Name: ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy at JoVE.com

Wir möchten mit Mikroskopen Pierre Bourdoncle und Thomas Guilbert der Cochin Imaging Anlage (Institut Cochin, Paris) für Beratung und Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus der französischen Ligue Nationale Contre le Cancer, von der CARPEM (Cancer Research für personalisierte Medizin), durch die Fondation de France und Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm der Europäischen Union unter Grant unterstützt Übereinkommen Nr. 667980 (Karat).

Menschliche Tumoren wurden mit Zustimmung der französischen Ethik-Ausschuß und von der Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) in Anwendung der Artikel L.1121-1 des französischen Gesetzes erhalten. Die Patienten vor Aufnahme in die Studie war eine schriftliche Einwilligung eingeholt.
1. Erhalt menschlichen Lungentumoren
<ol>
	<li>Erhalten Sie frische Lunge Tumorproben von Patienten mit Stadium-III nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die eine komplette chirurgische Resektion von ihrer Lunge Tumoren4unterzogen.</li>
	<li>Die nicht fixierten frische Tumor in 15 mL konische Röhrchen mit eiskalten Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) Medium zu transportieren. Legen Sie beiseite für 30 min auf Eis bis Schritt 2.7. Hinweis: Wenn Tumoren am Nachmittag empfangen werden, legen Sie sie bei 4 ° C über Nacht und am nächsten Tag verarbeiten. In diesem Fall ergänzen Sie das RPMI-1640 Medium mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS).</li>
</ol>
(2) Agarose einbetten und Vibratome Schneiden von menschlichen Lungentumoren
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bis 2.10 unter sterilen Bedingungen.
<ol>
	<li>Bereiten Sie 5 % Agarose-Lösung für die Einbettung von 1 g niedrigschmelzende Punkt Agarose in 20 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium auflösen. Diese Lösung Mikrowelle, bis die Agarose komplett aufgelöst ist. Die Agarose bei 37 ° C abkühlen lassen, indem man die Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C für 5 min zu ermöglichen.</li>
	<li>Bereiten Sie in einer Gewebekultur-Haube komplette RPMI-1640 Medium (ohne Phenol-rot) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 4 mM L-Glutamin und 1 x Penicillin und Streptomycin.</li>
	<li>Ein 6-Well Zellplatte Kultur 1,1 mL komplette RPMI-1640 Medium pro Bohrloch hinzu, und legen Sie einen 30 mm Zelle Kultur Einsatz in jede Vertiefung. Beiseite der Plattenrandes in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min bis Schritt 2.12.</li>
	<li>Ort sterilisiert Edelstahl Unterlegscheiben (Innendurchmesser von 5 mm, außen ø 10 mm und 1 mm Dicke) in einer 35-mm-Plastikschale mit kompletten RPMI Medium gefüllt. Unterlegscheiben werden weiter verwendet werden, die Antikörper auf der Vibratome geschnittene Scheibe zu konzentrieren.</li>
	<li>Die Tumor-Biopsie in einer Plastikschale 10 cm und kleiner Würfel Form Fragmente von etwa 5 x 5 mm Länge geschnitten Sie den Tumor mit einer scharfen Klinge.</li>
	<li>Nehmen Sie die Agarose aus dem Inkubator und gießen Sie die Lösung in einer 35-mm-Plastikschale.</li>
	<li>Verwenden Sie ein paar Zangen übertragen sorgfältig die Tumor-Fragmente auf ein Gewebe zu wischen, die Überschreitung des Mediums zu entfernen. Einfügen Sie die Fragmente in der Agarose und positionieren Sie sie am unteren Rand der Plastikschale. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu festigen.</li>
