Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Nous tenons à remercier Pierre Bourdoncle et Thomas Guilbert de la Cochin Imaging Facility (Institut Cochin, Paris) de conseils et d’assistance avec des microscopes. Ce travail a été soutenu en partie par les subventions accordées par le Français Ligue Nationale contre le Cancer, par le CARPEM (recherche sur le Cancer pour Personalized Medicine), par la Fondation de France et par le programme de recherche et l’innovation de Horizon 2020 de l’Union européenne au titre de la subvention contrat N° 667980 (CARAT).

Les tumeurs humaines ont été obtenus avec l’accord du Comité d’éthique Français et de l’Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) en application de l’article L.1121-1 du code Français. Un consentement éclairé a été obtenu chez les patients avant l’inclusion dans l’étude.
1. obtenir des tumeurs du poumon chez l’humain
<ol>
	<li>Obtenir des échantillons de tumeur poumon frais auprès de patients présentant un cancer du poumon non à petites cellules stade I à III qui ont subi une résection chirurgicale complète de leurs tumeurs de poumon4.</li>
	<li>Transport la tumeur frais non fixée au tube conique 15 mL contenant le support glacé de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640). Mettre de côté sur la glace pendant 30 min avant l’étape 2.7. Remarque : Lorsque les tumeurs sont reçus dans l’après-midi, les placer à 4 ° C pendant la nuit et processus le lendemain. Dans ce cas, compléter les médias RPMI-1640 avec 5 % sérum fœtal (SVF).</li>
</ol>
2. Agarose incorporation et vibratome tranchage des tumeurs du poumon chez l’humain
Remarque : Effectuez toutes les étapes jusqu'à 2,10 dans des conditions stériles.
<ol>
	<li>Préparer une solution 5 % d’agarose pour l’enrobage en dissolvant 1 g bas point de fusion point d’agarose dans 20 mL stérile de solution saline tamponnée au Phosphate (PBS) sans calcium et magnésium. Cette solution au micro-ondes jusqu'à dissolution complète de l’agarose. Permettre l’agarose refroidir à 37 ° C en plaçant la solution dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Sous une hotte de culture tissulaire, préparer le milieu RPMI 1640 complet (sans rouge de phénol) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), glutamine mM 4 L et 1 x la pénicilline et la streptomycine.</li>
	<li>Ajouter le milieu RPMI 1640 complet de 1,1 mL par puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits et placer un insert de culture cellulaire 30 mm dans chaque puits. Mettre la plaque de côté dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min avant l’étape 2.12.</li>
	<li>Place stérilisés rondelles plates en acier inoxydable (diamètre intérieur de 5 mm, à l’extérieur de 10 mm de diamètre et l’épaisseur de 1 mm) dans un plat en plastique rempli de milieu complet RPMI en 35 mm. Rondelles servira encore à concentrer les anticorps sur la tranche de coupe-vibratome.</li>
	<li>Placer la biopsie de la tumeur dans un plat en plastique de 10 cm et couper la tumeur avec une lame tranchante en fragments de forme de petit cube d’environ 5 x 5 mm de longueur.</li>
	<li>Retirez l’agarose de l’incubateur et verser la solution dans un plat en plastique de 35 mm.</li>
	<li>Utilisez une paire de pinces pour transvaser avec soin les fragments de la tumeur à une lingette de tissu pour enlever l’excès de moyen. Insérez les fragments dans l’agarose et placez-les au fond du plat en plastique. Laisser le gel d’agarose sur glace pendant 5 min à se solidifier.</li>
	<li>Une fois que l’agarose se solidifie, renverser le plat en plastique et utilisez une spatule pour libérer le gel entier.</li>
	<li>Utilisez une lame tranchante pour couper l’excès d’agarose entourant le fragment de la tumeur, laissant 3 à 5 mm de gel autour du tissu.</li>
	<li>Montez chaque bloc d’agarose sur le disque de spécimen du vibratome avec une goutte de colle de tissus non toxique butyl cyanoacrylate. Remplir la cuve à tampon vibratome avec PBS glacee stérile et installer le disque de spécimen dans la barre d’État.</li>
	<li>Couper l’agarose incorporé tissu en tranches épaisses de 350 µm. Ajustez les paramètres vibratome à une vitesse lente gamme (0,2 à 0,3 mm/s) et la fréquence de vibration à une distance moyenne (1,5 mm).</li>
