumor-omgeving die is uniek gepositioneerd om te fungeren als een belangrijke schakel tussen co Cultuurwetenschappen en diermodellen.
Het protocol hierin beschreven kan ook worden gebruikt voor het bijhouden van de beweeglijkheid van andere cellen dan CD8 T lymfocyten waarvoor antilichamen zijn gegenereerd. Bovendien is de techniek kan worden aangepast aan andere menselijke en lymfkliertest tumoren en weefsels. Bijvoorbeeld, hebben wij geweest kundig voor afbeelding in real-time de dynamiek van B-cellen aangeduid met een anti-CD19 antistof in verse menselijke amandelen.
De techniek wordt beschreven in dit protocol voorziet in naar scherm therapeutische moleculen beheersing van de beweeglijkheid van de T-cel in de weefsels. De toegankelijkheid van de cultuur-systeem vergunningen toe te passen sommige farmacologische reagentia en het testen van hun gevolgen op T-cel migratie. Het is nu aanvaard dat in groeiende tumoren, CD8 T cellen een lage migratie vertonen en contacten met tumor cellen11verminderd. Nog belangrijker is, de schaarse aanwezigheid van T-cellen in de tumor cel regio's wordt geassocieerd met een slechte uitkomst en wordt beschouwd als een van de mechanismen van resistentie aan T-cel-gebaseerde kanker immunotherapie. Meerdere obstakels beperken van T-cellen van het migreren in tumoren zijn geïdentificeerd met inbegrip van een dichte extracellulaire matrix. In dit opzicht is de identificatie van moleculen kunnen herstellen van de beweeglijkheid van de T-cel en interactie met kwaadaardige cellen een belangrijke stap in kanker immunotherapie. In een eerdere studie vonden we dat een gedeeltelijke afbraak van collageen met collagenase, acuut toegepast op menselijke longen segmenten, het contact van T-cellen met tumorcellen verbetert.
Tot slot biedt de mogelijkheid om te houden van menselijke tumor segmenten in cultuur voor tot verschillende dagen7,-12,13 een aantal veelbelovende applicaties op termijn van T-cellen en immunotherapie.De stabiliteit van het modelsysteem tijdens lange termijn cultuur is echter een belangrijke parameter die moet grondig worden geëvalueerd.
Het verkrijgen van verse en gezonde weefsel is een kritische factor voor de productie van segmenten van de kwaliteit met goede immunokleuring van CD8 cellen, tumorcellen en stromale elementen. Houden van de biopsie tumor bij 4 ° C vóór verwerking is cruciaal.
De behandeling van segmenten met een fijne Tang is een andere kritische stap binnen dit protocol. Dit moet met grote zorg worden uitgevoerd, zoals de agarose kan gemakkelijk worden beschadigd. Een snee in de agarose zal het zegel dat is gemaakt door de RVS-wasmachine wat resulteert in een lekkage van het antilichaam met oplossingen in gevaar brengen.

CD8 T-cellen spelen een belangrijke rol in de strijd tegen kanker. Echter weerhouden vele onderdrukkende mechanismen T lymfocyten kwaadaardige cellen doden. De laatste jaren heeft zijn verschillende veelbelovende strategieën die het vrijgeven van de remmen op de T-cellen ontwikkeld en in de kliniek5gebruikt. De twee benaderingen die veel aandacht behouden zijn immuun checkpoint-targeting antilichamen, zoals anti-PD-1 en adoptief T celtherapieën. Toch, ondanks de recente successen, slechts een subset van patiënten profiteren van deze therapieën6. Een belangrijke uitdaging is het identificeren van mechanismen van resistentie tegen kanker immunotherapie teneinde een efficiëntere behandelingen. Een andere uitdaging is het ontwikkelen van modelsystemen in welke roman therapieën kunnen worden gekarakteriseerd en getest op hun werkzaamheid en veiligheid. Tot nu toe, zijn de meeste van deze tests gebaseerd op de in vitro cel cultuur systemen, die slecht de complexiteit van de tumor weefsel bootsen.