	<li>Sobald die Agarose erstarrt, invertieren Sie die Plastikschale und mit einem Spatel, das gesamte Gel freizugeben.</li>
	<li>Verwenden Sie ein scharfes Messer, schneiden Sie die überschüssige Agarose rund um den Tumor Fragment, ca. 3-5 mm Gel um das Gewebe zu verlassen.</li>
	<li>Montieren Sie jeder Agarose-Block auf die Probe-Scheibe aus der Vibratome mit einem Tropfen ungiftig Butyl Cyanacrylat Gewebekleber. Füllen Sie das Vibratome Puffer Fach mit sterilen eiskaltem PBS und installieren Sie der Probe-Festplatte, in das Fach.</li>
	<li>Schnitt der Agarose eingebettet Gewebe in 350 µm dicke Scheiben schneiden. Passen Sie die Einstellungen der Vibratome mit einer langsamen Bereich Geschwindigkeit (0,2-0,3 mm/s) und die Schwingfrequenz im mittleren Bereich (1,5 mm).</li>
	<li>Sammeln Sie mit feinen Pinzette, sorgfältig die Tumoren Scheiben, wie sie gekürzt werden und Sie sie flach auf die Zelle Kultur Einsätze von einer 6-Well-Platte (Schritt 2.3 legen). 1 Scheibe bei jeder Einfügung zu übertragen. Verwenden Sie großen Sorgfalt beim Umgang mit Scheiben wie sie leicht beschädigt werden können.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Pinzette, um Edelstahl Unterlegscheiben auf jede einzelne Scheibe zu platzieren. Sicherstellen Sie, dass die Scheiben auf die Agarose rund um das Tumorgewebe gut positioniert sind.</li>
	<li>Pflegen Sie die Kultur-Platte bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator für 10 min. weiter Immunostaining.</li>
</ol>
(3) Immunostaining resident CD8 T-Zellen und Tumorzellen
<ol>
	<li>Verdünnen Sie die Antikörper (Endkonzentration 10 µg/mL) und der nuklearen Farbstoff (Endkonzentration 1 µg/mL) in RPMI-1640 Medien ohne Phenol rot. Hinweis: Verwenden Sie Fluoreszent-gekoppelte Anti-CD8 (murine IgG Klonen SK1) und Anti-EpCAM (Epithelzelle Adhäsionsmolekül) (murine IgG HEA-125) Antikörper CD8 T-Lymphozyten und Tumor epithelialer Zellen bzw. beschriften. Fluoreszent-gekoppelte Anti-CD90/Thy1 (murine IgG, Klon 5E10) Antikörper zu Label Fibroblasten und aktivierten Endothelzellen zu verwenden. Verwenden Sie 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) um den Kern der Zellen mit einem kompromittierten Plasmamembran zu beschriften, um Gewebe Lebensfähigkeit zu bewerten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kultur-Platten aus dem Inkubator und mit einer Pipette aspirieren Sie keine Flüssigkeit in die Edelstahl-Unterlegscheiben. Entfernen Sie nicht die 1,1 mL RPMI-1640-Medien unter der Zelle Kultur Einsätze (Schritt 2.3) gestellt.</li>
	<li>Ohne die Scheibe zu berühren und mit einer Pipettenspitze, fügen Sie 40 µL der Lösung, die Antikörper auf jeder Tumor Scheibe enthält hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 15 min um Antikörper Färbung zu ermöglichen.</li>
	<li>Entfernen Sie mit feinen Pinzette die Unterlegscheiben, die Scheiben und Tauchen Sie 10 s in RPMI-1640 Medien ohne Phenol rot herausnehmen. Legen Sie die Scheiben auf die Zelle Kultur Einsätze zurück und geben Sie einen Tropfen von Phenol Rotfrei RPMI-1640 mittlere auf jede einzelne Scheibe. Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C für 10 Minuten weiter zu Bildgebung.</li>
</ol>
(4) imaging und Analyse von resident CD8 T Zelle Migration innerhalb der menschlichen Lunge Tumor Scheiben
Hinweis: Die confocal Mikroskop verwendet in diesem Protokoll ist eine aufrechte, spinning-Disk mit einer 25 x Wasser eintauchen Ziel ausgestattet (25 x / 0,95 N.A).