	<li>À l’aide de pinces fines, recueillir soigneusement les tranches de tumeurs car ils sont coupés et les placent à plat sur les inserts de culture cellulaire d’une plaque de 6 puits (étape 2.3). Transférer 1 tranche à chaque insertion. Utilisez le grand soin lors de la manipulation des tranches comme ils peuvent être facilement endommagées.</li>
	<li>Pince fine permet de poser les rondelles en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle. Assurez-vous que les rondelles soient bien positionnées sur l’agarose entourant le tissu tumoral.</li>
	<li>Maintenir la plaque de culture à 37 ° C dans une étuve humidifiée 5 % CO2 pendant environ 10 minutes procédez à immunostaining.</li>
</ol>
3. immunomarquage des cellules T CD8 résidents et les cellules tumorales
<ol>
	<li>Diluer les anticorps (concentration finale 10 µg/mL) et le colorant nucléaire (concentration finale 1 µg/mL) en milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol. Remarque : Utilisez fluorescent couplé anti-CD8 (IgG murine, clone SK1) et anti-EpCAM (molécule d’adhésion cellulaire épithéliale) (l’IgG murine HEA-125) anticorps d’étiqueter les lymphocytes T CD8 et tumeur des cellules épithéliales, respectivement. Utiliser des anticorps fluorescent couplé anti-CD90/Thy1 (IgG murine, clone 5E10) étiquette fibroblastes et les cellules endothéliales activées. Utilisez 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) d’étiqueter le noyau des cellules avec une membrane plasmique compromise afin d’évaluer la viabilité des tissus.</li>
	<li>Enlever les plaques de culture de l’incubateur et utiliser une pipette pour aspirer un liquide à l’intérieur des rondelles en acier inoxydable. N’enlevez pas le support de 1,1 mL RPMI 1640 placé sous les inserts de culture cellulaire (étape 2.3).</li>
	<li>Sans toucher la tranche et à l’aide d’un embout de la pipette, ajouter 40 µL de la solution contenant les anticorps sur chaque tranche de tumeur.</li>
	<li>Incuber les plaques à 37 ° C pendant 15 min permettre des anticorps.</li>
	<li>Avec une pince fine, retirer les rondelles, retirer les tranches et trempette eux 10 s en milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol. Introduire à nouveau les tranches sur les inserts de culture cellulaire et ajouter une goutte de rouge de phénol-libre RPMI-1640 moyenne sur chaque tranche individuelle. Maintenir la plaque à 37 ° C pendant 10 min. passez à l’imagerie.</li>
</ol>
4. imagerie et analyse de migration des cellules T CD8 résidente dans les tranches de tumeur du poumon humain
Remarque : La microscopie confocale utilisée dans le présent protocole est verticale tourne disque équipé d’un 25 x objectif à immersion d’eau (25 x / 0,95 N.A.).
<ol>
	<li>Préparer le programme d’installation de microscope<ol>
		<li>Régler la température de la chaleur-chambre de microscope à 37 ° C quelques heures avant de commencer la séance d’imagerie.</li>
		<li>Mettre en place un système pour perfuse constamment les tranches de la tumeur avec oxygénée (5 % CO2, 95 % de O2) un milieu RPMI sans rouge de phénol (Figure 1). Utiliser une pompe péristaltique à couler les médias de perfusion dans la chambre d’imagerie et d’aspirer la solution dans une fiole de collecte des déchets.</li>
		<li>Faire fonctionner la pompe péristaltique pour permettre à la solution oxygénée de passer par les tubes de perfusion.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Avec une pince fine, retirer la tranche de la plaque 6 puits et le transfert pour le plat en plastique de 35 mm rempli avec un milieu RPMI sans rouge de phénol. Immobiliser la tranche avec une ancre de tranche de diamètre 19,7 mm à 2 mm espacés-filetage. Placez la boîte de Pétri sur la scène d’imagerie du microscope. Connectez l’extrémité d’entrée et de sortie du système de perfusion. Allumez le système de perfusion et régler le débit de médias à 0,8 mL/min.</li>
	<li>Abaisser l’objectif immersion dans l’eau à la tranche. Mettre l’accent sur le dessus de la tranche avec la lumière du champ lumineux.</li></ol>Éclairage fluorescent approprié, sélectionnez une région d’intérêt qui contient des cellules T CD8, d’îlots de tumeur (positifs pour EpCAM) et une zone de stroma (positive pour CD90). Vérifier la viabilité des cellules au sein de la tranche en évaluant le DAPI, coloration à la surface coupée et plus profondément dans le tissu. Remarque : Une tranche saine contient seulement une minorité de cellules positives DAPI à quelques microns de la surface de coupe.