Ex vivo weefsel segmenten is een veelbelovende techniek, zoals het behouden van het oorspronkelijke weefsel communicatie7. Door de jaren heen, hebben we deze aanpak opgezet om bij te houden van de dynamiek van T lymfocyten in verschillende weefsels. Onze resultaten wijzen erop dat fluorescently geëtiketteerde T cellen toegevoegd bovenop lymfkliertest lymfeklier segmenten in het weefsel migreren en te op hun juiste microenvironmental signalen1,2 reageren. Ook zijn T-lymfocyten overlay op menselijke longen tumor segmenten snel gerecruteerd voor de stroma tumor3. Met behulp van deze techniek, hebben we de extracellulaire matrix geïdentificeerd als een belangrijk element bij het beheersen van de distributie en de migratie van T cellen in menselijke tumoren3,4. Omdat het gedrag van ex vivo gezuiverd en vergulde T cellen weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs het gedrag van ingezetene intratumoral T-lymfocyten, hebben wij onlangs deze aanpak4verfijnd.
Hier beschrijven we een protocol voor het bijhouden van de resident T lymfocyten binnen de segmenten gemaakt van verse menselijke longen tumoren. De verschillende stappen bestaan uit het opstellen van menselijke longen tumor plakjes (met inbegrip van agarose insluiten en vibratome afdelen van het ingesloten weefsel), de kleuring van endogene T cellen met fluorescerende antilichamen in verse tumor segmenten, en het toezicht op deze cellen met een confocal microscoop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 T cel zijn belangrijke spelers in de strijd tegen kanker. Om CD8 T-cellen te doden tumorcellen dat ze moeten invoeren in de tumor, migreren communicatie in het tumor en adequaat inspelen op de tumor-antigenen. De recente ontwikkeling van verbeterde imaging benaderingen, zoals 2-foton microscopie, en het gebruik van krachtige Muismodellen voor tumor hebben licht werpen op enkele van de mechanismen die anti-tumor T cel activiteiten reguleren. Overwegende dat dergelijke systemen hebben verstrekt waardevolle inzichten, ze doen niet altijd te voorspellen menselijke reacties. In mens komt onze kennis op het gebied vooral uit een beschrijving van vaste tumor monsters van menselijke patiënten, evenals in vitro studies. Echter in vitro modellen ontbreken de complexe driedimensionale tumor milieu en, dus, zijn onvolledig benaderingen van in vivo T cel activiteiten. Verse plakjes gemaakt van transplanteren weefsel vertegenwoordigen een complexe multi-cellulaire tumor-omgeving die als een belangrijke schakel tussen mede gekweekte studies en diermodellen fungeren kan. Oorspronkelijk opgericht in lymfkliertest lymfklieren1 en beschreven in een artikel JoVE2, is deze aanpak nu omgezet naar menselijke tumoren te onderzoeken van de dynamiek van zowel vergulde3 als resident T cellen4.
Hier, wordt een protocol voor de voorbereiding van de menselijke longen tumor segmenten, immunokleuring van resident CD8 T en tumor cellen, en het bijhouden van CD8 T lymfocyten binnen de communicatie van de tumor met behulp van de confocal microscopie beschreven. Dit systeem is uniek geplaatst om scherm voor roman immunotherapie agenten ten gunste van T-cel migratie in tumoren.

Menselijke longen tumoren zijn gewoonlijk zeer geïnfiltreerd in CD8 T-cellen die zich bij voorkeur in het stroma3,4 bevinden. Door het volgen van dit protocol moet men verwachten te visualiseren van een groot aantal immunostained CD8 T in menselijke longen tumor plakjes. Een mede labelen met anti-EpCAM en anti-CD90 antilichamen moet toestaan af te bakenen tumor eilandjes en stromale gebieden. Fibrillar collageen, overvloedig in het stroma tumor, kan worden gevisualiseerd zonder exogene kleuring met behulp van tweede-harmonische generatie op een twee-foton microscoop3,4. Merk op dat sommige menselijke longen tumoren geen duidelijk onderscheid tussen tumor eilandjes en stroma presenteren. Deze tumoren moeten evenals specimen presenteren van grote gebieden van cel necrose geïdentificeerd door niet-specifieke binding van antilichamen en DAPI kleuring worden weggegooid. Overeenstemming met gepubliceerde resultaten in menselijke longen en ovariële carcinomen, resident CD8 T-cellen zijn meer geconcentreerd in het stroma tumor eilandjes4t.o.v.. Een representatief voorbeeld van CD8 T cel verdeling ten opzichte van tumorcellen en CD90 is afgebeeld in Figuur 2.