<ol>
	<li>Mikroskop-Installation vorbereiten<ol>
		<li>Stellen Sie die Temperatur des Mikroskop-Wärmekammer bei 37 ° C ein paar Stunden vor Beginn der bildgebenden anzupassen.</li>
		<li>Einrichtung eines Systems zur Tumor-Scheiben mit ständig durchspülen Sauerstoff (5 % CO2, 95 % O2) Phenol Rotfrei RPMI Medium (Abbildung 1). Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe die Perfusion Medien in der bildgebenden Kammer fließen und aspirieren Sie die Lösung in eine Müllabfuhr-Kolben.</li>
		<li>Führen Sie die peristaltische Pumpe, damit die oxydierten Lösung durch die Perfusion Röhren gehen kann.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette die Scheibe vom 6-Well-Platte und Transfer zu den 35-mm-Plastikschale mit Phenol Rotfrei RPMI Medium gefüllt. Die Scheibe mit einem 19,7 mm Durchmesser Scheibe Anker mit 2 mm Abstand-Threads zu immobilisieren. Platzieren Sie die Petrischale auf der bildgebenden Bühne des Mikroskops. Schließen Sie die Einlass und Auslass Spitzen der Perfusion System. Perfusion einschalten und den Durchfluss von Medien auf 0,8 mL/min eingestellt.</li>
	<li>Das Eintauchen in Wasser Ziel, die Scheibe zu senken. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Scheibe mit Hellfeld Licht.</li></ol>Verwenden geeignetes fluoreszierendes Licht, wählen Sie eine Region von Interesse, die CD8 T-Zellen, Tumor Inselchen (positiv für EpCAM) und einem Stroma-Bereich (positiv für CD90) enthält. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Scheibe durch die Bewertung DAPI Färbung an der Schnittfläche und tiefer in das Gewebe. Hinweis: Ein gesundes Stück enthält nur eine Minderheit der DAPI positive Zellen in mehreren Mikrometern aus der Schnittfläche.
	<li>Legen Sie eine bildgebende Sitzung mit den folgenden Aktionen.<ol>
		<li>Abhängig von der Intensität der das Fluoreszenzsignal 3 Fluorophore legen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 bis 800 ms und die Laserstärke zwischen 20 bis 40 %.</li>
		<li>Wählen Sie die Z-Stack-Stärke Bild innerhalb der Tumor-Slice. Hinweis: Hier wurden 10-12 optische Flugzeuge überspannt eine Gesamttiefe von 60-70 µm in der Z-Dimension erfasst.</li>
		<li>Wählen Sie die Startposition bei ca. 10 µm unterhalb der ersten beschrifteten CD8 T-Zellen.</li>
		<li>Definiert das Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapel Bilder zwischen 10 bis 30 s und die Gesamtaufnahmezeit zwischen 10 bis 30 Minuten.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysieren Sie resident CD8 T Zellwanderung, wie in Referenz4beschrieben.<ol>
		<li>Nach dem Import der Daten in eine Tracking-Software Erstellen Sie Spots für jede CD8 T-Zelle im Feld. Passen Sie der Durchmesser der Zellen und die Schwelle der Erkennung auf die abgebildeten fluoreszierenden Zellen entsprechend an.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Tracks und entfernen Sie irrelevant Spuren zu, indem Sie sie löschen. Richtigen Tracks von anschließen und trennen verschiedene Tracks und verschiedenen Zeitpunkten der gleichen Tracks. Exportieren Sie die Daten (Track Geschwindigkeit, Streckenlänge Verschiebung) in ein Tabellenkalkulationsprogramm.</li>
	</ol>
	</li>

<ol>
	<li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner.">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes.">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054 (2011).</li><li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors.">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li><li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration.">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500 (2015).</li><li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+Oncology+Meets+Immunology:+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy.">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li><li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma.">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li><li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li><li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+immune+responses.">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li><li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exclusion,+immune+privilege,+and+the+tumor+microenvironment.">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li><li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma:+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance.">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li><li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models.">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Eine einfache, schnelle und robuste Technik für die Erzeugung von menschlichen Lunge Tumor Scheiben und Bewertung des dynamischen Verhaltens von resident CD8 T-Zellen in einer erhaltenen Tumor-Umgebung mit einem konfokalen Mikroskop wird beschrieben. Dieses Protokoll ist eine Verfeinerung von einem früheren Jupiter-Artikel, der beschreibt, die Überwachung der vergoldeten T-Zellen auf murinen Lymphknoten Scheiben2.