	<li>Définir une session d’imagerie avec les actions suivantes.<ol>
		<li>Selon l’intensité du signal fluorescent des 3 fluorophores, définir le temps d’exposition entre 50 et 800 ms et l’intensité du laser entre 20 à 40 %.</li>
		<li>Sélectionnez l’épaisseur z de pile pour l’image dans la tranche de la tumeur. NOTE : Ici, 10-12 avions optiques s’étendant sur une profondeur totale de 60-70 µm dans la dimension z ont été capturées.</li>
		<li>Sélectionnez la position de départ à environ 10 µm ci-dessous les premières cellules T CD8 marqués.</li>
		<li>Définissez l’intervalle de temps entre chaque image z-pile entre 10 et 30 s et la durée d’enregistrement totale comprise entre 10 et 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analyser la migration des cellules T CD8 résidente tel que décrit dans référence4.<ol>
		<li>Après avoir importé les données à un logiciel de suivi, créer des spots pour chaque cellule CD8 T dans le domaine. Ajuster le diamètre des cellules et le seuil de détection selon sur les cellules fluorescentes imagés.</li>
		<li>Inspecter les pistes et supprimer n’importe quelle piste hors de propos en les supprimant. Pistes correctes de branchement et débranchement des différentes pistes et des moments différents des mêmes voies. Exporter les données (piste vitesse, longueur de déplacement des voies) dans un logiciel de feuille de calcul.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Une technique simple, rapide et robuste pour la production de tranches de tumeur du poumon humain et l’évaluation du comportement dynamique de cellules de T de CD8 résidant dans un environnement préservé de tumeur à l’aide d’un microscope confocal est décrite. Ce protocole est un raffinement d’un précédent article de JoVE qui décrit le contrôle des cellules de T plaqués sur ganglions murins tranches2.
Blanchiment des colorants fluorescents doit être considérée en particulier avec des teintures de première génération comme l’isothiocyanate de fluorescéine et phycoérythrine. Nous avons constaté qu’un photoblanchiment prononcé d’anticorps couplés directement s’est produite avec un microscope biphotonique. À l’inverse, minime photoblanchiment se fait remarquer avec des microscopes confocaux, surtout ceux qui utilisent des colorants fluorescents lumineux mis au point récemment.
Les anticorps sont relativement grosses molécules et leur pénétration dans les tissus peut donc s’avérer difficile. Cette étape peut être améliorée en augmentant le temps d’incubation. En outre, l’utilisation une petite coloration réactifs tels que directement couplés des fragments Fab d’anticorps représente une bonne alternative.
Tous les anticorps décrits dans le présent protocole ont été précédemment validés et connus pour sa production de coloration lumineuse4. Isotype contrôles ne sont donc pas nécessaires. Toutefois, si vous désirez modifier cette méthode à l’aide d’autres anticorps, l’utilisation des anticorps de contrôle isotype est fortement recommandée.
Ce système expérimental présente certaines limitations. La procédure de coupe risquent d’endommager les tissus, ce qui peuvent affecter le comportement des cellules T CD8, surtout près de la surface de coupe. En outre, un certain nombre de facteurs solubles (p. ex. les chimiokines) joué un rôle important dans le contrôle de la migration des lymphocytes T peut être perdu. Une façon de contourner ces problèmes est en surveillant les lymphocytes T situés à plusieurs dizaines de microns de la surface dans les régions sans doute plus saines du tissu. Expériences publiées révèlent que les cellules T localisées profondément dans le tissu migrent plus activement que les cellules T, localisés près de la surface coupée4. Nous avons utilisé les microscopes confocaux pour nos études, mais il est probable que les microscopes de deux photons augmenteront la résolution spatiale en profondeur.