De segment-bepaling voorziet in de analyse van de beweeglijkheid van de resident T cel in verschillende tumor regio's. Nuttige criteria voor het vergelijken van CD8 T cel motility in verschillende regio's omvatten de gemiddelde snelheid (weglengte gedeeld door de tijdsduur bemonsterd) en de lengte van de verplaatsing (de vector tussen het begin en einde van een nummer). Hoewel schaars in tumor eilandjes, migreren CD8 T cellen actiever in dit compartiment ten opzichte van het stroma (Figuur 3). Gemiddeld is de gemiddelde snelheid van afzonderlijke CD8 T cellen moet dicht bij 4 µm/min in het stroma tumor met hoge intra- en inter tumor variabiliteiten4. In het stroma tumor, is de beweeglijkheid van resident T cellen sterk beïnvloed door de dichtheid en de richting van de extracellulaire matrix vezels3,4. Een succesvolle experiment zal resulteren in minder aanwezig in dichte matrix gebieden ten opzichte van losse matrix regio's, overeenstemming met gepubliceerde resultaten3,4T-cellen.
Merk op dat sommige menselijke longen tumoren vertonen een zeer hoog niveau van autofluorescence uitschakeling van de beeldvorming van resident T-cellen. Deze functie is snel aan het begin van de beeldvorming zitting waargenomen. Autofluorescent tumoren moeten worden weggegooid. Een representatief voorbeeld van resident CD8 T-cellen in de tumor van een autofluorescent wordt weergegeven in Figuur 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figuur 1: foto's van het systeem van de perfusie. A) de RPMI fenol rood-vrije oplossing is verrijkt met 5% C02, 95% O2. B) de oplossing is dan geperfundeerd door een peristaltische pomp. C) de RPMI oplossing betreedt de schotel cultuur via de inlaat. Aan de uitlaat, is de oplossing aanzuiging van de pomp uit de zaal in een afvalcontainer. Merk op dat de aspiratie-tip is vastgesteld op een niveau te bepalen van de hoogte van de oplossing. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figuur 2: verdeling van de resident CD8 T cellen in een menselijke longen tumor. Representatief beeld van een menselijke longen tumor segment gekleurd voor CD8 (groen), EpCAM (blauw) en CD90 (rood). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figuur 3: beweeglijkheid van resident CD8 T cellen in een menselijke longen tumor. Trajecten van individuele resident CD8 T-cellen in de tumor cel (blauw) regio's een menselijke Long carcinoom segment en stromale (rood). Het segment werd gekleurd met de aangegeven antilichamen en beeld gedurende 20 minuten met een confocal microscoop. De fibrillary collageen werd ontdekt aan het einde met behulp van tweede-harmonische generatie (SHG) op een twee-foton microscoop. Tracks zijn vergelijkende volgens de lengte van de verplaatsing van CD8 T cellen. Deze afbeelding is gewijzigd van 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figuur 4: representatief beeld van een tumor van de menselijke longen autofluorescent. Het segment van de tumor was gekleurd voor CD8 (groen) en EpCAM (blauw). De SHG-signaal is in het rood. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Dit protocol beschrijft een methode om te afbeelding resident tumor-infiltreren CD8 T cellen aangeduid met fluorescently gekoppelde antilichamen binnen de menselijke longen tumor segmenten. Deze techniek staat real-time analyses van CD8 T-cel migratie met behulp van de confocal microscopie.

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Pathologische analyse van longmetastase na laterale staartaderinjectie van tumorcellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...