Bleichen von Fluoreszenzfarbstoffen muss vor allem mit der ersten Generation Farbstoffe wie Fluorescein erfolgt und Phycoerythrin berücksichtigt werden. Wir fanden, dass eine ausgeprägte Immunofluoreszenz von Antikörpern direkt gekoppelt mit einem zwei-Photonen-Mikroskop aufgetreten. Dagegen fiel auf minimale Immunofluoreszenz mit konfokalen Mikroskopen, vor allem mit hell fluoreszierende Farbstoffe, die vor kurzem entwickelt.
Antikörper sind relativ große Moleküle und deren Eindringen in das Gewebe kann daher schwierig sein. Dieser Schritt kann verbessert werden, indem man die Inkubationszeit. Darüber hinaus Färbung die Verwendung einer kleinere Reagenzien wie direkt gekoppelt Fab Fragmente von Antikörper stellt eine gute Alternative.
Alle Antikörper, die in diesem Protokoll beschrieben wurden zuvor validiert und bekannt, um helle Färbung4produzieren. Isotype Kontrollen sind daher nicht erforderlich. Jedoch wenn Änderungen an dieser Methode mit anderen Antikörpern gewünscht werden, ist dann die Verwendung der Isotype Kontrolle Antikörper sehr empfehlenswert.
Dieses experimentelle System stellt einige Einschränkungen. Der Schneidvorgang schädigt das Gewebe, das das Verhalten von CD8 T-Zellen, besonders in der Nähe der Schnittfläche beeinflussen können. Darüber hinaus kann eine Reihe von löslichen Faktoren (z.B. Chemokine) maßgeblich an der Steuerung der Migration der T-Zellen verloren. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu umgehen ist durch die Überwachung der T-Zellen befindet sich in mehreren Dutzend Mikrometer von der Oberfläche in vermutlich gesünder Regionen des Gewebes. Veröffentlichten Experimente zeigen, dass T-Zellen, die tief in das Gewebe lokalisiert aktiver als T-Zellen lokalisiert in der Nähe der geschliffenen Oberfläche4migrieren. Wir haben für unsere Studien konfokale Mikroskope verwendet, aber es ist wahrscheinlich, dass zwei-Photonen-Mikroskop wird die räumliche Auflösung in der Tiefe zu erhöhen.
Dieser Ansatz beruht auf der Verwendung von Eindringmittel-gekoppelten Antikörper, die nicht neutrale Moleküle sind. Full-Size-Antikörper sind anfällig für das normale Funktionieren der T-Zellen in unterschiedlicher Weise beeinflussen. Erstens können Antikörper Anti-CD8 T Zellwanderung durch Auslösung eine intrazelluläre Signalkaskade, die möglichen Auswirkungen auf das Zytoskelett der Lymphozyten verändern. Zweitens können Antikörper Anti-CD8 modulieren die Interaktion zwischen CD8 und MHC Klasse I Moleküle, ein wichtiger Schritt in der Antigen-Erkennung. Dritte, intakte Antikörper können an ausgedrückt durch viele myeloische Zellen im Tumor verteilt und daher anfällig für Fc-Rezeptoren binden, um unspezifische Signal zu erhöhen. Wir haben keinen Hinweis darauf, dass solch ein Problem unserer Daten beeinträchtigt wahrscheinlich weil Fc-Rezeptoren der ansässigen myeloische Zellen im Gegensatz zu Zellen in Kultur, mit Immunglobulinen in der Tumor-Milieu gesättigt sind. In der Tat, die Zugabe von Serum während der Kennzeichnung Verfahren, ein Verfahren bekannt, kostenlose Fc-Rezeptoren blockieren die Immuno-Färbung änderte sich nicht. Dennoch, Fab-Fragmente von Antikörpern, frei von Fc-Region sowie Antikörper mutiert in ihrer Fc-Region und Kameliden abgeleitet Antikörper Fragmente8 vertreten andere Alternativen Strategien, residente Zellen mit fluoreszierenden Tracer zu verfolgen.