Cette approche repose sur l’utilisation d’anticorps fluorescent couplés qui ne sont pas des molécules neutres. Pleines les anticorps sont susceptibles d’affecter le fonctionnement normal des cellules T de différentes manières. Tout d’abord, des anticorps anti-CD8 peuvent modifier la migration cellulaire T en déclenchant une cascade de signalisation intracellulaire pouvant affecter le cytosquelette de la lymphocyte. Deuxièmement, les anticorps anti-CD8 peuvent moduler l’interaction CD8 / MHC classe I molécules, une étape importante dans le processus de reconnaissance de l’antigène. Intacts, troisième peut se lient aux récepteurs Fc exprimés par plusieurs cellules myéloïdes distribuées dans la tumeur et donc susceptibles d’augmenter le signal non spécifique. Nous n’avons aucune indication que ce problème a affecté nos données, probablement parce que les récepteurs Fc des cellules myéloïdes résidents sont, contrairement aux cellules en culture, imprégnées des immunoglobulines présentes dans le milieu de la tumeur. En effet, l’ajout de sérum au cours de la procédure d’étiquetage, un processus appelé à bloquer les récepteurs Fc libres, n’a pas changé l’immunomarquage. Néanmoins, les fragments Fab d’anticorps, dépourvu de région Fc, ainsi que des anticorps une mutation dans leur région de Fc et anticorps dérivés de camélidés fragments8 représentent d’autres stratégies alternatives pour effectuer le suivi des cellules résidentes à traceurs fluorescents.
Au cours des dernières décennies, plusieurs systèmes de modèles ont été développés et utilisés pour l’imagerie en temps réel des lymphocytes T. Il s’agit de préparations de in vitro de cellules T préalablement purifiés et cultivées avec présentatrices. Ces préparations ont permis des progrès remarquables dans la définition des mécanismes de reconnaissance de l’antigène et de réactivité. Cependant, ils n’ont pas la complexité de l’environnement tissulaire. Autres préparations ont été établies qu’imite mieux la structure d’un tissu native. Pour obtenir des exemples, des matrices de gel de collagène en trois dimensions dans les cellules T purifiées ont été incorporées, ainsi que de la culture de tissus reaggregated des fragments ont été utilisés pour surveiller le comportement dynamique des lymphocytes T avec fluorescence imaging technologies9 . Ces systèmes présentent l’avantage d’une architecture proche du tissu natif, mais ils n’ont pas autres importants facteurs cellulaires et solubles. Chez la souris, microscopie intravitale biphotonique a été utilisée pour effectuer le suivi des cellules T dans l’environnement véritablement physiologique d’un organe intact de10. Toutefois, cette approche est techniquement difficile à mettre en place. En outre, les modèles de souris montrent des différences notables avec la physiologie humaine.
La technique décrite dans le présent protocole représente un environnement de tumeur multicellulaire complexe qui est particulièrement bien placé pour agir comme un lien important entre la culture mixte études et des modèles animaux.
Le protocole décrit ci-après peut également servir pour le suivi de la motilité d’autres cellules que les lymphocytes T CD8, pour laquelle les anticorps ont été générés. En outre, la technique peut être adaptée à d’autres tumeurs humaines et murines et tissus. Par exemple, nous avons été en mesure d’image en temps réel, marquée de la dynamique des lymphocytes B avec un anticorps anti-CD19 dans les amygdales humaines fraîches.
La technique décrite dans le présent protocole permet à l’écran pour les molécules thérapeutiques contrôlant la motilité des lymphocytes T dans les tissus. L’accès au système de culture permet d’appliquer certains réactifs pharmacologiques et tester leurs conséquences sur la migration des lymphocytes T. Il est maintenant admis que dans la croissance des tumeurs, les cellules T CD8 présentent une faible migration et réduit les contacts avec les cellules de tumeur11. Ce qui est important, la faible présence de lymphocytes T dans les régions de cellule tumorale est associée à un mauvais résultat et est considérée comme un des mécanismes de résistance à l’immunothérapie du cancer des lymphocytes T. Plusieurs obstacles limitant les cellules de T de migrer dans les tumeurs ont été identifiés, y compris une matrice extracellulaire dense. À cet égard, l’identification des molécules permettant de rétablir la motilité cellulaire T et l’interaction avec les cellules malignes représente une étape importante dans l’immunothérapie contre le cancer. Dans une étude précédente, nous avons constaté qu’une dégradation partielle de collagène avec la collagénase, appliquée aiguë des tranches du poumon humain, améliore le contact des cellules T avec les cellules tumorales.
Enfin, la possibilité de garder les tranches tumorales humaines en culture pour jusqu'à plusieurs jours7,12,13 propose un certain nombre d’applications prometteuses en terme de cellules T et l’immunothérapie.Toutefois, la stabilité du système modèle au cours de la culture à long terme est un paramètre important qui doit être soigneusement évaluée.
Obtention des tissus frais et sains est un facteur critique pour produire des tranches de qualité avec bonne immunomarquage des cellules CD8, les cellules tumorales et éléments stromales. Il est essentiel de garder la biopsie de la tumeur à 4 ° C avant le traitement.