In den letzten Jahrzehnten mehrere Modellsysteme entwickelt und verwendet für die Echtzeit-Darstellung der T-Lymphozyten. Dazu gehören in-vitro- Vorbereitungen von T Zellen zuvor gereinigten und kultivierten mit Antigen-präsentierenden Zellen. Solche Präparate haben bemerkenswerte Fortschritte bei der Festlegung der Mechanismen der Antigen-Anerkennung und Reaktionsfähigkeit erlaubt. Jedoch fehlt ihnen die Komplexität der Gewebe-Umgebung. Andere Präparate haben festgestellt, dass mehr genau die Struktur eines nativen Gewebes imitieren. Zum Beispiel haben dreidimensionale Kollagen Gel Matrizen in die gereinigten T-Zellen, sowie Kultur des reaggregated Gewebes eingebettet, die Fragmente verwendet wurden, um das dynamische Verhalten von T-Lymphozyten mit fluoreszierenden Bildgebungstechnologien9 überwachen . Diese Systeme präsentieren den Vorteil einer Architektur in der Nähe der Heimat Gewebe, aber ihnen fehlen wichtigen zellulären und löslichen Faktoren. Maus beschäftigt intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie, T-Zellen in der wirklich physiologische Umwelt intakt Orgel10zu verfolgen. Dieser Ansatz ist jedoch technisch schwierig einzurichten. Darüber hinaus zeigen Mausmodellen bemerkenswerte Unterschiede mit der menschlichen Physiologie.
In diesem Protokoll beschriebene Technik stellt eine komplexe mehrzellige Tumor-Umgebung, die hervorragend positioniert ist, um als wichtiges Bindeglied zwischen Co Kulturwissenschaften und Tiermodellen zu handeln.
Die hierin beschriebene Protokoll kann auch verwendet werden, für die Verfolgung der Motilität von anderen Zellen als CD8 T-Lymphozyten, die Antikörper generiert wurden. Darüber hinaus kann die Technik auf andere menschliche und murinen Tumoren und Gewebe angepasst werden. Zum Beispiel konnten wir zum Bild in Echtzeit die Dynamik der B-Zellen mit der Bezeichnung mit einem Anti-CD19-Antikörper in frischem menschlichen Tonsillen.
In diesem Protokoll beschriebene Technik ermöglicht Bildschirm für therapeutische Moleküle Steuern T Zelle Motilität in Geweben. Die Zugänglichkeit von Kultursystem erlaubt es, gelten einige pharmakologischen Reagenzien und ihre Auswirkungen auf die Migration der T-Zellen zu testen. Es ist inzwischen anerkannt, dass bei wachsenden Tumoren, CD8 T-Zellen eine geringe Migration weisen und Kontakte mit Tumor Zellen11reduziert. Wichtig ist, die schwache Präsenz von T-Zellen im Tumor Zelle Regionen ist ein schlechtes Ergebnis zugeordnet und gilt als einer der die Resistenzmechanismen, T-Zell-basierte Krebsimmuntherapie. Mehrere Hindernisse, die Begrenzung der T-Zellen von Migration in Tumoren sind einschließlich einer dichten extrazellulären Matrix identifiziert worden. In dieser Hinsicht ist die Identifizierung von Molekülen T Zelle Motilität und Interaktion mit malignen Zellen wiederherstellen ein wichtiger Schritt im Krebsimmuntherapie. In einer früheren Studie fanden wir, dass ein Teilabbau des Kollagens mit Kollagenase, akut auf menschlichen Lunge Scheiben angewendet den Kontakt der T-Zellen mit Tumorzellen verbessert.
Schließlich bietet die Möglichkeit, menschliche Tumor Scheiben in Kultur für bis zu mehreren Tagen7,12,13 zu halten eine Reihe von vielversprechenden Anwendungen in Bezug auf T-Zellen und Immuntherapie.Allerdings ist die Stabilität des Modellsystems während langfristige Kultur ein wichtiger Parameter, der gründlich geprüft werden.
Frisches und gesundes Gewebe zu erhalten, ist ein kritischer Faktor Qualität Scheiben mit guter Immunostaining CD8-Zellen, Tumorzellen und Stromazellen Elemente zu produzieren. Halten die Tumor-Biopsie bei 4 ° C vor der Verarbeitung ist entscheidend.
Die Handhabung der Scheiben mit einer feinen Pinzette stellt einen weiteren wichtigen Schritt innerhalb dieses Protokolls. Dies sollte mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, da die Agarose leicht beschädigt werden kann. Ein Schnitt in der Agarose beeinträchtigt die Dichtung gemacht durch die Edelstahl Scheibe, was zu einer Leckage des Antikörpers mit Lösungen.

CD8 T-Zellen spielen eine Schlüsselrolle im Kampf gegen den Krebs. Jedoch verhindern, dass viele unterdrückerische Mechanismen T-Lymphozyten maligne Zellen zu töten. In den letzten Jahren wurden mehrere erfolgversprechende Strategien, die lösen der Bremse auf T-Zellen entwickelt und in der Klinik5verwendet. Die beiden Ansätze, die beträchtliche Aufmerksamkeit zu behalten sind immun Checkpoint-targeting Antikörper, wie z. B. Anti-PD-1 und Adoptiv-T-Zell-Therapien. Dennoch, trotz der jüngsten Erfolge nur eine Teilmenge der Patienten profitieren von dieser Therapien6. Eine große Herausforderung ist es, die Mechanismen der Resistenz gegen Krebsimmuntherapie zu identifizieren, um eine effizientere Behandlungen zu entwickeln. Eine weitere Herausforderung ist, Modellsysteme zu entwickeln, in welchen, die Roman Therapien charakterisiert und auf ihre Wirksamkeit und Sicherheit geprüft. So weit, die meisten dieser Tests in Vitro Zellkultursysteme basieren, die die Komplexität des Tumorgewebes schlecht imitieren.
Ex-Vivo Gewebe Scheiben ist eine vielversprechende Technik, wie es das ursprüngliche Gewebe Mikroumgebung7bewahrt. Im Laufe der Jahre haben wir diesen Ansatz eingerichtet, um die Dynamik von T-Lymphozyten in verschiedenen Geweben zu verfolgen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Eindringmittel beschriftete T-Zellen hinzugefügt auf murinen Lymphknoten Scheiben in das Gewebe Wandern und auf ihre entsprechenden microenvironmental Hinweise1,2 reagieren. T-Lymphozyten auf menschlichen Lunge Tumor Scheiben überlagert werden ebenso schnell in die Tumor-Stroma-3rekrutiert. Mit dieser Technik haben wir die extrazelluläre Matrix als ein wichtiges Element bei der Steuerung der Verteilung und Migration der T-Zellen innerhalb von menschlichen Tumoren3,4identifiziert. Da das Verhalten des ex Vivo gereinigt und vergoldete T-Zellen nicht unbedingt das Verhalten der Bewohner intratumorale T-Lymphozyten, haben wir vor kurzem dieser Ansatz4verfeinert.