La manipulation des tranches avec une pince fine représente une autre étape cruciale dans ce protocole. Cette modification doit être effectuée avec beaucoup de soin car l’agarose peut être facilement endommagé. Une coupe dans l’agarose compromettra le sceau de la rondelle en acier inoxydable et une fuite de l’anticorps contenant des solutions.

Lymphocytes T CD8 jouent un rôle clé dans la bataille contre le cancer. Nombreux mécanismes suppresseurs empêchent toutefois des lymphocytes T de tuer les cellules malignes. Durant les dernières années, plusieurs stratégies prometteuses qui libèrent les freins sur les cellules T ont été développés et utilisés dans la clinique5. Les deux approches qui retiennent l’attention considérable sont ciblage de point de contrôle immunitaire des anticorps, tels que les thérapies cellulaires T anti-PD-1 et adoptifs. Néanmoins, malgré des succès récents, seul un sous-ensemble de patients bénéficient de ces thérapies6. Un défi majeur consiste à identifier les mécanismes de résistance à l’immunothérapie du cancer afin de développer des traitements plus efficaces. Un autre défi consiste à développer des systèmes modèles dans quel roman thérapies peuvent être caractérisés et testés pour leur puissance et leur sécurité. Jusqu'à présent, la plupart de ces tests reposent sur in vitro systèmes de cultures cellulaires qui imitent mal la complexité du tissu tumoral.
Tranches de tissus ex vivo est une technique prometteuse, car elle conserve l' original du microenvironnement tissu7. Au cours des années, nous avons mis en place cette démarche pour suivre la dynamique des lymphocytes T dans divers tissus. Nos résultats indiquent que les cellules de T fluorescent étiquetés ajoutés au sommet de la murine ganglion tranches migrent dans les tissus et répondent à leurs signaux micro-environnementales appropriées1,2. De même, les lymphocytes T superposées sur tranches de tumeur du poumon humain sont rapidement recrutés dans la tumeur stroma3. En utilisant cette technique, nous avons identifié la matrice extracellulaire comme un élément important dans le contrôle de la distribution et la migration des cellules T dans les tumeurs humaines3,4. Parce que le comportement de ex vivo purifié et plaqué les lymphocytes T ne reflète pas nécessairement le comportement des résidents intratumorale T lymphocytes, nous avons récemment raffiné cette approche4.
Nous décrivons ici un protocole pour assurer le suivi des lymphocytes T résidents dans les tranches de tumeurs du poumon humain frais. Les différentes étapes consistent en la préparation de tranches de tumeur du poumon humain (y compris incorporation d’agarose et vibratome découpe du tissu embarqué), la coloration des cellules de T endogènes avec des anticorps fluorescents en tranches fraîches de tumeur et le suivi des ces cellules avec un microscope confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

Lymphocytes T CD8 sont des acteurs clés dans la lutte contre le cancer. Afin que les cellules T CD8 de tuer les cellules tumorales dont ils ont besoin pour entrer dans la tumeur, migrent dans le microenvironnement tumoral et répondre adéquatement aux antigènes de la tumeur. Le récent développement des approches d’imagerie améliorées, telles que la microscopie 2 photons et l’utilisation de modèles de tumeur de souris puissante ont fait la lumière sur certains des mécanismes qui régulent les activités anti-tumorales des lymphocytes T. Considérant que ces systèmes ont fourni des indications précieuses, ils ne prédisent pas toujours la réponse humaine. Chez l’homme, nos connaissances dans le domaine provient principalement de la description d’échantillons de tumeur fixe de patients humains, ainsi que des études in vitro . Cependant, des modèles in vitro n’ont pas le milieu de la tumeur tridimensionnelles complexes et sont donc des approximations incomplètes de in vivo activités de lymphocytes T. Des tranches fraîches faites de tissus explantés constituent un environnement de tumeur multicellulaire complexe qui peut agir comme un lien important entre conjointement des études et des modèles animaux. Initialement mis en place dans les ganglions murins1 et précédemment décrit dans un article de JoVE2, cette approche a maintenant été transposée aux tumeurs humaines pour examiner la dynamique de fois plaqué3 ainsi que de cellules résidentes T4.
Est décrit ici, un protocole pour la préparation de tranches de tumeur du poumon humain, immunomarquage des cellules T CD8 et tumeur résident et le suivi des lymphocytes T CD8 dans le microenvironnement tumoral par microscopie confocale. Ce système est particulièrement bien placé pour dépister les agents de l’immunothérapie roman favorisant la migration de cellules T dans les tumeurs.