Hier beschreiben wir ein Protokoll um wohnhaft T-Lymphozyten in Scheiben, hergestellt aus frischen menschlichen Lungentumoren zu verfolgen. Die verschiedenen Schritte bestehen aus der Vorbereitung der menschlichen Lunge Tumor Scheiben (einschließlich Agarose einbetten und Vibratome Schneiden der eingebetteten Gewebe), die Färbung des endogenen T-Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern in frischen Tumor Scheiben und die Überwachung der Diese Zellen mit einem konfokalen Mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>The use of a spinning disk confocal is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm Culture inserts</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>61870010</td>
			<td>Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20012019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature Agarose, type VII-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B004K1FDGQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>328125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of resident cd8 t lymphocytes in human lung tumor slices using confocal microscopy

CD8 T-Zellen sind wichtige Akteure im Kampf gegen den Krebs. In Reihenfolge für CD8 T-Zellen, Tumorzellen zu töten, die sie benötigen, geben Sie in den Tumor Wandern Sie innerhalb der Tumor Mikroumgebung und reagieren Sie angemessen auf Tumorantigenen. Die jüngste Entwicklung von verbesserten bildgebenden Ansätzen, wie 2-Photonen-Mikroskopie, und die Verwendung von mächtige Maus Tumormodellen haben einige der Mechanismen zu beleuchten, die Anti-Tumor-T-Zell-Aktivitäten zu regulieren. Während solcher Systeme wertvolle Erkenntnisse zur Verfügung gestellt haben, sie nicht immer menschliche Reaktionen vorhersagen. Beim Menschen kommt unser Wissen auf dem Gebiet hauptsächlich aus einer Beschreibung des festen Tumorproben von menschlichen Patienten, sowie in-vitro- Studien. In-vitro- Modelle jedoch fehlt das komplexe dreidimensionale Tumor-Milieu und daher unvollständig Annäherungen von in Vivo sind T-Zell-Aktivitäten. Frische Scheiben aus explantierten Gewebe hergestellt repräsentieren eine komplexe mehrzellige Tumor-Umgebung, die als ein wichtiges Bindeglied zwischen Co kultivierten Studien und Tiermodellen dienen kann. Ursprünglich in murinen Lymphknoten1 einrichten und zuvor in einem Jupiter Artikel2beschrieben, ist dieser Ansatz nun zu menschlichen Tumoren zu prüfen, die Dynamik der vergoldete3 sowie resident T Zellen4umgesetzt worden.
Hier wird ein Protokoll für die Vorbereitung der menschlichen Lunge Tumor Scheiben, Immunostaining resident CD8 T und Tumor-Zellen und Verfolgung von CD8 T-Lymphozyten in der konfokalen Mikroskopie mit Tumor-Mikroumgebung beschrieben. Dieses System ist einzigartig aufgestellt, um Bildschirm für neuartige Immuntherapie Agenten T Zellwanderung in Tumoren begünstigt.

Menschliche Lungen-Tumoren sind in der Regel hoch in CD8 T-Zellen infiltriert, die bevorzugt im Stroma3,4gefunden werden. Anhand dieses Protokolls sollte man erwarten, eine große Anzahl von Immunostained CD8 T in menschlichen Lunge Tumor Scheiben zu visualisieren. Eine Co-Etikettierung mit Anti-EpCAM und Anti-CD90 Antikörper sollte ermöglichen, Tumor Inselchen und Stromazellen Bereiche abzugrenzen. Fibrillären Kollagen, reichlich in der Tumor-Stroma kann visualisiert werden, ohne exogene Färbung mit harmonischen der zweiten Generation auf einem zwei-Photonen-Mikroskop-3,-4. Beachten Sie, dass einige menschliche Lungen-Tumoren keine klare Unterscheidung zwischen Tumor Inselchen und Stroma präsentieren. Solche Tumoren entsorgen sowie Probe präsentieren große Bereiche der Zelle Nekrose durch unspezifische Bindung von Antikörpern und DAPI-Färbung identifiziert. Einklang mit veröffentlichten Ergebnisse sind in menschlichen Lungen- und Eierstockkrebs Karzinome residente CD8 T-Zellen in das Stroma Tumor Inselchen4gegenüber konzentrierter. Ein repräsentatives Beispiel für CD8 T Zelle Verteilung in Bezug auf Tumorzellen und CD90 ist in Abbildung 2dargestellt.
Der Slice-Test ermöglicht die Analyse der ansässigen T Zelle Motilität in verschiedenen Tumor Regionen. Nützliche Kriterien für den Vergleich von CD8 T Zelle Motilität in verschiedenen Regionen gehören die Durchschnittsgeschwindigkeit (Weglänge dividiert durch die Zeitdauer abgetastet) und die Verschiebung Länge (der Vektor zwischen Anfang und Ende eines Tracks). Obwohl knapp im Tumor Inselchen, migrieren CD8 T-Zellen mehr aktiv in diesem Fach im Vergleich zu der Stroma (Abbildung 3). Im Durchschnitt sollte die mittlere Geschwindigkeit der einzelnen CD8 T-Zellen in der Nähe von 4 µm/min in der Tumor-Stroma mit hoher Intra- und Inter Tumor Variabilitäten4sein. In der Tumor-Stroma ist die Motilität des ansässigen T-Zellen geprägt von der Dichte und Ausrichtung der extrazellulären Matrix Fasern3,4. Ein gelungenes Experiment führt zu weniger T-Zellen, die in dichten Matrix Bereichen im Vergleich zu losen Matrix Regionen, Einklang mit veröffentlichten Ergebnisse3,4.
Beachten Sie, dass einige menschliche Lungen-Tumoren zeigen ein sehr hohes Maß an Autofluoreszenz entgegensteht Bildgebung ansässige T-Zellen. Diese Funktion wird schnell zum Jahresbeginn die bildgebenden Sitzung beobachtet. Autofluorescent Tumoren sollten entsorgt werden. Ein repräsentatives Beispiel für ansässige CD8 T-Zellen in einem Autofluorescent Tumor ist in Abbildung 4dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Fotos von der Perfusion System. (A) die Phenol Rotfrei RPMI-Lösung wird in 5 % C02, 95 % O2bereichert. (B) die Lösung wird dann durch eine peristaltische Pumpe durchströmt. (C) die RPMI-Lösung gelangt der Kulturschale über den Einlass. Am Austritt wird die Lösung durch die Pumpe aus der Kammer in einen Abfallbehälter abgesaugt. Beachten Sie, dass die Aspiration Spitze auf eine Ebene festgelegt ist, um Lösung Höhe zu bestimmen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Verteilung der ansässigen CD8 T Zellen in einem menschlichen Lungentumor. Repräsentatives Bild einer menschlichen Lunge Tumor Scheibe gebeizt für CD8 (grün), EpCAM (blau) und CD90 (rot). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Motilität des resident CD8 T Zellen in einem menschlichen Lungentumor. Die Bahnen der einzelnen resident CD8 T-Zellen in den Stromazellen (rot) und Tumor Zelle (blau) Regionen einer menschlichen Lunge Karzinom Scheibe. Die Scheibe war befleckt mit dem angegebenen Antikörper und für 20 min mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Die fibrillary Kollagen wurde am Ende mit harmonischen der zweiten Generation (SHG) auf einem zwei-Photonen-Mikroskop erkannt. Spuren sind nach CD8 T Zelle Verschiebung Länge farblich gekennzeichnet. Dieses Bild wurde von 4geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Abbildung 4: repräsentatives Bild von einem Autofluorescent menschlichen Lungentumor. Das Tumor-Segment war für CD8 (grün) und EpCAM (blau) gefärbt. Die SHG-Signal ist rot markiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Bild resident Tumor infiltrieren CD8 T-Zellen beschriftet mit Gewebekulturen gekoppelten Antikörpern im menschlichen Lunge Tumor Scheiben. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Analysen von CD8 T Zelle Migration mit der konfokalen Mikroskopie.

Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

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