Les tumeurs du poumon humain sont habituellement fortement infiltrés dans les cellules T CD8 qui sont préférentiellement localisés dans le stroma3,4. En suivant ce protocole, on devrait s’attendre à visualiser un grand nombre d’immunomarquage T CD8 dans des tranches de tumeur du poumon humain. Un co marquage avec des anticorps anti-EpCAM et anti-CD90 devrait permettre de délimiter les îlots de la tumeur et les zones stromales. Collagène fibrillaire, abondant dans le stroma tumoral, peut être visualisée sans coloration exogène à l’aide de deuxième génération harmonique sur un microscope biphotonique3,4. Notez que certaines tumeurs pulmonaires humaines n’actuellement aucune distinction claire entre les îlots de la tumeur et le stroma. Ces tumeurs doivent être jetés ainsi que les spécimens présentant de grandes zones de nécrose des cellules identifiées par des anticorps non-spécifiques et coloration DAPI. Conforme aux résultats obtenus dans le poumon humain et carcinomes ovariens, les cellules T CD8 résidents sont davantage concentrées dans le stroma par rapport à la tumeur îlots4. Un exemple représentatif de la distribution de cellules T CD8 en ce qui concerne les cellules tumorales et CD90 est illustré à la Figure 2.
Le dosage de la tranche permet l’analyse de la motilité résident des lymphocytes T dans les régions de différentes tumeurs. Des critères utiles pour la comparaison de la motilité cellulaire T CD8 dans différentes régions comprennent la vitesse moyenne (longueur du trajet divisée par la durée de temps échantillonnée) et la longueur de déplacement (le vecteur entre le début et la fin d’une piste). Bien que rare dans les îlots de la tumeur, les cellules T CD8 migrent plus activement dans ce compartiment comparé à du stroma (Figure 3). En moyenne, la vitesse moyenne des cellules T CD8 individuelles devrait être proche de 4 µm/min dans le stroma tumoral avec high intra et inter-tumeur variabilités4. Dans le stroma tumoral, la motilité des cellules de T résidents est fortement influencée par la densité et l’orientation des fibres de la matrice extracellulaire3,4. Une expérience réussie se traduira par moins cellules T présentes dans les régions de matrice dense comparées aux régions de matrice lâche, cohérentes avec les résultats publiés3,4.
Notez que certaines tumeurs pulmonaires humaines présentent un très haut niveau d’autofluorescence excluant l’imagerie de cellules de T résidents. Cette fonctionnalité est rapidement observée au début de la séance d’imagerie. Auto-fluorescente tumeurs doivent être jetés. Un exemple représentatif des cellules de T de CD8 résidents dans une tumeur auto-fluorescente est illustré à la Figure 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figure 1 : photos du système de perfusion. A) la solution RPMI sans rouge de phénol est enrichie à 5 % C02, 95 % O2. B) la solution est ensuite perfusée par une pompe péristaltique. C) la solution RPMI pénètre dans la boîte de Petri via l’entrée. À la sortie, la solution est aspirée par la pompe de la chambre dans un conteneur à déchets. Notez que l’embout d’aspiration est fixé à un niveau à déterminer la hauteur de la solution. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figure 2 : répartition des lymphocytes T CD8 résident des cellules dans une tumeur du poumon humain. Une image représentative d’une tranche de tumeur du poumon humain colorées pour CD8 (vert), EpCAM (bleu) et CD90 (rouge). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figure 3 : motilité des lymphocytes T CD8 résident des cellules dans une tumeur du poumon humain. Trajectoires de cellules T CD8 résidents dans le stroma (rouge) et régions de la tumeur cellulaire (bleu) d’une tranche de carcinome du poumon humain. La tranche a été colorée avec les anticorps indiquées et imagée pendant 20 min avec un microscope confocal. Le collagène fibrillaire a été détecté à la fin en utilisant la deuxième génération d’harmoniques (SHG) sur un microscope biphotonique. Les titres sont à codes de couleur selon la longueur de déplacement des cellules T CD8. Cette image a été modifiée par 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figure 4 : image représentative d’une tumeur du poumon humain auto-fluorescente. La tranche de la tumeur était tachée de CD8 (vert) et EpCAM (bleue). Le signal de la SHG est en rouge. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ce protocole décrit une méthode pour image résident-infiltration tumorale T CD8 cellules marquées avec des anticorps fluorescent couplés au sein de tranches de tumeur du poumon humain. Cette technique permet des analyses en temps réel de la migration des cellules T CD8 par microscopie confocale.

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

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